康氏木霉HEX1蛋白的原核表达及纯化

【目的】对康氏木霉HEX1蛋白进行原核表达和纯化,为进行抗体制备及深入研究HEX1功能奠定基础。【方法】采用RT-PCR方法扩增康氏木霉hex1基因,构建pMD19-T-hex1重组克隆质粒,在此基础上构建pET28a-hex1表达载体,转化E.coli BL21(DE3)细胞。通过IPTG诱导表达,对重组HEX1蛋白进行可溶性分析、纯化及鉴定。【结果】成功克隆了长660bp的hex1基因并构建了融合表达载体,HEX1蛋白在IPTG诱导下得到表达。融合蛋白主要以包涵体形式存在,能与抗His标签的兔多克隆抗体发生特异性反应,并纯化出了融合表达蛋白。【结论】康氏木霉HEX1蛋白在原核细胞中得到成功表达及纯化,获得了分子质量约为25ku的重组蛋白。     

鸡白痢沙门氏菌invA基因的克隆与原核表达

【目的】克隆鸡白痢沙门氏菌侵袭蛋白A(invA)基因并进行原核表达,分析重组蛋白invA的抗原性,为沙门氏菌快速诊断试纸条和新型表位疫苗的研发提供理论依据。【方法】以鸡白痢沙门氏菌野毒株为供试菌,克隆其invA基因,对invA基因编码的蛋白进行生物信息学分析。将invA基因克隆到pET-30a原核表达载体上,构建原核重组表达质粒pET-30a-invA,将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和Western-blot分析,检测其目的蛋白的表达情况和免疫反应特性。【结果】成功获得了1 143bp的完整的invA基因,编码381个氨基酸。生物信息学分析结果表明,invA基因编码的蛋白有17个抗原决定簇,其跨膜区域明显,92-105位氨基酸为low complexity典型结构域。构建获得了原核重组表达质粒pET-30a-invA,在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达了约51ku的invA融合蛋白;Western-blot检测结果显示,该融合蛋白具有良好的免疫反应性。【结论】成功克隆出了1 143bp大小invA基因,明确了其编码蛋白的生物信息,其诱导表达后获得免疫反应性良好的重组蛋白。     

细粒棘球蚴Eg HSP20蛋白基因的分子特征、表达及其反应原性研究

【目的】本文构建细粒棘球蚴(Echinococcus granulosus,Eg)HSP20基因的重组表达载体并表达、纯化重组蛋白,研究其反应原性。【方法】根据Gen Bank中Eg HSP20蛋白基因c DNA序列设计特异性引物,以细粒棘球蚴Eg头节总RNA为模板,进行RTPCR扩增,将PCR产物克隆至p MD19-T载体,测序验证后,将Eg HSP20抗原基因亚克隆至表达载体p ET-32a中,再将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞内,用IPTG进行诱导表达,并对表达的蛋白进行纯化及反应原性分析。【结果】Eg HSP20 c DNA全长945个核苷酸,编码314个氨基酸。该多肽含有1个N端糖基化位点,1个CAMP磷酸化位点,5个PKC磷酸化位点,10个CKⅡ磷酸化位点;抗原表位区集中在39~53位和120~168位。SDS-PAGE检测显示,重组菌可表达分子量为51 k Da的重组蛋白;Western blot结果显示,表达的重组蛋白Eg HSP20抗原能与Eg阳性血清发生特异性反应。【结论】证实Eg HSP20蛋白具有较强的反应原性,为进一步利用Eg HSP20重组蛋白作为Eg感染诊断中候选标识分子奠定了前期基础。     

鸭瘟病毒gB蛋白单克隆抗体的制备

【目的】制备鸭瘟病毒(DPV)gB蛋白单克隆抗体,为建立DPV快速诊断方法及进一步鉴定DPV的抗原表位奠定基础。【方法】克隆DPVgB基因,构建其表达载体并进行原核表达,纯化DPV gB蛋白,以其作为抗原免疫8周龄BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,进行间接ELISA及亚克隆筛选,并对单抗亚类及抗原性进行鉴定。【结果】PCR扩增出915bp的目的基因,成功连接于pET-28a载体,并转化大肠杆菌Rosetta进行诱导表达,获得4株稳定分泌抗DPV gB蛋白的杂交瘤细胞株,分别命名为A8D7、E6C3、H11F8、H6F6,间接ELISA检测其腹水效价分别为1∶103、1∶103、1∶105、1∶103,亚类鉴定结果分别为IgG2b、IgG2a、IgG2b、IgG1,轻链均为kappa链。Western blot结果显示4株单抗均能与DPV gB蛋白特异性结合,IFA结果表明4株单抗是针对DPV产生的。【结论】成功获得了特异性针对DPV gB蛋白的单克隆抗体。     

