百脉根起始结瘤相关转录因子间相互作用的鉴定

以模式豆科植物百脉根为材料,利用酵母双杂交和双分子荧光互补（bimolecular fluorescence complementation ,BiFC）技术,研究调控起始结瘤基因表达的转录因子IPN2、NSP2、CYCLOPS、DELLA间的相互作用。结果显示,百脉根IPN2与DELLA、NSP2与DELLA、CYCLOPS与DELLA均有相互作用。表明IPN2、DELLA可能参与并形成一个大的蛋白复合物,网络调控豆科植物起始结瘤基因的时空表达。     

百脉根小GTPase激活蛋白的鉴定及突变体分离

以豆科植物百脉根为材料,利用蛋白质相互作用技术、基因表达分析和突变体表型观察研究了小GTPase激活蛋白RacGAP1和RacGAP3在侧根及根瘤发育中的功能。结果表明:百脉根小GTPase激活蛋白RacGAP1和RacGAP3能与ROP6~(CA)相互作用,RacGAP1和RacGAP3基因主要在根微管组织中表达,在接种根瘤菌后呈下调表达趋势。RacGAP1在侧根及根瘤原基中无表达;RacGAP3则能在侧根及根瘤基部表达。RacGAP1和RacGAP3的LORE1插入突变体表型观察显示,纯合突变体与Gifu野生型共生表型无明显差异,但RacGAP1突变体植株开花后,花朵枯萎掉落不结荚,而杂合体与野生型无差异,表明RacGAP1可能参与调控花粉发育过程,而RacGAP3在早期共生过程中可能起负调控作用。     

百脉根4个共生基因在水稻中的共表达及其对水稻转录组的影响

为建立水稻-根瘤菌共生固氮体系,将百脉根共生信号转导途径中的4个功能基因(LHK1、NSP1、NSP2和NIN)转入水稻,获得稳定转化的转基因水稻,并初步检测转基因水稻的表型和转录组水平上的差异。根瘤菌感染试验结果显示,根瘤菌侵染对照(转入空载体)和转基因水稻的根毛和表皮的比率没有显著变化,但接种根瘤菌14d后,对照与转基因水稻的侧根原基数有显著差异,转共生基因水稻的侧根原基明显增多。利用水稻cDNA芯片,检测转基因水稻组与对照组在接种根瘤菌7d和不接种根瘤菌条件下根的转录组变化,结果显示,转基因组与对照组水稻在植物防御反应、激素信号转导途径相关基因均有差异性表达,表明豆科共生基因影响了水稻对根瘤菌的反应。     

豆科植物结瘤固氮及其分子调控机制的研究进展

作为人类重要的蛋白质和脂肪来源,以花生、大豆为代表的豆科植物是世界范围内农业生态系统的重要组成部分,而氮肥的合理施用是保证其稳产增产的主要因素。豆科植物能够通过与根瘤菌形成共生关系结瘤固氮,从而可以减少氮肥使用量。豆科植物的结瘤过程受到信号传递系统的调控。其中,硝酸盐信号作为信号分子来调控包括豆科植物结瘤自主调控和氮代谢途径在内的关键基因表达。研究发现许多基因参与豆科植物结瘤固氮调控,例如NIN、HAR1、NORK、NSP2等。豆科植物结瘤固氮的研究加深了人们对共生固氮的理解,为非豆科植物固氮改造奠定了基础,并为减少作物对氮肥的依赖和实现农业生产的可持续发展提供了新思路。调节豆科植物的结瘤平衡,充分利用豆科植物的固氮作用,探索最佳施氮量,有利于实现作物生产效益的最大化。本文根据国内外的相关研究,从以下四个方面进行综述：(1)豆科植物结瘤的分子调控机制;(2)豆科植物固氮的分子调控机制;(3)硝酸盐对豆科植物结瘤固氮的调控;(4)豆科植物固氮在生产中的应用。并对今后豆科植物结瘤固氮的研究趋势进行了展望。     

轮状病毒NSP1和NSP3蛋白真核表达载体构建、表达及其调控Ⅰ型干扰素信号通路的功能

[目的]旨在构建轮状病毒(Rotavirus,RV)非结构蛋白1(NSP1)和3(NSP3)真核表达载体,并在人胚肾上皮HEK239T细胞中表达,随后研究轮状病毒NSP1和NSP3在体外初步影响IFN-β/ISRE报告基因活性.[方法]首先合成猿轮状病毒SA11株NSP1、NSP3编码基因连接到克隆载体pUCm-T上,...     

