ELISA方法鉴定转Bt基因抗虫棉

采用ELISA（酶联免疫）方法，对转Bt基因抗虫棉种子、子叶及苗期叶片中Bt毒蛋白的含量进行了测定，同时比较了两种不同pH值的样品提取缓冲液及不同的提取时间对测定棉花叶片中Bt毒蛋白含量的影响，以进一步完善测定转Bt基因抗虫棉Bt毒蛋白含量的ELISA方法，并探讨了ELISA方法鉴定转Bt基因抗虫棉的可行性。     

外源Bt杀虫蛋白和棉花主要抗虫萜烯类物质互作关系研究

 利用高效液相色谱 (HPLC)技术比较了不同生长时期转Bt基因棉花及其对照亲本不同器官中抗虫萜烯类物质含量的差异。显著性分析发现 ,外源Bt杀虫蛋白表达对棉花原有的棉酚、总杀实夜蛾素及总抗虫萜烯类合成量不存在不利的影响。以棉酚作为萜烯类物质代表物 ,在饲料中进行了棉铃虫幼虫对棉酚和Bt杀虫蛋白的复合剂量反应试验。结果表明 ,棉酚对棉铃虫幼虫的抗虫作用达到极显著水平 ,棉酚和Bt杀虫蛋白之间没有交互作用 ,表明饲料中棉酚和Bt杀虫蛋白对棉铃虫的抗虫作用是相加的     

延缓害虫对Bt毒蛋白耐受性的育种策略

在分析害虫对转Bt毒蛋白基因植株产生耐受性的特点、发生机制的基础上，重点探讨了为延缓害虫对Bt毒蛋白耐受性的育种策略：（1）培育双价或多价Bt毒蛋白抗虫品种；（2）寻找能使Bt毒蛋白基因在植物中高效表达的启动子；（3）使用组织特异型或诱导型启动子以减轻对害虫持续的选择压；（4）将Bt毒蛋白基因转入叶绿体基因组以解决原核与真核细胞对遗传密码子偏爱的不同；（5）通过突变等技术改变Bt毒蛋白一级结构，从分子水平延缓害虫产生耐受性。     

Bt毒蛋白在转基因植物中的表达

随着抗虫转基因植物的推广和大面积商业化种植,Bt毒蛋白在转基因植物中的表达引起了人们的重视。综述了玉米、棉花、水稻等抗虫转基因植物的Bt毒蛋白表达及其时空变化规律。     

不同类型抗虫棉花种质资源培育与利用分析

为有效控制棉花害虫对棉花的为害,石家庄市农林科学研究院从20世纪80年代开始利用远缘杂交、转基因技术和形态育种的方法开展了抗虫棉花种质资源的培育,先后育成了远缘杂交抗虫棉花种质石远321、转Bt基因抗虫棉花种质GK12、转Bt+Cp Ti基因抗虫棉花种质SGK321和具有形态抗盲蝽象特性的抗虫棉花种质晋棉-26。这些抗虫棉花种质被众多育种单位广泛应用,2004~2014年共育成通过审定的棉花品种152个,为我国棉花生产做出了重大贡献。     

转Bt基因抗虫棉Bt毒蛋白表达量的时空变化

采用抗体夹心ELISA技术 ,对转Bt基因抗虫棉植株中Bt毒蛋白含量进行了测定。结果表明 :Bt基因在所检测的器官中均有表达 ,但是不同器官中的Bt毒蛋白含量明显不同。在苗期全展功能叶中Bt毒蛋白含量最高 ,根、茎和叶柄中含量较低 ;不同生育期的功能叶中Bt毒蛋白含量差异显著。Bt毒蛋白含量在苗期叶片中最高 ,蕾期次之 ,花铃期最低。随着棉花生长发育进程的推进 ,Bt基因在叶片中的表达强度逐渐减弱。Bt基因在棉株体内的表达随着器官的不同 ,生育时期的不同而表现出时空动态变化。     

浅析抗虫基因种类及抗虫原理

概述了目前植物抗虫基因工程中应用较广的Bt毒蛋白基因、蛋白酶抑制剂基因、外源凝集素基因、淀粉酶抑制剂基因和动物源抗虫基因及抗虫原理,分析了抗虫基因植物面临的问题,提出了延缓害虫对转基因植物抗性的解决建议。     

