Cry1Ac抗、感棉铃虫碱性磷酸酯酶（ALP1）的表达量比较

【目的】通过比较Cry1Ac抗、感棉铃虫昆虫中肠碱性磷酸酶（ALP1）表达量的差异及抗性棉铃虫取食Cry1Ac蛋白对ALP1表达量的影响,分析ALP1表达量变化与抗性的关系,为进一步明确Bt抗性机制、制定抗性治理策略提供理论依据。【方法】利用实时荧光定量PCR技术,比较敏感棉铃虫、Cry1Ac抗性棉铃虫取食含Cry1Ac蛋白的饲料和正常饲料后ALP1表达量的差异。【结果】ALP1在棉铃虫整个发育期都表达,幼虫的表达量最高,蛹期表达量最低,在成虫体内也有较高的表达;ALP1在幼虫中肠表达量最高,其次是后肠、前肠、马氏管,表皮中的表达量最低;与敏感品系相比,对Cry1Ac具有中等水平抗性的棉铃虫ALP1表达量明显增加,尤其是取食含Cry1Ac蛋白饲料的抗性棉铃虫幼虫的ALP1的表达量显著升高,但抗性棉铃虫取食正常饲料后,2、3龄幼虫的ALP1的表达量与敏感棉铃虫差异不显著;所有的抗性品系4龄棉铃虫幼虫中肠ALP1的表达量都显著高于敏感品系,而且随着棉铃虫抗性倍数的升高,ALP1的表达量呈逐渐降低的趋势。【结论】抗性棉铃虫中肠ALP1表达量的改变可能与Cry1Ac抗性、Cry1Ac代谢有一定的关系。     

亚洲玉米螟miR-1a-5p表达与Cry1Ab蛋白敏感性的关系

【目的】探索亚洲玉米螟miR-1a-5p表达与Cry1Ab蛋白敏感性的关系,为揭示miRNA在昆虫Bt抗性产生过程中的作用提供依据。【方法】通过荧光定量PCR,研究亚洲玉米螟Cry1Ab抗性品系(ACB-AbR)和Bt敏感品系(ACB-BtS)表皮及中肠组织中miR-1a-5p的表达差异。以Sf9细胞为研究对象,通过转染miR-1a-5p促进剂(Mimics)或抑制剂(Inhibitor)改变细胞中miR-1a-5p的表达量,测定不同处理细胞对Cry1Ab蛋白的敏感性,探讨miR-1a-5p表达量改变后Sf9细胞对Cry1Ab蛋白的敏感性变化。通过荧光素酶报告试验,研究miR-1a-5p对潜在靶标基因Unigene12370_All的调控作用。【结果】ACB-AbR表皮组织中miR-1a-5p的表达量显著高于ACB-BtS表皮组织,ACB-AbR中肠组织中miR-1a-5p的表达量显著低于ACB-BtS中肠组织;ACB-AbR和ACB-BtS幼虫表皮组织中miR-1a-5p的表达量均显著高于其中肠组织。Sf9细胞miR-1a-5p表达量升高导致Sf9细胞对Cry1Ab蛋白的敏感性增强,反之亦然。荧光素酶报告试验结果提示,miR-1a-5p与靶标基因Unigene12370_All可以结合。【结论】亚洲玉米螟miR-1a-5p表达量的变化与其对Cry1Ab蛋白敏感性的改变有关。     

扁桃AcDHN1基因的克隆及原核表达分析

【目的】 克隆与分析扁桃脱水素基因,为研究脱水素基因在扁桃抗逆机制中发挥的功能提供参考。【方法】 以新疆栽培的扁桃品种‘纸皮’叶片为材料,通过PCR技术克隆扁桃AcDHN1基因并对该基因进行原核表达分析,构建原核表达载体,在大肠杆菌进行表达。【结果】 克隆得到了一个脱水素基因,命名为AcDHN1,GenBank登陆号为KT949395,该基因全长924 bp、编码308个氨基酸的多肽,为稳定的亲水性蛋白,属于Y₂K_n型脱水素,推测蛋白分子质量为32.4 kD,亚细胞定位于细胞核中。将该基因与原核表达载体连接构建重组质粒pET-AcDHN1,然后将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达。SDS-PAGE电泳结果表明,该蛋白分子量的大小约为52.7 kD,与预期长度一致。【结论】 对重组蛋白的诱导条件进行优化后结果显示,该基因在IPTG浓度0.1 mmol/L、诱导3 h表达量最佳。     