百脉根结瘤信号通道蛋白NSP1和NSP2的转录激活作用

共生结瘤过程是根瘤菌与宿主植物交换信号分子的相互作用过程,结瘤信号通道蛋白基因NSP1和NSP2是结瘤因子诱导的共生信号转导途径的必要元件。LjNSP1和LjNSP2蛋白都包含植物所特有的GRAS结构域,推测为转录调节子,但缺乏明确的生化证据。为验证这一推测,本研究采用酵母双杂交系统,将两者分别融合到酵母GAL4转录因子的DNA结合结构域上,根据是否能激活报告基因的表达来验证它们的转录激活能力。结果表明LjNSP1和LjNSP2在酵母体内均具有转录激活的能力。为进一步确定转录激活的区域,对LjNSP1和LjNSP2构建了一系列的缺失突变,鉴别出转录激活区段均位于两者的N-末端的可变区域。为验证作为转录因子的LjNSP1和LjNSP2是否具有结合某种特定基因的启动子的能力,进行了酵母单杂交实验。其结果表明,LjNSP1和LjNSP2蛋白均能够结合根瘤起始基因NIN的启动子,但不能结合钙离子结合蛋白基因CBP1的启动子。     

根际微生态系统中豆科植物-根瘤菌共生固氮及其在可持续农业发展中的作用

豆科植物-根瘤菌共生固氮是根际微生态系统中一类特殊的植物-微生物共生体,是自然界最为重要的氮源.受施用高量氮肥带来的环境污染和资源浪费的影响,国际社会普遍重视豆科植物-根瘤菌共生固氮在可持续农业发展中作用的研究.本文简要综述了该领域近几年的研究进展以及作者的一些研究结果,探讨了豆科植物-根瘤菌共生固氮在间作和轮作种植制度中的作用及相应机制.     

豆科植物结瘤及其结瘤的分子基础

阐述了豆科植物与根瘤菌相互作用形成固氮根瘤 ,讨论了结瘤基因的组成、性质和功能及其翻译表达产物结瘤因子     

天冬氨酸转氨酶在中慢生根瘤菌MAFF303099共生固氮中的作用

为寻找根瘤菌中与共生固氮相关的调控基因,采用同源重组法,分别敲除中慢生根瘤菌MAFF303099在与豆科植物百脉根共生固氮过程上调表达的10个基因,研究它们对共生固氮的影响。结果显示:Δmlr5883敲除突变体相比于野生型MAFF303099,其固氮酶活性下降40%,侵染细胞形态未发生显著改变,对Δmlr5883回补可恢复固氮酶活性;预测mlr5883编码天冬氨酸氨基转移酶,体外检测该酶的天冬氨酸转氨酶活性为16.67 U/mg。该基因的突变会影响固氮效率,推测其可能参与对植物供给碳源的代谢过程。     

利用EMS筛选豆科模式植物百脉根的根瘤突变体及突变部位

豆科植物百脉根是研究共生固氮体系的模式植物之一,被根瘤菌感染后形成根瘤,根瘤菌固定氮素变换成铵态氮,植物利用铵态氮进行营养生长,而根瘤菌利用植物供给的碳酸同化产物为能源。为获得根瘤的成熟、维持的基因,本研究利用化学诱变试剂EMS处理百脉根MG-20得到多种突变体,筛选根瘤成熟、维持有异常的突变植株,利用SSR标记和dCAPS标记进行基因定位。结果表明:约10万M2百脉根植株中获得nup85突变体2株,nup133突变体4株,pollux突变体6株,ccamk、symrk、castor、nin、nfr1、nfr5突变体各1株等不结瘤突变体(Nod~-)18株;结无效根瘤突变体(Fix~-)6株并确定了突变体的突变部位。     

