RNA干涉技术及其在哺乳动物中的应用进展

RNA干涉(RNA interference,RNAi)作为一种有效的用于转录后基因沉默,从而抑制特定基因表达的技术,近年来在哺乳动物细胞中的研究已取得了长足发展,且在基因功能以及疾病治疗的研究中有着广阔的应用前景。研究表明,哺乳动物细胞中的RNAi作用方式与植物有所不同,笔者对哺乳动物RNAi技术的发展、作用机制及其在基因功能、基因治疗、转基因动物研究、药物开发等方面的应用做了综述。     

RNAi技术在植物基因功能研究中的应用

RNAi技术是研究基因功能的重要工具。其原理是对某个已知基因,设计诱导其沉默的dsRNA,通过合适手段导入细胞或机体使产生干涉效应的信号分子siRNA,导致基因表达水平下降或完全沉默。通过基因表型变化,鉴定该基因功能。从RNAi的研究背景和作用机制出发,对近年来利用RNAi技术研究植物基因功能的概况、诱导方法和载体作一综述。     

3个水稻RNAi载体的构建与应用

利用RNAi(RNA interference)干扰技术,构建了启动子和干涉区域不同的3种水稻干涉载体,通过农杆菌介导转化水稻粳稻品种中花11。表型和分子分析表明,3种载体都能有效降解靶基因OsUGP2,暗示pRNAi-ubi-UGP2载体能同时沉默OsUGP2家族基因,pRNAi-ubi-UGP2PRO载体能特异沉默OsUGP2,pRNAi-IP-UGP2载体对OsUGP2基因的沉默不具特异性,但其沉默具有人为可调控性。     

一步法快速构建长片段RNAi发夹的载体

利用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术可以进行基因功能研究以及作物遗传改良,但常规构建RNAi载体方法费时费力.本研究报道了一种基于USER酶一步法快速构建RNAi发夹结构的载体2301/RNAi/OS及其应用方法,操作简便,省时省力.与已报道的利用酶切连接、Gateway兼容的同源重组或PCR直接连接等构建RNAi载体相比,该载体不需要酶切片段,片段扩增完成后即可与制备好的线性化载体进行反应,缩短操作流程和时间,提高成功率;该载体对插入片段的酶切位点和长度没有要求,理论上任何位置和长度的片段均可进入2301/RNAi/OS载体中,尤其是长片段RNAi的构建.本试验以本氏烟(Nicotiana benthamiana)PDS(Phytoene desaturase)基因为例,利用农杆菌介导的瞬时表达体系验证了该RNAi能够在植物体内有效地实现基因沉默.该载体以新霉素磷酸转移酶基因(NPTII)作为筛选标记基因,可以利用卡那霉素(Kanamycin)和G418(Geneticin)等抗生素筛选转基因阳性植株,适合单子叶和双子叶植物的遗传转化.     

RNA沉默在植物与根结线虫互作基因研究中应用

基因沉默或RNA干扰（RNA interferance,RNAi）是双链RNA诱导的序列特异性基因沉默,是转录后水平上对基因的表达进行负调控。随着植物与根结线虫相互关系的研究的深入以及基因工程技术的发展,揭示了基因工程方法防治线虫危害的新途径。最近研究表明,dsRNA基因在植物体内表达,线虫取食这种转基因植物后线虫致病力下降并使植物有效抵抗多种根结线虫。这种转基因植物具有有效低抗线虫危害特性,而且其抗性是广谱的。该文对RNAi的研究历史、植物根结线虫抗性基因以及RNAi技术防治根结线虫的新途径等方面的研究进展进行了综述。     

植物中RNA干扰技术的研究与应用

RNA干扰(RNAi)是与靶基因同源的双链RNA引发的,在真菌、植物和动物中普遍存在的序列特异的转录后基因沉默(PTGS)现象。该方法的研究是目前分子生物学和基因工程领域研究的热点之一。作为反向遗传学研究的新工具,RNAi在基因功能研究、基因治疗以及病毒防治等方面发挥着巨大的作用,文章将RNAi的发现、作用机理、特点、导入思路和方法及其在植物中的广泛应用进行了综述。     

