山羊-绵羊异质克隆胚在G1/G2培养液中发育的可能性

以山羊皮肤成纤维细胞为供体细胞,绵羊去核卵母细胞为受体细胞进行种间体细胞核移植,构建山羊-绵羊重构胚,并采用G1/G2培养液对其进行体外培养,比较G1/G2培养不同阶段添加饲养层对山羊-绵羊种间体细胞核移植重构胚发育的效果.结果表明,共构建获得山羊-绵羊重构胚472枚,重构胚能够在G1/G2连续培养基中发育至囊胚阶段;仅在G1中添加饲养层与对照组不添加饲养层相比,前者能获得较好的分裂率和桑囊率,差异不明显(卵裂率为76.88% vs 67.11%,桑椹胚率为52.84% vs 39.22%,囊胚发育率为7.32% vs 5.88%),而仅在G2阶段共培养与对照组相比培养桑囊率较低,差异不显著(卵裂率为69.38% vs67.11%,桑椹胚率为37.84% vs 39.22%,囊胚发育率为3.60% vs 5.88%),即,对于绵羊-山羊重构胚的培养,在前期(G1中)添加颗粒细胞培养重构胚效果优于仅在后期共培养(卵裂率为76.88% vs 69.38%,桑椹胚率为52.84% vs 37.84%,囊胚发育率为7.32% vs 3.60%).     

绵羊精子提取物对卵母细胞的孤雌激活作用

研究了绵羊精子提取物对绵羊卵母细胞的孤雌激活作用,确定了绵羊精子提取物的最佳注射剂量,并将其孤雌激活效果与离子霉素联合6-DM AP法的激活效果进行了比较。结果表明,绵羊精子提取物对绵羊卵母细胞有孤雌激活作用,最佳注射剂量为每个绵羊卵母细胞注入2~4 pL浓度5~6 m g/mL的绵羊精子提取物;绵羊精子提取物的孤雌激活效果与离子霉素联合6-DM AP法的激活效果差异不显著。     

精子提取物对绵羊显微授精受精率及胚胎发育影响的研究

将绵羊精子可溶性撮物与上不运动绵羊精人同注射于体外成熟的绵羊卵母细胞并在体外培养，结果发现，共同注射的卵母细胞卵裂率、２￣１６细胞发育率，桑椹胚发率育，囊胚发育率均显著高于对照组，其中卵母细胞卵裂率和２￣１６细胞发育率还显著高于精子单独注射组；桑椹胚，囊胚发育率明显高于精子单独注射组。     

牛卵胞质内显微受精中第一极体位置与激活方法研究

【目的】探讨牛卵母细胞胞质内显微受精(ICSI)操作中,卵母细胞第一极体位置以及受精卵化学激活方法对ICSI卵体外发育的影响。【方法】采集牛卵巢,成熟培养卵母细胞后,调整其第一极体分别位于相当于时钟6点和12点的位置,进行牛卵母细胞胞质内显微受精,以ICSI卵不进行激活处理为未激活组,分别采用乙醇、离子霉素及离子霉素联合6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)激活ICSI卵,统计ICSI卵的形态完整率、卵裂率和囊胚发育率。【结果】第一极体分别位于相当于时钟6点和12点的位置时,所获得的ICSI卵形态完整率(92.9%和94.0%)、卵裂率(37.1%和40.0%)和囊胚发育率(12.9%和12.2%)均无统计学差异(P>0.05)。未激活组ICSI卵的卵裂率较低,不能发育到囊胚;用乙醇或离子霉素激活时,ICSI卵的卵裂率(25.7%和27.6%)和囊胚发育率(3.3%和3.4%)均显著高于未激活组(7.5%和0)(P<0.05);用离子霉素与6-DMAP联合激活时,ICSI卵的卵裂率和囊胚发育率分别为38.9%和13.9%,显著高于乙醇激活组、离子霉素激活组及未激活组(P<0.05)。【结论】对牛卵母细胞进行ICSI操作时,第一极体分别位于相当于时钟6点和12点位置时,对ICSI卵的发育无显著影响;采用离子霉素和6-DMAP联合激活,有利于ICSI卵的体外发育。     