转Bt基因玉米秸秆发酵对微生物菌系SFC-2的影响

当前,利用生物基因工程技术将外源抗虫基因导入玉米,使玉米自身产生抗虫蛋白而达到抗虫目的成为可能。为了明确转基因玉米携带Bt蛋白参与微生物发酵的安全性与效应,利用乳酸菌复合系SFC-2对转Bt基因及非转基因玉米秸秆进行接种,通过对发酵过程的pH变化、纤维素降解率、分解产物定性定量分析、Bt毒蛋白含量进行全程检测,并采用DGGE(变性梯度凝胶电泳)方法在分子水平上对发酵过程中的微生物遗传物质进行监测。结果表明,乳酸菌复合系SFC-2对转基因与非转基因玉米进行接种并发酵后,4种玉米秸秆的气味具有甜酸香味、色泽好、质地松散,且pH符合发酵饲料的要求;发酵体系中pH变化情况没有显著差异;可溶性糖含量变化无显著差异;气质联机分析表明,转Bt基因和非转基因玉米秸秆发酵过程中发酵产物种类无差异,乙醇、乙酸、乳酸及甘油产生量无显著差异;转Bt基因玉米在发酵过程中秸秆的毒蛋白含量呈现不断下降的趋势。本研究结果为转Bt基因玉米的合理利用和安全性评价提供了初步依据。     

转双Bt基因巨霸杨外源基因表达及抗虫性检测

为提高转基因杨树中Bt基因的表达效率并扩大抗虫谱,以同时转入Cry1Ac和Cry3A基因的转双Bt基因巨霸杨(Populus deltocdes‘55/56’×P.deltocdes‘2KEN8’)株系1年生苗为材料,对外源基因的表达和抗虫性进行检测。经PCR检测,证明目的基因已被整合到巨霸杨基因组中。利用荧光定量PCR和ELISA技术检测了4个转基因株系叶片中Bt基因的转录丰度和毒蛋白表达量。结果表明:不同株系间Bt基因的转录丰度存在显著差异,Cry3A基因的转录丰度显著高于Cry1Ac基因的转录丰度;2种Bt毒蛋白表达量在各株系间存在显著差异,Cry3A毒蛋白质量分数均显著高于Cry1Ac毒蛋白质量分数。各株系对鳞翅目害虫美国白蛾(Hyphantria cunea)幼虫抗虫效果不明显,且无显著差异;对鞘翅目害虫柳蓝叶甲(Plagiodera versicolora)表现出极高抗虫效果,且均显著高于转单基因Cry3A 741杨高抗株系CC84,不同株系间存在显著差异。     

转基因抗虫玉米Bt毒蛋白的时空表达分析

对2个转Bt基因玉米抗虫系株系进行Bt毒蛋白表达量的分析测定。结果显示,转基因株系中的毒蛋白可以在其后代稳定的遗传和表达,毒蛋白的表达为组成性表达,在玉米的各个发育时期和植株的各个部位均有表达,但其表达的量有显著差异,毒蛋白表达量随着植株的生长而减少,比较植株的各个器官,叶片毒蛋白含量最高,茎次之,根、种子和花丝中的毒蛋白含量较少。     

高温对转基因抗虫棉中Bt杀虫基因表达的影响

 Bt抗虫棉中Bt杀虫基因能否稳定表达是影响转基因抗虫棉应用前景和商品化生产的重要因素。以转基因双价抗虫棉139-20的R5代材料，通过不同温度处理，研究温度处理对Bt杀虫基因表达的影响。结果表明，温度变化影响抗虫棉早期的生长发育和Bt杀虫基因的表达，从而影响了抗虫棉生长发育过程中Bt杀虫蛋白含量降低的时间。高温处理后可使Bt杀虫基因在生长发育期中的沉默时间提前，导致Bt杀虫蛋白含量急剧降低，具体原因可能是由于转录后水平的基因表达调控，引起特异Bt 杀虫基因mRNA的降解。因此，在生产实际中，应予以提前采取措施，预防高温期棉铃虫危害。     

转Bt基因抗虫棉Bt基因表达的时空动态

以转Bt基因抗虫棉 33B为材料 ,利用ELISA检测方法 ,通过对棉株不同发育时期和同一时期的不同组织或器官Bt晶体蛋白含量的测定 ,研究了转Bt基因抗虫棉Bt基因表达的时空变化。结果表明 ,随着棉株生育进程的推进和株体的老化 ,Bt晶体蛋白含量随着植株体内可溶性总蛋白含量的逐渐降低而降低 ,而Bt基因的表达强度从苗期到蕾期随着棉株营养生长的加快而呈上升趋势 ,至蕾期达到高峰 ,以后逐渐减弱。不同组织或器官Bt晶体蛋白的含量也有较大差异 ,表现在幼嫩组织或器官的含量较高 ,成熟组织或器官次之 ,衰老组织最低。这说明Bt基因表达强度的减弱和Bt晶体蛋白含量的降低是转Bt基因抗虫棉生育后期抗虫性降低的根本原因     

Selection of Homozygous Cotton Lines Transformed with Two Insect-Resistant Genes

A plant expression vector containing a chimeric Bt29K gene coding for the activated Cry1Ac protein and the arrowhead proteinase inhibitior gene API-B were introduced into the cotton cultivar Jihe321 mediated by Agrobactertium tumefaciens. Based on the results of kanamycin resistant testing, PCR detection for both foreign genes and insect bioassay using Heliethis armigera, nine transgenic homozygous cotton lines with insect-resistance of more than 90% and better agronomic traits were bred through six generations from the original transgenic plants. Results from insect bioassay and sequence analysis of the PCR products of plants from some homozygous lines indicated that the chimeric Bt29K gene was stably inherited in these transgenic cotton lines. The main agronomic characters of these homozygous cotton lines, such as boll productivity and fibre strength, were better than that of the original cotton cv. Jihe321.     