白背飞虱海藻糖合成酶基因调控几丁质合成的功能

【背景】 海藻糖合成酶（trehalose-6-phosphate synthase,TPS）在海藻糖合成中起着重要作用,其能够介导海藻糖代谢调控几丁质合成及昆虫发育。【目的】 本研究通过抑制白背飞虱（Sogatella furcifera）TPS的表达,检测RNAi沉默SfTPS效果,观察白背飞虱蜕皮状况,测定几丁质含量及几丁质合成酶（chitin synthase,CHS）基因的定量表达,探究SfTPS在白背飞虱几丁质合成中的潜在调控作用。【方法】 利用注射法RNAi技术,以实验室饲养多年的白背飞虱种群为试验材料,体外合成两个SfTPS（SfTPS1和SfTPS2）与GFP的双链RNA（dsRNA）后,分别注射到白背飞虱体内抑制TPS。首先,在dsRNA注射后48 h采用Trizol法提取白背飞虱的总RNA,反转录并合成第一链DNA后,采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术检测TPS表达沉默情况,以确定RNAi的效果;其次,测定dsRNA注射后48 h和72 h白背飞虱整体几丁质含量并对翅发育畸形虫体进行拍照;最后,采用qRT-PCR技术检测白背飞虱SfCHS在mRNA水平上的相对表达量变化,分析SfTPS1和SfTPS2在几丁质合成调控中的作用。【结果】 与注射dsGFP相比较,dsSfTPS1和dsSfTPS2的RNA注射后,能够促进SfCHS表达量上升,几丁质含量增加,白背飞虱成虫翅出现畸形。qRT-PCR结果显示,单个SfTPS dsRNA注射后本基因的表达能够被极显著抑制,与注射dsGFP相比,不足对照组表达量的30%,且单个SfTPS的dsRNA注射后,另外一个SfTPS表达同样显著下降;dsSfTPS1和dsSfTPS2注射后,白背飞虱成虫翅均为长翅,出现一定比例的翅卷曲等畸形情况,其后48 h和72 h产生一定的死亡率;几丁质含量检测发现,SfTPS1和SfTPS2的dsRNA注射后72 h,几丁质含量显著上升。与注射dsGFP对照组相比较,SfCHS1与SfCHS1a表达量在dsSfTPS1注射后72 h极显著上升,在dsSfTPS2注射后48 h和72 h时极显著上升,且dsSfTPS1和dsSfTPS2注射后SfCHS1b的表达极显著增加。【结论】 SfTPS能够通过调控白背飞虱几丁质合成酶基因的表达来控制几丁质的合成,研究结果有助于评价SfTPS在白背飞虱等昆虫中的调控作用并作为潜在控害靶标,为进一步开展和筛选有效的海藻糖合成酶抑制剂控制白背飞虱等害虫提供理论依据。     

马铃薯甲虫LdATPaseE调控幼虫蜕皮的分子机制

【目的】研究LdATPaseE通过类胰岛素信号通路影响保幼激素和蜕皮激素通路,调节马铃薯甲虫幼虫化蛹的分子机制。【方法】LdATPaseE cDNA序列通过马铃薯甲虫转录组数据分析和RT-PCR克隆获得;qPCR检测其在马铃薯甲虫各发育阶段,以及四龄幼虫不同组织的相对表达量;采用喂食幼虫dsRNA的方法,分析该基因在马铃薯甲虫幼虫的生长发育过程中的影响,并测定类胰岛素、保幼激素和蜕皮激素通路基因对该基因的表达响应机制。【结果】喂食二龄幼虫dsLdATPaseE后,成功敲低了靶标基因,阻止二龄幼虫的生长,显著增加了二龄幼虫的死亡率。三龄和四龄幼虫喂食dsLdATPaseE-1和dsLdATPaseE-2,在极低浓度下即敲低了靶标基因,阻止了幼虫生长,显著降低马铃薯甲虫幼虫的化蛹率。敲低LdATPaseE还显著升高了LdInR与Ld4EBP的表达量,抑制一个蜕皮激素合成基因的转录,降低20E滴度并降低了一个20E响应基因的表达。敲低LdATPaseE还抑制了一个JH合成酶基因的表达,降低了JH滴度,下调了一个JH早期响应基因的表达量。【结论】沉默LdATPaseE后,其可能通过抑制IIS信号途径,降低20E和JH的滴度、下调20E和JH信号从而影响幼虫生长和发育。     