小热休克蛋白HSP17.4与过氧化氢酶2互作调控其酶活性

【目的】为探究拟南芥小热休克蛋白HSP17.4与过氧化氢酶2的关系。【方法】构建带有组氨酸标签的小热休克蛋白HSP17.4的原核蛋白表达载体,将小热休克蛋白HSP17.4与过氧化氢酶2的重组蛋白诱导表达后进行体外免疫共沉淀试验,并利用过氧化氢酶活性试剂盒检测过氧化氢酶活力。【结果】成功构建了带有组氨酸标签的小热休克蛋白HSP17.4的蛋白表达载体,并通过体外免疫共沉淀试验发现带有组氨酸标签的小热休克蛋白HSP17.4能够将无纯化标签的过氧化氢酶2成功纯化出来,过氧化氢酶活性检测表明小热休克蛋白HSP17.4可以显著增强过氧化氢酶2活性。【结论】本研究证明小热休克蛋白HSP17.4与过氧化氢酶2存在相互作用,并且小热休克蛋白HSP17.4激活过氧化氢酶2酶活性,为进一步研究小热休克蛋白HSP17.4通过调控过氧化氢酶2参与非生物胁迫响应奠定基础。     

丝状支原体山羊亚种特异性蛋白基因Mmc-3740的克隆表达和免疫原性分析

【目的】构建表达丝状支原体山羊亚种特异性蛋白基因Mmc-3740的重组表达菌,为Mmc-3740蛋白的进一步研究与应用奠定基础。【方法】采用PCR技术从Mmc-47中扩增出该基因,进行克隆、测序,将克隆质粒与pET-28a分别双酶切,回收正确的片段进行连接构建重组表达质粒,转化至表达菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,产物用SDS-PAGE检测,用镍柱对其纯化后免疫小鼠获得高免血清,并进行Western-blot验证。【结果】成功构建了克隆和表达载体,重组菌表达目的蛋白大小约21 ku。表达产物通过镍柱纯化后可得到单一的目的蛋白条带,Western-blot检测结果显示所表达的目的蛋白有较好的免疫原性。【结论】成功在BL21(DE3)宿主菌内表达了Mmc-3740重组蛋白。     

人IL-32-IgG4（Fc）融合蛋白在CHO/DG44细胞中的表达

【目的】构建人白细胞介素32(IL-32)和IgG4 Fc段的融合基因真核表达载体IL-32-IgG4(Fc)-pOp-tiVEC,建立稳定转染的中华仓鼠卵巢细胞(CHO/DG44)克隆,并检测其重组蛋白的表达。【方法】用PCR方法从脂多糖(LPS)激活的人CD4+T细胞cDNA中扩增出IL-32蛋白基因,并克隆到IgG4(Fc)-pOptiVEC载体上,构建重组质粒IL-32-IgG4(Fc)-pOptiVEC,并进行酶切和测序鉴定。采用脂质体法,将重组质粒线性化后转染CHO/DG44细胞,进行RT-PCR检测,筛选阳性克隆,并对筛选的阳性克隆进行氨甲喋呤(MTX)加压筛选。利用ProteinG-Agarose亲和层析纯化转染CHO/DG44细胞培养上清液中的融合蛋白IL-32-IgG4(Fc),通过SDS-PAGE、Western-blot对融合蛋白IL-32-IgG4(Fc)的表达和生物学活性进行检测。【结果】PCR扩增获得了长度为564 bp的人IL-32蛋白基因cDNA,经测序与GenBank报道的序列一致。真核表达载体IL-32-IgG4(Fc)-pOptiVEC经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切,获得了IL-32蛋白基因片段,其长度为564 bp。筛选出了能稳定表达IL-32-IgG4(Fc)融合蛋白的CHO/DG44细胞克隆。亲和纯化后的IL-32-IgG4(Fc)融合蛋白经SDS-PAGE和Western-blot鉴定,其分子质量约为50.0 ku,与预期结果一致。MTX加压后,IL-32-IgG4(Fc)融合蛋白的表达量明显升高。【结论】成功构建了人IL-32蛋白融合基因的真核表达载体IL-32-IgG4(Fc)-pOptiVEC,获得了能够表达具有生物学活性的IL-32-IgG4(Fc)融合蛋白的CHO/DG44细胞克隆。     