NSP4基因突变的重组牛轮状病毒的拯救及其鉴定

【目的】 通过反向遗传技术结合RNAi筛选和蚀斑克隆方法,拯救出毒力减弱的轮状病毒(rotavirus, RV)。 【方法】 以野生型轮状病毒CHLY基因组RNA为模板,通过重叠PCR方法在NSP4基因93-104 nt引入5个沉默突变核苷酸,并将毒力位点区135aa、136aa和138aa对应的核苷酸进行定向突变,构建了含有突变位点的转录质粒△pT7-NSP4/89/M。将该质粒与携带RNA聚合酶基因的重组质粒pcDNA3.1/T7-RNAP共转染已接种野生型RV病毒的MA104细胞单层,继续培养24 h,获得了携带NSP4变异基因的RV病毒粒子和野生型RV病毒粒子的混合病毒。将获得的混合病毒接种MA104细胞,通过RNA干扰和蚀斑克隆方法逐步筛选纯化以获得拯救RV。 【结果】 成功拯救出了NSP4基因变异的RV,该病毒在MA104细胞上的病变和致乳鼠腹泻效果较野生型RV明显减弱。【结论】 通过反向遗传技术结合RNAi筛选和蚀斑克隆方法成功拯救出毒力减弱的RV;NSP4毒力位点135aa、136aa和138aa的变异对RV毒力改变和腹泻严重程度有影响。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP9蛋白的亚细胞定位与功能预测

为了研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)非结构蛋白9(NSP9)的亚细胞定位,并探索NSP9蛋白在PRRSV复制过程中的定位变化,首先预测NSP9蛋白的生物信息学功能,之后将含有NSP9基因的质粒转染Marc-145细胞,并接种PRRSV,通过间接免疫荧光方法检测NSP9蛋白的表达与定位情况。功能预测结果表明,NSP9蛋白内部存在双向核定位序列、酰胺化位点、N-糖基化位点、酪蛋白激酶磷酸化位点、N-豆蔻酰化位点、蛋白激酶C磷酸化位点、细胞结合位点、酪氨酸激酶磷酸化位点、伸展蛋白重复区域、RNA聚合酶结合区域。间接免疫荧光检测结果显示,PRRSV感染之初,NSP9蛋白定位在Marc-145细胞质中,围绕在细胞核附近,随PRRSV感染时间延长,其逐步往细胞核内转移,转移的面积也逐步增多。可见,PRRSV感染会引起NSP9蛋白向核内转移。     

大麦日粮中添加NSP酶对仔猪消化机能的影响

以60头"杜长嘉"断奶仔猪为研究对象,研究了大麦日粮中添加NSP复合酶制剂对仔猪消化机能的影响.结果显示,添加NSP酶使仔猪十二指肠内容物中葡萄糖和胆汁酸含量分别提高了48.91%(P＜0.01)和73.50%(P＜0.01);空肠内容物粘度降低了6.31%(P＜0.05);空肠粘膜绒毛和微绒毛高度分别提高了50.00%(P＜0.01)和55.91%(P＜0.01),粘膜层变薄,为对照组的72.00%(P＜0.01).此外,大肠杆菌数和仔猪腹泻率也分别降低了69.80%和62.59%(P＜0.05).     