山羊胎儿成纤维细胞转染人t-PA指形区缺失基因及其核移植研究

采用阳离子脂质体法将人t-PA指形区缺失基因乳腺特异性表达载体(pEBT)导入山羊胎儿成纤维细胞,以山羊胎儿成纤维细胞和转染的山羊胎儿成纤维细胞作供体,构建核移植胚,对其体外发育情况进行了研究,比较了2种供体细胞(山羊胎儿成纤维细胞和转人t-PA指形区缺失基因的山羊胎儿成纤维细胞)及转人t-PA指形区缺失基因的山羊胎儿成纤维细胞饥饿处理与否对核移植胚胎体外发育的影响。结果表明,早期核移植胚有荧光蛋白(GFP)的表达;以山羊胎儿成纤维细胞作供体细胞时,核移植胚的桑葚胚率(50.3%)及囊胚率(16.0%)均高于以转人t-PA指形区缺失基因胎儿成纤维细胞为供体时的桑葚胚率(48.4%)和囊胚率(10.9%),但差异不显著(P>0.05);转人t-PA指形区缺失基因的山羊胎儿成纤维细胞经饥饿处理后,其核移植胚胎的卵裂率(73.6%)与不饥饿时的卵裂率(73.9%)差异不显著;饥饿处理后核移植胚胎的桑葚胚率(48.5%)和囊胚率(11.2%)均高于不饥饿处理的桑葚胚率(39.2%)和囊胚率(9.2%),但差异不显著(P>0.05)。本研究成功地构建了转人t-PA指形区缺失基因的体细胞核移植胚胎,体外囊胚率为11.2%。     

山羊卵母细胞的显微受精

探讨了显微操作条件的改善对山羊卵母细胞胞质内显微受精(ICSI)的影响。结果表明,将精子操作液中聚乙烯吡咯烷酮(PVP)浓度从10%(10g/L)降低到8%和5%后,ICSI胚的卵裂率差异不显著,但正常卵裂率、桑葚胚率和囊胚率随PVP浓度的下降而上升;PVP浓度为5%和10%时,正常卵裂率分别为69.6%和58.5%(P<0.05),桑葚胚率分别为45.6%和35.2%(P<0.05),囊胚率分别为26.9%和16.9%(P<0.05),表明含5%PVP的精子操作液更有利于ICSI胚的发育。显微注射时将卵母细胞第一极体置于相当于时钟6点的位置与12点位置相比,ICSI胚的分裂率没有差异,而正常卵裂率分别为69.9%和65.4%(P>0.05),桑椹胚率分别为45.5%和42.6%(P>0.05),囊胚率分别为26.7%和20.4%(P>0.05),表明注射时极体置于6点的位置有利于ICSI胚的体外发育。     

绵羊-绵羊和山羊-绵羊体细胞克隆胚的构建及体外发育研究

【目的】以绵羊卵母细胞为受体,构建绵羊-绵羊和山羊-绵羊体细胞克隆胚,比较其体外发育能力,探讨绵羊卵母细胞对异种体细胞核的再程序化能力。【方法】以体外成熟的绵羊卵母细胞为核受体,分别以绵羊及山羊胎儿成纤维细胞为核供体,经卵母细胞去核、注核、重构胚电融合、激活等一系列操作,构建同种绵羊-绵羊及异种山羊-绵羊体细胞的克隆胚,比较其体外发育能力。【结果】同种间克隆胚的囊胚发育率(16.0%)高于异种间克隆胚(7.4%)。异种间克隆胚在8-细胞到16-细胞及16-细胞到桑椹胚期间的发育能力显著低于同种间克隆胚。2种克隆胚在2-细胞到8-细胞期间的发育速度基本相同,但异种间克隆胚在8-细胞到囊胚期间的发育速度明显低于同种间克隆胚,两者相差12~24 h。【结论】绵羊卵母细胞对异种体细胞核具有再程序化能力,但这种再程序化能力明显低于其对同种体细胞核的再程序化能力。     