转Gbve1基因棉对棉田动物群落结构及稳定性影响

【目的】 以亲本棉为对照,研究5组转Gbve1基因棉花株系对棉田生物群落分布以及环境的影响。【方法】 以棉花3叶期为起始日期,采用随机调查法,查看整株棉花所有器官,记录棉株上所见节肢动物的种类及数量。【结果】 转Gbve1基因棉田主要害虫的相对多度除朱砂叶螨、烟粉虱和棉叶蝉 与对照棉田间有显著差异外,其余主要害虫均无显著差异(P>0.05)。不同品系棉田中刺吸式害虫和咀嚼式害虫之间均无显著差异(P>0.05);而转Gbve1基因棉田中物种多样性指数、均匀度指数和优势集中性指数与对照相比均差异不显著(P>0.05);且转基因棉田与对照棉田节肢动物群落存在较高的相似性(0.681 4 ~ 0.820 9)。【结论】 不同品系棉田中主要昆虫群落消长动态显示,除个别品系在个别生育时期、个别昆虫之间存在显著差异,其余与对照相比消长动态均无显著差异,表明转抗黄萎病基因棉花并不影响棉田动物群落的结构和稳定性。     

陆地棉细胞色素P450超家族基因GhCYP85A2-1的克隆与功能分析

【目的】研究细胞色素P450超家族CYP85A亚家族基因在棉花株高发育中的生物学功能,为陆地棉株高分子育种提供理论依据和基因资源。【方法】 采用同源克隆方法,从陆地棉中克隆CYP85A家族基因GhCYP85A2-1,利用烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus, TRV)诱导的基因沉默技术(Virus-induced gene silencing, VIGS)构建GhCYP85A2-1基因沉默载体,利用qRT-PCR技术检测侵染棉花幼苗的基因表达量。【结果】 GhCYP85A2-1基因沉默植株的株高显著降低,基因的表达量也显著下降。【结论】 GhCYP85A2-1基因在棉花株高发育过程中起到重要调控作用。     

盐胁迫下盐穗木miR393b与预测靶基因HcTIR1的表达及相关性

【目的】研究盐胁迫下盐穗木生长素通路中miR393b和预测的靶基因TIR1的表达模式和相关性。【方法】采用生物信息学方法预测盐穗木miR393b的靶基因;通过qRT-PCR方法检测盐胁迫下盐穗木miR393b及预测靶基因HcTIR1(transport inhibitor response1)的相对表达模式,并分析其相关性。【结果】miR393b成熟体在不同植物种中高度保守;盐穗木miR393b预测的靶基因为TIR1;盐胁迫处理,盐穗木同化枝中两基因响应高盐胁迫,并具有一定的负相关性。【结论】盐穗木miR393b和预测的靶基因响应高盐胁迫,二者具有一定的负相关。该结果为进一步探讨盐穗木miR393b与预测靶基因TIR1的生物学功能奠定基础。     