RNAi技术的研究进展和发展前景

生物体内导入双链RNA后会引起体内同源基因特异性的沉默,这种现象称为RNA干涉。文章主要介绍RNAi的特征、作用机制及应用等方面的情况。     

RNA干涉及其应用

在各种各样的真核生物当中,双链RNA(dsRNA)促使了有效的同源mRNA分子降解,这个过程被称为RNA干扰(RNAi)。RNAi现象通过调控RNA抑制基因表达,它在植物、动物、真菌中广泛存在,被认为是一种抑制病毒性复制和转座子活动的抗御机制,而在此过程中,侵染型病毒为了能够不被这种机制干扰抑制,继续在寄主体内生存、繁殖,则产生了一种反抗御机制———即产生抑制蛋白来对付转录后基因沉默(PTGS)。对RNAi以及RNAi抑制物的作用机制、抑制物类型、特点及相关应用方面作了比较详尽的综述。dsRNA介导的PTGS将是分子生物学领域的研究热点之一,在研究基因功能,基因治疗,抗病毒基因工程,解剖和调控次生代谢途径等方面有着广泛的应用前景。     

RNA干扰的研究进展

RNA干扰（RNAi）是一种由双链RNA诱发的转录后水平的基因沉默现象,是近几年发展起来的基因表达调节新机制,广泛地存在于真菌、植物和动物中。主要介绍了RNAi的发现、分子机制、转基因载体构建策略以及RNAi在生命科学中广阔的应用前景。     

双价RNA干扰载体的构建及dsRNA体外饲喂褐飞虱的研究

RNA干涉作为一种重要基因沉默技术,已广泛用于昆虫基因功能的研究。通过人工饲喂或显微注射dsRNA介导RNAi在许多昆虫中取得了成功。为利用RNAi技术进行褐飞虱防治研究,本试验通过重组PCR,获得了编码V-ATPase D亚基和编码V-ATPase H亚基基因片段的融合基因,在此基础上构建了该融合基因发夹结构的RNAi表达载体,通过体外合成dsRNA喂食褐飞虱若虫后导致褐飞虱体内目标基因的表达下降和死亡率的增加。因此双价RNAi载体的构建为利用RNA沉默技术进行植物抗飞虱研究奠定了基础。     

Compatibility with killer explains the rise of RNAi-deficient fungi

The RNA interference (RNAi) pathway is found in most eukaryotic lineages but curiously is absent in others, including that of Saccharomyces cerevisiae. We show that reconstituting RNAi in S. cerevisiae causes loss of a beneficial double-stranded RNA virus known as killer virus. Incompatibility between RNAi and killer viruses extends to other fungal species in that RNAi is absent in all species known to possess double-stranded RNA killer viruses, whereas killer viruses are absent in closely related species that retained RNAi. Thus, the advantage imparted by acquiring and retaining killer viruses explains the persistence of RNAi-deficient species during fungal evolution.     

RNAi在现代医学研究中的应用

简述了RNAi的作用机制,围绕其在肿瘤治疗、病毒感染性疾病治疗方面的研究进展进行了探讨,并对该技术运用在现代医学研究的潜在问题及前景进行了简要阐述。     

RNA interference in Colorado potato beetle(Leptinotarsa decemlineata): A potential strategy for pest control

Colorado potato beetle(CPB), Leptinotarsa decemlineata, is a notorious destructive pest that mainly feeds on the leaves of potato and several other solanaceous plants. CPB is widely recognized for its adaptation to a remarkable variety of host plants and diverse climates, and its high resistance to insecticides and Bacillus thuringiensis toxins. RNA interference(RNAi) is a sequence-specific, endogenous gene silencing mechanism evoked by small RNA molecules that is used as a robust tool for virus and pest control. RNAi has been extensively tested for CPB management by employing various target genes and delivery methods. This article reviews the screening of RNAi target genes, efficient RNAi delivery systems, and factors affecting RNAi efficiency in CPB, which may help understand the mechanisms of RNAi and its application in CPB control strategy.     

RNA干涉原理及其应用

RNA干涉是指外源dsRNA引发生物体内的基因的同源序列降解，从而表现出的基因转录后的沉默现象，它与植物中的共抑制和真菌中的基因压制可能具有相同的作用机制。在这一过程中，需要eIF2c类似蛋白因子、RNA螺旋酶、RNA依赖性RNA多聚酶、核糖核酸酶、ATP和转膜蛋白参与。RNA干涉可以用于功能基因组学研究，也可用于克服转基因生物的基因沉默现象，使外源基因在遗传改良生物中能更好地表达，还用于基因治疗，抑制有害基因的表达等。     