提高山羊卵丘细胞核移植效果的研究

 【目的】提高山羊卵丘细胞核移植效果。【方法】采用秋水仙胺提高山羊卵母细胞去核率,5-氮-2'-脱氧核苷（5-aza-dC）和曲古菌素A（TSA）影响山羊卵丘细胞核移植胚胎。【结果】0.5 μg?ml-1秋水仙胺处理山羊卵母细胞效果最好,胞质突起率达91.7%（P＜0.05）;通过比较盲吸去核法与化学辅助去核法的去核率及构建卵丘细胞核移植胚胎的体外发育能力发现,化学辅助去核法的去核率达100%,所构建的重构胚体外发育能力较高,桑椹胚率和囊胚率分别达25.2%和13.1%,显著高于盲吸去核法（P＜0.05）。采用0.01 μmol?L-1的5-aza-dC处 理山羊卵丘细胞,核移植胚胎桑椹胚率和囊胚率分别达30.4%和17.0%,显著高于其它各组（P＜0.05）;采用 400 nmol?L-1TSA处理山羊卵丘细胞,核移植胚胎桑椹胚率、囊胚率分别达31.5%和15.2%。【结论】化学辅助去核法的去核率显著高于盲吸去核法,采用0.01 μmol?L-1的5-aza-dC或400 nmol?L-1 TSA处理山羊卵丘细胞,效果最佳。     

不同类型供体细胞对牛体细胞重构胚发育能力的影响

通过显微操作去除体外成熟培养22￣23h卵母细胞的细胞核,并通过细胞质内注射法将供体细胞核移入去核卵母细胞内构建重组胚,重组胚经离子霉素(Ionomycin)激活5min后,再在6-DMAP内培养4h,将重组胚转CR1培养液中进行培养,24h和36h检查卵裂率,培养8d后统计囊胚发育率。比较了经血清饥饿和未饥饿牛成纤维细胞、颗粒细胞作为供体细胞构建的重组胚。研究发现:未饥饿组的牛成纤维细胞重组胚囊胚发育率(11.76%)显著高于血清饥饿组重组胚囊胚发育率(3.16%,p<0.05)。未饥饿组颗粒细胞囊胚发育率(14.94%)也显著高于血清饥饿组(7.14%,p<0.05)。经血清饥饿处理的颗粒细胞和成纤维细胞重组胚发育率差异不显著(p>0.05),未饥饿处理组两种细胞的重组胚发育率差异不显著。结果表明,用非饥饿处理牛成纤维细胞及颗粒细胞重组胚的发育率较高,牛颗粒细胞更有利于重新程序化。     

山羊卵核移植的研究

 选用陕北黑山羊的4-32细胞胚和萨能奶山羊的次级卵母细胞分别作核供体和胞质供体。在显微操作仪的控制下，将分离后的单个卵裂球注入去核次级卵母细胞的卵周隙。采用电融合法诱导卵裂球和去核次级卵母细胞融合。通过体外培养和移植，检查卵核移植的效果。本研究证明：⑴在4-32细胞期，核供体胚的发育阶段对山羊卵核移植胚的体外发育无显著影响；⑵由山羊4-32细胞期胚胎的卵裂球和去核次级卵母细胞构成的卵核移植胚在体内仍可发育为正常个体；⑶用注射LH后25-35小时的次级卵母细胞作胞质供体均可获得较高的卵核移植胚体外发育率；⑷用900伏/厘米的电场强度进行2个80微秒的电脉冲处理，诱导卵裂球和去核次级卵母细胞融合，可获得更好的电融合效果。根据山羊胚胎性RNA在2细胞期出现的事实和本研究的上述结果，作者认为，次级卵母细胞的胞质对移入的晚期卵裂胚细胞核可能有去分化作用。     

孵育和激活剂作用时间对山羊核移植胚胎早期发育的影响

探讨了电融合前对重构卵继续孵育及激活剂6-DMAP不同作用时间对山羊核移植胚胎体外发育的影响。结果显示,重构卵在成熟液中继续培养后,9~10 h组的融合后卵子死亡率(27.42%)显著低于30 min和90 min组(49.26%和56.3%)(P0.05),胚胎卵裂率(68.15%)则显著高于30 min和90 min组(55.6%和54.24%)(P0.05);重构卵用离子霉素激活后,再用6-DMAP激活0 h、2 h、3 h、4 h、5 h及8~10 h,各组间的胚胎卵裂率均无显著差异(P0.05),但均显著高于未用6-DMAP组的卵裂率(P0.05)。本试验结果表明,电融合前,继续成熟培养重构卵有利于降低电融合时的卵子死亡率,提高卵子利用率;联合使用离子霉素和6-DMAP有利于提高激活效果,而6-DMAP的作用时间(2~10 h)不影响核移植胚胎的卵裂。     