基于三级营养传递Cry1Ac蛋白对普通草蛉酶活力及生长发育的影响

【目的】研究Cry1Ac蛋白通过棉花、棉蚜的传递对普通草蛉酶活性及生长发育的影响,为转Bt基因棉花的安全性评价提供参考和依据。【方法】采用ELISA方法,检测Bt棉、取食Bt棉的棉蚜和捕食棉蚜普通草蛉体内Bt杀虫蛋白含量;通过酶活力测定普通草蛉幼虫取食Bt棉花上棉蚜后其体内的类胰蛋白酶、类胰凝乳蛋白酶和氨肽酶的酶活性;室内生物测定普通草蛉取食Bt棉花上的棉蚜后对其生长发育的影响。【结果】Cry1Ac杀虫蛋白在棉叶中的表达量为788.76 ng/g,远高于棉蚜体内的2.35 ng/g,取食Bt棉花上棉蚜的普通草蛉3龄幼虫体内并未检测到Bt杀虫蛋白;通过三级营养传递的Cry1Ac蛋白对普通草蛉酶活力影响甚微。【结论】棉蚜取食Bt棉花后体内仅能累计微量Cry1Ac蛋白;普通草蛉取食Bt棉花上的棉蚜后,对其体内三种酶活性和生长发育均没有负面影响。     

棉铃虫中肠Cry1A受体蛋白氨肽酶N1在Tn细胞系的表达

 【目的】将棉铃虫中肠Bt受体蛋白在真核表达系统中成功表达。【方法】用PCR方法分别扩增出对Cry1Ac毒素敏感和抗性棉铃虫的中肠氨肽酶N1（APN1）基因的去信号肽片段,将其克隆至pUC 19载体,测定核酸序列后,克隆入Bac-to-Bac表达系统中杆状病毒转移载体pFastBacHTB中多角体基因启动子的下游,筛选出重组质粒pFastBacHTB/APN1并转化大肠杆菌DH10Bac,在体内进行重组,经抗性和蓝白斑筛选,获得杆状病毒重组载体Bacmid/APN1。转染粉纹夜蛾（Trichoplusia ni）细胞（Tn-5B1-4）,获得含APN1基因的重组杆状病毒,重组病毒感染Tn细胞后,得到表达的蛋白。【结果】SDS-PAGE分析和点杂交显示,目的基因得到了成功表达。【结论】APN1基因在Tn细胞中成功表达,为今后继续研究其功能和与抗性的关系奠定了基础。     

白僵菌和绿僵菌对棉铃虫的室内防控效果评价

【目的】研究白僵菌和绿僵菌在不同侵染方式下对棉铃虫幼虫致死效应的差异。【方法】室内配置不同浓度白僵菌和绿僵菌孢悬液,采用浸渍法和饲喂法对棉铃虫三龄幼虫进行处理,统计死亡率及体重。【结果】白僵菌和绿僵菌孢子悬浮液经体壁侵染对棉铃虫最大校正死亡率分别为63%和73%,经消化道侵染对棉铃虫最大校正死亡率为38%和65%,与对照相比,体重有不同程度的下降。【结论】室内条件下白僵菌和绿僵菌两者的分生孢子悬浮液均是,浓度越高对棉铃虫的致死效率和体重控制效果越好,且4×10⁷ 孢子 /mL浓度的绿僵菌和1.5×10⁸ 孢子/mL的白僵菌是防治棉铃虫幼虫的经济有效浓度。     

高温处理对肉苁蓉寄主梭梭种子萌发相关性研究

【目的】研究萌发前高温处理对梭梭种子萌发的影响,分析高温对荒漠植物肉苁蓉寄主梭梭种子萌发的作用。【方法】以新疆荒漠植物肉苁蓉寄主梭梭种子为材料,萌发前以5个高温(46、49、52、55和58℃)和6个时间(6、9、12、15、18和21 min)处理。【结果】不同温度和时间处理对梭梭种子发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数均有显著影响,且两者交互作用达到显著性影响,随着处理温度和时间的增加种子发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数均先增加后降低,高温处理对种子萌发有一定的抑制。【结论】(1)温度为52℃,时间为9 min时,梭梭种子发芽率最高,达(55.00±0.30)%,温度为58℃,时间为9 min时发芽率为0.00%;(2)4℃储存6个月后的梭梭种子没有明显的热冲击效应;(3)梭梭种群的退化与梭梭种子的萌发率没有直接联系。     