马立克氏病病毒gB与IL-2融合基因载体的构建及表达

根据已发表的马立克氏病病毒(MDV)血清I型与鸡白介素2(IL-2)DNA序列,设计两对引物,用PCR扩增出MDV gB基因和IL-2基因,并克隆入pEGFP-C1载体,构建了载体pC1-gB-IL.通过酶切分离外源基因表达盒,并将外源基因表达盒插入pTK2B质粒,成功构建了转移载体pT-C-gB-IL.将转移载体pT-C-gB-IL转染CEF细胞,培养36～48 h后,经荧光显微镜观察,有荧光出现,证明该载体得到表达,并通过Western-blotting鉴定证明MDV gB和IL-2的融合基因得到了有效的表达.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒BJ-4株GP4蛋白的原核表达与纯化

【目的】原核表达和纯化猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的结构蛋白GP4,为深入了解其结构和功能奠定基础。【方法】采用RT-PCR方法扩增PRRSV BJ-4株ORF4基因片段,将其克隆到pMD19-T载体中并进行测序。从测序正确的重组质粒pMD19-T-ORF4中扩增缺失N端及C端疏水序列的基因片段tGP4(truncated GP4),再将其亚克隆到pET-32a载体并转化到大肠杆菌BL21,IPTG进行诱导表达。对表达的重组蛋白进行可溶性分析,使用尿素梯度法进行蛋白纯化,并通过ELISA法检测重组蛋白的免疫活性。【结果】RT-PCR获得了537bp的ORF4。成功构建了原核表达载体pET-32a-tGP4,在IPTG诱导后重组蛋白以包涵体的形式大量表达。使用尿素梯度法获得了纯度较高的目的蛋白,纯化的目的蛋白能与PRRSV阳性血清特异性结合。【结论】使用原核细胞成功表达了PRRSV的结构蛋白GP4,纯化后的重组蛋白具有很好的免疫原性。     

oleosin-MT融合蛋白在拟南芥中的表达及鉴定

【目的】获得转金属硫蛋白(MT)基因的拟南芥植株,为利用植物生物反应器规模化生产MT奠定基础。【方法】利用融合PCR方法,扩增拟南芥MT基因与油体蛋白oleosin基因的融合基因,将融合基因克隆至表达载体pOP上,构建重组质粒pOP-oleosin-MT。采用冻融法将质粒pOP-oleosin-MT转入根癌农杆菌EHA105中,通过农杆菌介导法转化拟南芥,用PCR检测并筛选转基因拟南芥阳性植株,采用SDS-PAGE法检测oleosin-MT融合蛋白的表达,用邻苯三酚自氧化法和结晶紫法测定融合蛋白的体外抗氧化活性。【结果】成功构建了植物油体特异表达载体pOP-oleosin-MT,融合蛋白oleosin-MT在拟南芥种子中成功表达,其分子质量为26ku;总蛋白质量浓度达到50μg/μL时,超氧阴离子的清除率最高,为58.5%;总蛋白质量浓度为10μg/μL时,羟自由基清除率可达69.7%。【结论】成功获得转MT基因的拟南芥株系,并证明融合蛋白oleosin-MT在拟南芥中具有良好的体外抗氧化活性。     

动物体蛋白合成与降解规律研究进展

动物的生长发育速度实质反映了体蛋白沉积量的变化。体蛋白沉积量主要受蛋白质合成和蛋白质分解两方面的共同影响 ,蛋白质合成除受到基因调控制约外 ,还受到饲料及营养因素诸如锌、铬、脂肪酸及生长激素水平等的影响。蛋白质的降解与日粮组成、采食量、饲喂次数及神经系统和胃肠产生的生产抑素有关。文章通过对体蛋白合成与降解规律及饲料营养成分对体蛋白的合成及降解影响的探索 ,提出了提高蛋白质饲料利用率 ,使动物生产实现最大化的应用前景     