家兔细胞核移植技术研究

以家兔16－32细胞期胚胎卵裂为核供体，显微注射到去核卵母细胞周隙中，共制作完成229枚重组胚，2次电融合后率达到76．8％。重组胚与兔胚成胎成纤维细胞共同培养，卵裂率为65．7％（23／35），桑囊率达到22．9％（8／35），均显著高于（P＜0．01）微滴直接培养结果（43．3％、13／30；16．7％，5／30）。将111枚重组胚手术移植到9只同期发情的受体母兔输卵管中，2只妊娠，其中1只完成足月胚胎发育产出克隆仔兔2只。     

Factors Affecting the Efficiency of Embryonic Cell Nuclear Transfer in Rabbits

Factors affecting the efficiency of nuclear transfer （NT） in rabbits were examined in the present study. When 100 V mm of pulse strength and 15 us of pulse duration were employed, 3 and 4 electronic pulses resulted in significantly more cytoplasts fused with donor cells compared with 2 electronic pulses （P〈 0.05）, but no significant difference was found in the cleavage rate of reconstructed embryos among the three groups （P〉0.05）. When the duration and number of electronic pulse were fixed at 15 ps and 3 times, increase of pulse intensity from 100 V mm 1 to 150 V mm^-1 and 200 V mm^-1 resulted in a significantly decrease in the cleavage rate of reconstructed embryos （P〈 0.05）, although the fusion rate did not significantly differ among the three groups （P〉 0.05）. Significantly more reconstructed embryos cleaved and developed to blastocysts when they were derived from donor embryos at the 8-16-cell stage, in comparison with the reconstructed embryos derived from donor embryos at the compact morula stage （P 〈 0.05）, although the fusion rate was similar （P 〉 0.05）. Activation of cytoplasts prior to fusion increased the cleavage rate （P〈 0.05） and blastocyst development （P〈 0.05） of reconstructed embryos, but decreased the fusion rate （P 〈 0.05） compared with cytoplasts activated post fusion. More reconstructed embryos developed to blastocysts when they were cultured in TCM ＋ 3% OCS at the first 48 h and then cultured in TCM199＋ 10% FCS, in comparison with the reconstructed embryos cultured in either TCM199＋ 10% FCS or TCM199＋3% OCS （P 〈 0.05）. When 22 NT embryos were transferred into the oviducts of one recipient rabbit, one recipient rabbit delivered a female rabbit at 34 days of gestation. In conclusion, either electrofusion parameter or developmental stage of donor embryos have a significant effect on the efficiency of NT, NT embryos require different concentration of serum at their different development stages.     

转K2.9基因绒山羊体细胞核移植技术体系的优化研究

【目的】利用体细胞核移植技术制备转毛角蛋白Ⅱ型中间丝K2.9基因的高绒质绒山羊胚胎,为绒山羊优良品种的培育提供一种全新的技术材料。【方法】以含有Neor 基因标记的K2.9 毛囊特异表达载体pcDNA3.1-K转染绒山羊胎儿成纤维细胞,经G418筛选获得转K2.9基因细胞,将获得的转基因阳性细胞与体外成熟的绒山羊卵母细胞进行核移植,并对生产的重构胚进行了体外培养。本文分别进行了激活方法、供体细胞和卵母细胞来源的筛选,且对获得的囊胚进行了PCR鉴定。【结果】（1）Iono+6-D对成年羊卵母细胞的孤雌激活效果好于A23187+6-D,显著提高了胚胎的卵裂率。（2）羔羊孤雌胚的卵裂率显著低于成年羊,但囊胚率差异不显著。（3）来自2只绒山羊胎儿的转基因成纤维细胞对核移植胚的发育没有显著影响,但2号羊的转基因细胞显著提高了融合率。（4）以羔羊卵进行核移植,显著降低了核移植胚的发育率。（5）对获得的囊胚进行PCR鉴定,成功扩增到目的基因。【结论】将K2.9 毛囊特异表达载体pcDNA3.1-K转染的绒山羊胎儿成纤维细胞作为供体细胞,核移植到成年羊卵母细胞中,以Iono+6-D进行激活,首次成功、高效地获得携带K2.9基因的绒山羊囊胚。     