玉米-豆粕型饲料非淀粉多糖酶谱及酶解条件优化研究

【目的】筛选玉米 豆粕型饲料非淀粉多糖（NSP）酶谱,并对其酶解条件进行优化,以增加饲料中低聚糖的含量,获得具有抑菌特性的酶解产物,同时提高饲料的体外干物质消化率（IVDMD）。【方法】以还原糖含量为评价指标,通过L₁₈(3⁷)正交试验,研究不同用量5种NSP酶（纤维素酶110,220和330 U/kg,木聚糖酶176,352和528 U/kg,果胶酶331,662和993 U/kg,β-葡聚糖酶124,248和372 U/kg,β-甘露聚糖酶83,166和249U/kg）组合对玉米-豆粕型饲料的酶解效果,筛选最佳酶谱。探讨酶解温度（35,45,55,65 ℃）对饲料还原糖含量的影响,以及酶解时间（0,3,6,9,12,15,18,21,24 h）对饲料糖组分、抑菌效果、IVDMD的影响,确定最佳酶解条件。根据上述优化条件制备酶解饲料,将其与普通饲料及添加质量分数0.05%和0.10%防霉剂的饲料加入一定比例水后于25 ℃条件下进行贮存试验,比较各类饲料的抑菌效果。【结果】5种NSP酶的最佳配比为纤维素酶110 U/kg,木聚糖酶528 U/kg,果胶酶993 U/kg,β-葡聚糖酶372 U/kg,β-甘露聚糖酶249 U/kg。最佳酶解温度为55 ℃,此条件下饲料中的还原糖得率最高,可达17.98 mg/g。最佳酶解时间为15 h,此时酶解产生的低聚糖含量为78.65 mg/g,酶解产物对大肠杆菌的抑菌能力最强,同时对蜡样芽孢杆菌、沙门氏菌、植物乳杆菌等食源性致病菌也有明显的抑制作用;饲料IVDMD随酶解时间的延长呈升高趋势,15 h后基本达到平衡,为54.25%～56.25%。饲料贮存试验结果显示,普通饲料及添加0.05%防霉剂饲料在特定条件下放置2 d开始出现表观腐败现象,添加0.10%防霉剂组饲料和酶解饲料未出现表观腐败现象;酶解饲料中的细菌总数和大肠杆菌数均明显低于普通饲料和添加防霉剂饲料,但其对青霉菌无抑制作用。【结论】获得了玉米-豆粕型饲料的NSP酶解的酶谱及优化条件,NSP酶解能够显著提高玉米-豆粕型饲料的IVDMD,增加低聚糖含量,提高饲料的细菌抑制能力。     

公猪精液PRRSV变异株检测及NSP2、ORF5基因序列分析

用荧光RT-PCR方法从某猪场精液中检测到猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)变异株(NSP2 1 594～1 680 bp缺失)核酸阳性.提取1份阳性样品病毒核酸测定和分析其NSP2和OBF5全基因序列,结果表明NSP2基因由950个氨基酸组成,与CH-1a、VR-2332等经典PRRSV相比481位缺失1个氨基酸、532～560位连续缺失29个氨基酸,与JXA1、HUN4等毒株具有相同的缺失特性;ORF5基因第13、151位为具有强毒特性的精氨酸(R),存在4个潜在的糖基化位点,分别位于30～32、35～37、44～46和51～53位氨基酸.遗传进化分析表明,测定序列与JX-A1、HUN4等毒株关系最近,与CH-1a、NVSL等同属一个大分支,而与BJ-4、P129、RespPRRS MLV、VR-2332等处于不同分支.研究证实公猪精液可携带PRRSV变异株,因此猪场(群)在人工授精和引进精液时必须强化检疫和生物安全措施.     

早籼稻饲粮中添加NSP酶对生长猪生长与消化性能的影响

研究了早籼稻饲粮中添加NSP酶对生长猪生长与消化性能的影响。结果表明：与对照组比较,早籼稻饲粮中添加NSP酶制剂使生长猪日增重提高了8.78%(P<0.05),料重比降低了9.42%(P<0.05)。粗蛋白、粗脂肪和粗纤维的表观消化率分别提高了18.76%(P<0.01),16.04%(P<0.05),108.57%(P<0.05)。猪的腹泻率、粪便大肠杆菌数分别下降了37.00%(P<0.05)和81.29%(P<0.05);十二指肠、空肠和回肠内容物粘度分别降低了2.8%(P>0.05); 7.08%(P<0.01)和6.78%(P<0.01)。十二指肠内容物中总蛋白水解酶和α-淀粉酶活性分别显著提高了99.07%(P<0.01)和18.41%(P<0.05);胰蛋白酶和脂肪酶活力有升高趋势,但差异不显著(P>0.05)。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP9蛋白单克隆抗体制备与鉴定