四氯虫酰胺对棉铃虫生物活性的温度效应及其解毒酶相关机制

【目的】研究四氯虫酰胺对棉铃虫生物活性的温度效应及其影响程度,分析棉铃虫体内4种解毒酶系对该温度效应的影响机制。【方法】采用浸叶法,分别测定15、20、25、30和35℃条件下,四氯虫酰胺对棉铃虫的室内生物活性,测定四氯虫酰胺亚致死剂量下,棉铃虫体内羧酸酯酶(CarE)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、多功能氧化酶(MFO)和尿苷二磷酸糖基转移酶(UGT)比活力的变化。【结果】四氯虫酰胺对棉铃虫的生物活性具有明显的正温度效应,与15℃时相比,其温度系数从+5.52增长为+1 257.35。四氯虫酰胺对棉铃虫的正温度效应可能与GST和MFO有关,其中GST在较低温下的活性变化尤为显著,而CarE和UGT则未发现与四氯虫酰胺生物活性的正温度效应明显相关。【结论】四氯虫酰胺对棉铃虫表现为明显的正温度系数药剂,高温时使用生物活性最佳,低温时抑制GST活性,可能会提高四氯虫酰胺对棉铃虫的生物活性。     

不同浓度环氧虫啶对多异瓢虫成虫存活及繁殖的影响

【目的】 研究不同浓度环氧虫啶对多异瓢虫成虫存活及繁殖力等生命参数的影响。【方法】 利用喷雾塔进行定量喷雾,测定不同浓度环氧虫啶处理24 h后多异瓢虫成虫的存活情况,计算LC₂₀及LC₅₀。利用这2个浓度处理多异瓢虫成虫,逐日记录成虫的存活情况以及产卵量、卵孵化率。【结果】 环氧虫啶对多异瓢虫成虫的LC₂₀及LC₅₀分别为2.29和12.51 mg/L。经这2个浓度环氧虫啶处理后,多异瓢虫雌雄成虫寿命均显著缩短(P<0.05),产卵前期显著延长(P<0.05);对照组与LC₂₀处理组的产卵量差异不显著(P>0.05),但LC₅₀处理组产卵量显著降低(P<0.05);对照组卵孵化率显著高于2个处理组(P<0.05)。【结论】 环氧虫啶对多异瓢虫成虫具有一定的毒杀作用与亚致死效应。     

荒漠林高光谱与光学影像植被指数(VI)的比较

【目的】利用地面遥感和航天遥感数据结合植被指数实现快速调查,研究各数据中植被指数的差异。【方法】用地面高光谱数据和光学影像中分别对梭梭林和柽柳林进行归一化植被指数(NDVI)、重归一化植被指数(RDVI)和土壤调节植被指数(SAVI)3种植被指数的提取,并进行比较。【结果】在高光谱VI中,梭梭林和柽柳林的3种VI的数值大小和变化趋势都很接近,特别是SAVI和RDVI,但NDVI的变化较其他2种大;而在光学影像VI中,梭梭林和柽柳林的NDVI和SAVI的数值基本保持在一定范围内,且变化幅度微小,而RDVI的数值和变化趋势均较大,相对不稳定。【结论】高光谱数据所提取的NDVI和SAVI均大于光学影像,而光学影像所提取的RDVI均大于高光谱数据,RDVI对植被覆盖度更敏感。     

啤酒花挥发油成分及其杀螨活性分析

【目的】测定4种植物精油的杀螨毒力,分析其有效成分,为新型植物性杀螨剂的研究提供理论依据。【方法】通过水蒸气蒸馏法提取4种植物精油,叶片浸渍法测定不同植物精油对土耳其斯坦叶螨的毒力。【结果】啤酒花、香青兰精油对土耳其斯坦叶螨的触杀活性较好,LC₅₀分别为13.30、26.28 mg/mL,其中啤酒花的活性最好;驱虫斑鸠菊、欧洲鳞毛蕨精油的触杀活性较弱,LC₅₀分别为47.50、83.09 mg/mL。通过气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)对活性植物啤酒花的精油进行成分分析,从啤酒花精油中分离鉴定出48个化合物,主要成分为1a, 2, 5, 5-四甲基-反式-1a, 4a, 5, 6, 7, 8-六氢-γ-铬烯(17.15%)、(S, E)-3, 7, 11-三甲基-6, 10-十二碳二烯酸甲酯(8.26%)以及石竹烯氧化物(7.99%)等。【结论】啤酒花精油杀螨活性较好,具有开发为天然杀螨剂的潜力。