栗疫病菌泛素核糖体L40融合蛋白基因的克隆与分析

用酿酒酵母(Saccharyomyces cerevisae)泛素融合蛋白基因从COGEME(Consortium for the functional genomics of microbial eukaryotes)植物病原菌EST(Expressed sequence tag)库中BLAST(Basic local alignment search tool)得到栗疫病菌的泛素融合蛋白EST,设计引物从栗疫病菌cDNA中克隆到该基因并测序,得到在进化上高度保守的基因,该基因开放阅读框为387 bp,编码128个氨基酸残基组成的泛素融合蛋白前体;由cDNA序列推定的氨基酸序列分析结果表明,泛素融合蛋白前体包括氮末端的泛素结构域(76个氨基酸残基)和碳末端的核糖体蛋白L40结构域(52个氨基酸残基).该蛋白为高碱性蛋白,碳末端含有一个"锌指"模式结构.与19个物种比较的结果表明,栗疫病菌与真菌泛素融合蛋白氨基酸序列相似度较高,具有高度的保守性.     

HLA-G1的基因表达、纯化及其活性分析

在获得HLA-G1cDNA克隆序列的基础上,构建了pGEX-4T2-HLA-G1原核表达载体,对HLA-G1的诱导表达发现,融合蛋白以包涵体形式存在于表达菌中。进一步溶解包涵体,改善复性条件,最终获得高纯度的GST/HLA-G1融和蛋白。51Gr释放试验表明,纯化的HLA-G1具有抑制NK细胞对靶细胞的杀伤活性。     

生物工程技术与蛋白食品生产

随着人口的不断增长，人灰面临着严重的蛋白质短缺。解决这一难题的希望之一就是生物工程技术。生物工程将为人类创造出高蛋白质含量、的农作物新品种，生长较快的食畜品种；然而蛋白质含量高、氨基酸比较完全、数十分种就能倍增的以惊人的速度生长的某些微生物，则更是解决人类蛋白质短缺的一个极具吸引力的途径。     

单细胞蛋白的开发及其在畜禽生产中的应用

介绍了生产单细胞蛋白的微生物种类,阐述了单细胞蛋白的安全性评价和营养性评价,以及单细胞蛋白在畜禽生产中的应用效果,针对单细胞蛋白的存在问题提出了相应的解决方法。     

Expression and Purification of Recombinant MP-GFP Protein in Escherichia coli

Guided pesticide is an unique compound resulted from the conjugation with carrier (amino acid, protein, sugars, etc) and the active pesticide ingredient. One of the attributes of the guided pesticide is its potential to accumulate at the site of the damaged points caused by pest or at the site of entry to the target pests, such as via inhalation, cuticular penetration, and oral digestion. Movement protein (MP) is a kind of protein coded by plant virus. A genetic fusion between green fluorescent protein (GFP) and movement protein resulted in the expression of a fluorescent fusion MP-GFP protein, which was fully biologically active in mediating the cell-to-cell spread of virus. In order to obtain a suitable carrier for a pesticide,fluorescent carrier MP-GFP was constructed. It was found that the recombinant MP-GFP protein was the inclusion body.The results indicated that optimized cultural condition for expression of recombinant MP-GFP protein was incubation at 37℃ for 2 h and induction with 0.2 mmol L-1 IPTG (isopropyl-β-dthiogalactopyranoside) at 25℃ for 4 h. MP-GFP protein was purified by using Ni-NTA resin. The expressed recombinant MP-GFP protein had both the fluorescence character of report GFP gene and moving character of movement protein. It could provide a guided carrier for studying the guided pesticide. It could also provide convenience for studying the delivery and distribution of the guided pesticide ingredients in the plant.     

蛋白质农药研究与产业化进展

蛋白质农药是新兴起的生物农药,综述了蛋白激发子的类型及其特性,阐述了植物激活蛋白的特点、基因克隆、作用机理、制剂的研制以及对农作物的抗病促生长活性,展望了植物激活蛋白的产业化研究应用前景.     