双链RNA激发的植物基因沉默及其在植物育种上的应用

在生物体内,存在大量的非编码RNA(ncRNA),小干扰RNA(siRNA)是其中一种,由双链RNA切割形成,能干扰基因表达,激发转录后的基因沉默。尽管双链RNA干扰是把基因"敲低"而不是"敲除",但它的高效和易操作性使之成为研究植物基因功能的有用工具,并通过转基因途径用于植物改良。与反义RNA技术和共抑制技术相比,RNA干扰对基因的沉默效率高,效果稳定。单基因RNA干扰就可调控多基因家族控制的农艺性状,而不必累积单基因突变。把病毒基因构建成反向重复结构转入植物体内,其转录出的RNA会通过分子内序列互补形成双链结构,激发转基因植物的RNA干扰机制,将入侵病毒的同源序列降解,使转基因植株获得对病毒的抗性。RNA干扰型抗病毒转基因植株中,转病毒基因的mRNA不存在或存在量很少,也不会翻译成有功能的病毒蛋白质,因此不存在病毒RNA重组、异源包装及协生作用的潜在生物风险,具有较高的生物安全性。     

植物基因沉默机制研究进展

综述了植物体中转录水平、转录后水平基因沉默及RNA干扰（RNAi）导致基因沉默的机制,并阐述了RNAi技术在植物基因工程中的广泛应用。     

甘蓝型油菜丙酮酸激酶基因RNA干扰载体的构建

采用基因芯片技术,从油菜中鉴定了一个油分积累优势表达基因即丙酮酸激酶（Pyruvate kinase, PK）基因。为构建甘蓝型油菜PK基因的RNA干扰（RNAi）载体,通过设计引物克隆了 PK基因长498 bp的 siRNA靶序列,连接到 pEASY-T1载体上,采用 NotI和XhoI酶切,酶切产物连接到本课题组新近改造的 RNAi 平台载体 pHurricane 的 NotI 和XhoI位点,通过多重 PCR 鉴定证实载体构建成功,然后将上述 PK基因反向重复框克隆到加入 napin启动子的 pCAMBIA1390表达载体相应的酶切位点上,构建具有种子特异性表达的PK基因的RNAi载体。限制性内切酶酶切证实载体构建成功,为进一步研究 PK基因参与决定油菜油分积累的分子机理和代谢调控奠定了基础。     

东亚三角涡虫DjStag基因干扰载体的构建及干扰效果鉴定

 构建DjStag基因的RNA干扰表达载体,诱导表达产生dsRNA后喂食涡虫,观察DjStag表达变化及对涡虫再生的影响。本文以含有东亚三角涡虫DjStag基因的pcDNA3 DjStag重组质粒为模板,经PCR 扩增目的片段,将其克隆到干扰载体L4440 上,构建重组质粒L4440 DjStag后转化入大肠杆菌HT115感受态细胞中, IPTG 诱导表达dsRNA后喂食涡虫。显微观察涡虫再生过程中的表型变化,Real time PCR检测干扰后涡虫DjStag基因表达的变化。结果表明,成功构建了DjStag基因的RNA干扰表达载体;DjStag基因 RNA干扰后,涡虫不能正常再生,再生片段显示出明显的再生缺陷;涡虫体内DjStag基因的表达受到抑制,DjStag mRNA的表达水平显著下降。     

玉米抗病毒基因工程研究进展

病毒病是导致玉米产量降低和品质下降的主要原因之一.在我国,玉米矮花叶病和粗缩病发生范围最广、危害最严重.基因工程技术可人为将抗性基因或部分片段定向导入植物获得转基因抗病毒植株,具有速度快、效率高等优点,在玉米抗病毒育种中具有重要的应用价值.文章在总结我国主要玉米病毒病及其病原种类的基础上,论述采用不同策略培育抗病毒玉米植株的研究进展,其中,利用植物病毒基因序列的策略有病毒编码蛋白基因介导的抗病性、RNA干扰(RNAi)介导的抗病性、人工小RNA(amiRNA)介导的抗病性3种,还可利用非植物病毒基因,包括寄主的抗性基因及来自其他植物、动物和微生物的抗病毒基因如核糖体失活蛋白、核酸酶、2-5A体系的基因等;最后分析各种策略的优缺点及抗病毒转基因玉米的安全性问题,为科研工作者优化玉米抗病毒育种工程、培育生产上可推广的抗病毒品种提供参考.     

萝卜过氧化物酶RNA干扰载体的构建及鉴定

萝卜过氧化物酶在植物的生长、发育和防御等多种生理生化过程中发挥着重要作用.利用RNA干扰技术(RNA interference RNAi)来研究酶功能已日渐成熟.本文根据植物hpRNA(hairpin RNA)的原理,以萝卜过氧化物酶基因rsprx1序列为靶目标, 选择 rsprx1的保守区作为构建RNAi序列,借助中间克隆载体,经过3次亚克隆,最后形成含 rsprx1-RNAi表达盒的双元表达载体pART27-Y2,并转入农杆菌EHA105.