影响兔胚胎细胞核移植效率的因素

 对兔胚胎细胞核移植（NT）的有关影响因素进行了系统研究。结果发现电场强度100 V·mm-1，脉冲时间15μs，电脉冲3～4次的融合率显著高于其它组（P<0.05）；融合前激活卵母细胞，分裂率和囊胚率显著高于融合后激活（P <0.05）；当用8～16-细胞胚胎的卵裂球作供核时，卵裂率和囊胚率显著高于致密桑椹胚卵裂球为供核组；当重组胚在含3%发情牛血清（OCS）的TCM199中培养48 h后，转入含10% FCS的TCM199中继续培养，卵裂率和囊胚率显著高于一直在3% OCS或10% 胎犊血清（FCS）中培养的重组胚（P < 0.05）。将22枚2～4-细胞期重组胚移入同期发情的受体母兔输卵管内，34 d后产下NT仔兔1只。结果表明，电融合参数和供体胚胎的发育阶段以及受体卵母细胞的状态对NT效果有显著影响，在NT胚胎的不同发育阶段采用不同的血清种类和浓度可提高其胚胎发育能力。     

卵母细胞体外成熟时间对绵羊核移植效率的影响(英文)

[Objective] The study aimed to provide references for the time of oocyte maturation in vitro and enucleation in the course of sheep nuclear transfer(NT).[Method] Compared the effects of different maturation time of oocytes on enucleation efficiency and reconstructed embryo development by means of blind enucleation and fluorescence microscopy.[Result] Treatment of IVM(in vitro maturation)19-21 h was significantly higher than IVM 16-18 h treatment in oocyte maturation rate(P<0.05)and was significantly higher than IVM 22-24 h treatment in enucleation rate(P<0.05).Three treatments had no significant difference in cleavage rate and blastocyst rate(P>0.05),but IVM 19-21 h treatment was significantly higher than the other 2 treatments in average cell number of blastocysts(P<0.05).[Conclusion] The appropriate in vitro maturation time of oocytes was 19-21 h for sheep nuclear transfer,which could significantly improve the quality of blastocysts according to the cell number per blastocyst(P<0.05).     

卵母细胞体外成熟时间对绵羊核移植效率的影响(英文)

[Objective] The study aimed to provide references for the time of oocyte maturation in vitro and enucleation in the course of sheep nuclear transfer(NT).[Method] Compared the effects of different maturation time of oocytes on enucleation efficiency and reconstructed embryo development by means of blind enucleation and fluorescence microscopy.[Result] Treatment of IVM(in vitro maturation)19-21 h was significantly higher than IVM 16-18 h treatment in oocyte maturation rate(P<0.05)and was significantly higher than IVM 22-24 h treatment in enucleation rate(P<0.05).Three treatments had no significant difference in cleavage rate and blastocyst rate(P>0.05),but IVM 19-21 h treatment was significantly higher than the other 2 treatments in average cell number of blastocysts(P<0.05).[Conclusion] The appropriate in vitro maturation time of oocytes was 19-21 h for sheep nuclear transfer,which could significantly improve the quality of blastocysts according to the cell number per blastocyst(P<0.05).     

卵母细胞体外成熟时间对绵羊核移植效率的影响

[目的]为绵羊克隆试验中卵母细胞的体外成熟及去核时间提供参考。[方法]利用盲吸法结合荧光显微镜检查,对绵羊不同成熟时间卵母细胞去核的效率及其后续重构胚的发育进行对比。[结果]体外成熟培养19~21 h的绵羊卵母细胞在成熟率上显著高于体外成熟培养16~18 h(P(0.05),在去核成功率上显著高于体外成熟培养22~24 h(P(0.05);3个试验组在卵裂率、囊胚率上差异不显著(P(0.05),但是体外成熟培养19~21 h的试验组囊胚平均细胞数要显著高于其他2组(P(0.05)。[结论]体外成熟培养19~21 h的卵母细胞较适于作为受体细胞进行绵羊核移植,可以显著提高囊胚的质量。