流感病毒PA蛋白与宿主蛋白PCBP1的相互作用

【背景】PA蛋白是流感病毒RNA聚合酶复合体的重要组成部分,在流感病毒基因组的转录和复制过程中发挥重要作用。前期利用酵母双杂交技术(Y2H)筛选与流感病毒PA蛋白相互作用的宿主蛋白,获得多聚胞嘧啶结合蛋白1(poly(r C)-binding protein 1,PCBP1)。【目的】探索PCBP1蛋白与流感病毒PA蛋白的互作关系及其对流感病毒复制的影响,为深入理解流感病毒在宿主体内的复制调控机制提供数据。【方法】将诱饵质粒pGBKT7-PA与筛选到的重组质粒p GADT7-PCBP1以及阴性对照组和阳性对照组按照醋酸锂法分别共转化酵母感受态细胞,并涂布在3种营养缺陷型培养基上,30℃倒置培养5—7 d,观察酵母菌落生长情况和菌落颜色,回交验证PA蛋白与PCBP1蛋白在酵母系统中的相互作用。参照GenBank中录入的PA蛋白和人源PCBP1蛋白的序列,分别设计特异性扩增引物,构建真核重组表达质粒pCAGGS-Flag-PA和pCAGGS-Myc-PCBP1,将这两种真核表达质粒分别单独转染或共同转染HEK293T细胞,于转染48 h后裂解细胞,收获上清,留取少部分作对照,余下的样品逐步加入FLAG单抗和Protein G琼脂糖珠子进行免疫共沉淀(Co-IP),经SDS-PAGE和Western blot检测PA蛋白与PCBP1蛋白在哺乳动物细胞中的相互作用。利用慢病毒包装系统pLVX-IRES-Zs Green1在HEK293T细胞中包装假病毒,将假病毒侵染A549细胞后经超速流式分选构建PCBP1蛋白过表达细胞系,Western blot检测PCBP1过表达情况,然后用流感病毒WSN以0.01 MOI感染该过表达细胞系,于感染后24和48 h收获上清,对上清中的流感病毒进行蚀斑计数。合成PCBP1蛋白的si RNA,转染A549细胞下调PCBP1蛋白的表达,干扰后48 h通过Western blot检测PCBP1蛋白表达下调情况,并以MOI=0.01感染流感病毒WSN,收获感染后24和48 h的上清,进行蚀斑滴定计数。【结果】通过酵母回交验证发现诱饵质粒pGBKT7-PA与重组阳性质粒p GADT7-PCBP1的共转酵母菌落可以在SD/-2、SD/-4、SD/-4/X/A等3种营养缺陷型平板上正常生长,并且能分解底物X-α-Gal,使菌落呈现蓝色,与阳性对照组一致,表明PA蛋白与PCBP1蛋白在酵母系统中存在相互作用。免疫共沉淀试验发现PA蛋白可以将PCBP1蛋白沉淀下来,说明PA蛋白与PCBP1蛋白在哺乳动物细胞中存在相互作用。在PCBP1过表达细胞系中,PCBP1蛋白表达水平显著提高,流感病毒的复制滴度下降;而通过si RNA干扰后,PCBP1表达水平显著下降,流感病毒的复制滴度升高,表明PCBP1对流感病毒复制具有负调控作用。【结论】通过研究发现流感病毒PA蛋白与宿主蛋白PCBP1在酵母细胞和哺乳动物细胞中均存在相互作用,且宿主蛋白PCBP1对流感病毒的复制具有负调控作用。     

SARS病毒S蛋白S1和S2片段的合成及在大肠杆菌中的表达

[目的]通过拼接完成对SARS S蛋白的上下游序列S1和S2的合成,并在大肠杆菌中表达,获得具活性的S1和S2蛋白。[方法]利用不对称PCR方法以及采用设计酶切位点将2个片段连接的方法合成SARS香港株S蛋白上下游2个片段S1和S2;构建S1和S2这2个基因片段的原核表达载体,pET28a-S1和pET28a-S2,并转化BL21表达菌株,然后用IPTG诱导目的基因的表达并提取纯化目的蛋白。[结果]连接得到S1和S2这2个基因片段,并成功地在大肠杆菌中得到表达。[结论]该研究为后续SARS疫苗研究提供检测抗原奠定了基础。