逆境对转Bt+CPTi基因棉抗虫性的影响

以新研96-48及其转Bt+CPTi基因后的SGK36为材料,研究了不同逆境胁迫下快速生长的叶片对棉铃虫生长发育的影响。结果表明,寡照环境有助于转基因棉抗虫性的表达,干旱环境对转基因棉抗虫性影响较小,浸水环境不利于转Bt基因棉抗虫性表达。影响转基因棉抗虫性表达的主要原因可能与逆境导致转基因棉某些生理及形态的改变引发棉铃虫采食量变化有关。     

利用Dot-ELISA检测Bt棉杀虫蛋白的研究

用苏云金芽孢杆菌HD-1和HD-68晶体杀虫蛋白的碱溶产物作为抗原,制备相应的抗血清,建立了检测Bt杀虫蛋白的Dot-ELISA,可检测Bt杀虫蛋白的最低水平为87.5ng/ml。用Dot-ELISA对2个转基因抗虫棉和它们的亲本进行了检测,并与生物学测定的抗虫性进行比较,结果基本一致。因此,对测定大批量转基因抗虫棉的抗虫性,Dot-ELISA是一个快速、敏感、特异、有效的方法。     

Bacillus thuringiensis营养期杀虫蛋白Vip3与其转基因植物研究进展

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)是目前应用最多的生物杀虫剂。它能够产生多种杀虫因子,其中,最主要的是杀虫晶体蛋白(Insecticidal Crystal Proteins,ICPs)和营养期杀虫蛋白(Vegetative insectici-dal protein,Vip)。当前,大部分商业化利用的转基因作物均为杀虫晶体蛋白类,随着这些转基因作物种植面积的扩大,害虫对这些较为单一的杀虫蛋白产生抗性已成为一个严峻的问题。Vip3是Vip杀虫蛋白中的一类,不形成蛋白晶体,和ICPs在进化上没有同源性;其对鳞翅目、鞘翅目和同翅目等害虫具有毒杀作用,抗虫谱较广。目前,已经把Vip3基因导入了水稻、玉米和棉花等多种作物中,为作物抗虫育种、延缓害虫产生抗性和减少作物产量损失等带来新的前景。     

转Bt基因棉花秸秆对土壤多酚氧化酶、纤维素酶活性和毒素的影响

用转Bt基因抗虫棉秸秆和非转基因棉花秸秆分别处理同种土壤,在不同时期分析土壤多酚氧化酶、纤维素酶活性及土壤毒素的变化。结果表明:两个棉花秸秆处理之间及其与对照之间的土壤多酚氧化酶没有差异;两个棉花处理均可明显提高土壤纤维素酶活性,而以非转基因棉花秸秆处理的酶活性略高一些,但两者差异不显著;与对照相比,以非转基因棉花秸秆处理的土壤毒素略强一些,而转Bt基因抗虫棉秸秆处理与对照相差不大,说明转Bt基因抗虫棉秸秆不会增加土壤的毒素。因此,转Bt基因抗虫棉残留物对土壤多酚氧化酶、纤维素酶活性及毒素没有明显影响,该研究结果可为评价转Bt基因抗虫棉的安全性提供依据。     

cry2Ah-M基因杀虫活性研究

转Bt基因抗虫棉经过20多年的研究和生产应用,虽然取得了巨大的生态和经济效益,但棉铃虫的抗性风险也逐渐增加,因此,通过发掘不同杀虫机理的Bt基因,不仅可以提高杀虫效率,而且有效的避免或延迟昆虫的抗性。依据棉花遗传密码子偏好性,对来源于苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)新型Bt基因cry2Ah-like进行了密码子优化改造,利用农杆菌介导法导入烟草。通过荧光定量PCR方法,Southern blot和Western blot方法,证明了转基因烟草中外源基因在RNA和蛋白水平上均稳定表达,并且已整合到烟草基因组中。生物活性检测结果表明,饲喂转基因烟草叶片4 d后,棉铃虫幼虫校正死亡率达86.59%,达到高抗水平,进一步证明密码子优化后的cry2Ah-M基因能够高效表达且具有较高的杀虫活性,是有效防治棉铃虫的新型基因。     

转Bt基因抗虫棉的研究进展

对国内外转Bt基因抗虫棉的研究现状、存在问题及对策进行了探讨,其目的是为了正确地理解和认识转Bt基因抗虫棉,使我国的转Bt基因抗虫棉研究与推广工作得以健康发展。