根据NSP9非结构蛋白参数选取相应30 bp DNA片段,片段串联后人工合成并连接p ET-28a(+)载体,大肠杆菌BL21中表达得到可溶蛋白,镍柱亲和层析纯化后免疫Balb/c小鼠,取免疫鼠脾细胞与SP2/0细胞骨髓瘤细胞融合。细胞融合后利用间接ELISA法杂交瘤细胞阳性克隆筛选,2次亚克隆后共获得3株抗PRRSV NSP9单克隆抗体,命名为3B17、3J13、3F19。这3株单抗可与大肠杆菌表达的蛋白产物和PRRSV感染的Marc-145细胞发生特异性反应。在PRRSV感染的Marc-145细胞中,NSP9蛋白表达水平接毒后不断升高,48 h达最高,为深入研究NSP9功能奠定基础。     

NSP酶制剂对雏鹅血清生化指标和激素的影响

选择150只1日龄雏鹅进行28 d的饲养试验.研究了在基础日粮中分别添0.2%和0.4%的非淀粉多糖酶制剂(NSP酶制剂)后,NSP酶制剂对雏鹅血清生化指标和血清激素的影响.结果显示,0.2%与0.4%的NSP酶制剂对GLU(葡萄糖)浓度分别提高了19.47%和13.15%(P<0.05),TP(总蛋白)浓度分别提高了18.74%和22.52%(P<0.05),GPT(谷丙转氨酶)浓度分别提高了28.84%和32.91%(P<0.05);对UA(尿酸)、TC(总胆固醇)和TG(甘油三酯)浓度无显著影响(P0.05).0.2%与0.4%的NSP酶制刑对INS(胰岛素)的提高幅度分别为20.55%与22.83%(P<0.05),对T3(三碘甲状腺原氨酸)的提高幅度分别为17.60%与16.00%(P<0.05),对IGF-Ⅰ(胰岛素样生长因子-Ⅰ)的提高幅度分别为21.16%和18.30%(P<0.05).而对TSH(促甲状腺素)、GH(生长激素)、T4(甲状腺素)和GLu(胰高血糖素)均无显著的影响(P0.05).     

NSP酶制剂对雏鹅消化酶活性和盲肠微生物数量的影响

选择150只1日龄雏鹅进行28 d的饲养试验,研究了在基础日粮中分别添加0.2%和0.4%的NSP酶制剂对雏鹅消化酶活性和盲肠微生物数量的影响.对消化酶活性的研究结果显示,0.2%与0.4%的NSP酶制剂使十二指肠食糜胰蛋白酶活性分别提高了26.95%和31.71%(P＜0.05),十二指肠食糜淀粉酶活性分别提高了23.49%和19.94%(P＜0.05),空肠食糜胰蛋白酶活性分别提高了24.15%和29.50%(P＜0.05);空肠食糜淀粉酶活性分别提高了20.49%和19.94%(P＜0.05);而对胰腺胰蛋白酶、胰腺淀粉酶、胰腺脂肪酶、十二指肠脂肪酶、空肠脂肪酶、回肠淀粉酶和回肠脂肪酶的影响均不显著(P＞0.05).对小肠盲肠微生物数量的研究结果显示,0.2%和0.4%的NSP酶制剂对雏鹅盲肠大肠杆菌、双歧杆菌和乳酸杆菌数量的影响均不显著(P＞0.05).     

拟南芥电压依赖型阴离子通道参与水杨酸信号应答

电压依赖型阴离子通道蛋白(voltage-dependent anion channels, VDAC)是线粒体外膜分布的重要蛋白,参与形成线粒体通透性转换孔,控制线粒体内外的物质进出。以RLD拟南芥为材料,构建VDAC过量表达和抑制表达的转基因株系,初步探索VDAC在水杨酸(Salicylic acid, SA)信号传递途径中的作用。对转基因拟南芥种子进行SA处理的萌发实验,发现VDAC影响拟南芥种子对SA的敏感性：过量表达株系种子对SA敏感,萌发率较低,而抑制表达株系种子敏感性较低,萌发率高。用实时荧光定量PCR检测SA信号传递的Marker基因PR1,发现在过量表达株系中,伴随VDAC水平升高,PR1上调;同样在抑制表达株系中,VDAC降低,PR1下降。由此说明,VDAC参与了拟南芥SA信号传递。