大麦HvRBR基因克隆与序列分析#br#

【目的】从栽培大麦（Hordeum vulgare）中分离并克隆对植物细胞周期起负调控作用的RBR（retinoblastoma-related）,鉴定大麦RBR（HvRBR）分子特征,明确其与同源基因间的亲缘关系和分类地位,为探索动、植物生长发育过程中细胞增殖和分化相关调控途径的研究提供理论依据。【方法】通过对植物RBR生物信息学分析,根据RBR保守区域序列设计通用引物,采用PCR方法从栽培大麦DNA和苗期总cDNA中分别分段克隆,获得特征序列后在DNAMAN软件下进行序列分析、多重序列比对并构建系统树。【结果】从栽培大麦籽粒皱缩突变材料GSHO1854中获得全长为5 547 bp的大麦HvRBR序列（GU121481）,其cDNA编码区（GU121480）全长3 179 bp,包含一个编码975个氨基酸的开放阅读框。由其推导的氨基酸序列与已报道的RBR蛋白序列有较高的一致性。在A、B保守区之间有一个间隔区,虽然同源性较低,但是所有氨基酸序列的相似位点都包含一个半胱氨酸残基,这说明该半胱氨酸残基形成的分子内或分子间二硫键可能对整个RBR蛋白的结构和功能产生重要的影响。系统进化分析表明HvRBR与水稻同源性最高（84.3%）,与苜蓿、拟南芥等双子叶植物的同源性较低（50%）。【结论】首次从大麦中得到与植物细胞周期起调控、细胞增殖和分化相关的RBR蛋白编码基因HvRBR。对栽培大麦籽粒皱缩突变材料GSHO1854的HvRBR进行了分子克隆和鉴定,并通过系统进化分析将HvRBR归为植物RBR家族C亚族。     

大足黑山羊卵泡抑素cDNA的克隆、序列分析及组织表达

 【目的】旨在克隆大足黑山羊卵泡抑素（follistatin）的基因序列,并研究其在不同组织中的表达差异。【方法】采用RT-PCR方法从大足黑山羊卵巢组织总RNA中克隆出follistatin的cDNA序列,用相关软件进行序列分析,并利用real-time PCR技术检测follistatin基因在不同组织中的表达。【结果】序列分析表明,大足黑山羊follistatin的cDNA序列全长为1 217 bp,包括该基因完整的开放阅读框（open reading frame,ORF）1 035 bp,编码344个氨基酸。与牛的核苷酸序列比对同源性高达98%。real-time PCR结果表明,follistatin基因能在心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、卵巢和垂体中检测出来,在肾脏中表达量相对较高,在垂体中表达量较低。肾脏中follistatin mRNA含量显著高于垂体中follistatin mRNA含量（P＜0.05）;心脏中follistatin mRNA含量显著高于垂体中follistatin mRNA含量（P＜0.05）;其余各组织间follistatin mRNA含量差异均不显著（P＞0.05）。【结论】成功克隆出大足黑山羊follistatin基因cDNA序列,该基因在肾脏中的表达高于其它组织。     

蒺藜苜蓿低温胁迫响应基因MtbHLH-1的克隆及功能分析

【目的】克隆蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）低温胁迫响应基因MtbHLH-1,并对其进行序列特征分析,研究MtbHLH-1对牧草蒺藜苜蓿耐低温能力的影响。【方法】利用RT-PCR技术获得蒺藜苜蓿MtbHLH-1全长的cDNA序列。对该序列进行生物信息学分析,采用半定量RT-PCR研究MtbHLH-1的低温（4℃）表达模式。【结果】测序结果显示,cDNA片段全长778 bp,包含一个741 bp完整的开放阅读框,编码246个氨基酸残基,命名为MtbHLH-1,GenBank登录号为JN800447。氨基酸BLAST分析表明,MtbHLH-1氨基酸序列与已报道的其它植物（大豆、拟南芥、烟草、小麦和玉米等）bHLH氨基酸序列具有45%-73%相似性。半定量RT-PCR研究表明,MtbHLH-1在低温胁迫条件下上调表达。【结论】从蒺藜苜蓿中克隆了低温胁迫碱性/螺旋-环-螺旋转录因子MtbHLH-1,半定量分析表明其在蒺藜苜蓿抗冷过程中起作用。     

内蒙古绒山羊CRABP I基因的克隆及表达

【目的】克隆内蒙古绒山羊视黄酸结合蛋白Ⅰ（cellular retinoic acid binding proteinⅠ,CRABPⅠ）基因的cDNA,进行蛋白结构的预测和表达分析,为绒山羊毛和绒形成的分子机理奠定基础。【方法】利用RT-PCR方法克隆内蒙古绒山羊CRABPⅠ基因序列,利用生物信息学方法预测其蛋白结构,采用实时荧光定量PCR探讨该基因在绒山羊4个胎儿日龄皮肤中的表达。【结果】内蒙古绒山羊CRABP I基因cDNA长679 bp（JN936490）,其开放阅读框为414 bp,氨基酸序列与其它物种相比具有较高的序列相似性。CRABP Ⅰ蛋白无明显的信号肽和跨膜区域,不存在N糖基化位点和O糖基化位点;蛋白二级结构主要由α 螺旋、β折叠和少量的转角及无规则卷曲构成。胎儿皮肤中CRABPⅠ基因在 90 d 的表达量明显高于100、120和130 d（P<0.05）。【结论】绒山羊的CRABPⅠ基因cDNA中的开放阅读框（open reading frame,ORF）在不同物种间较为保守,但种属特异性集中表现在第33和123氨基酸残基处,该基因在胎儿期的90 d表达量最大。     

苎麻COMT基因的克隆及序列分析

利用RT-PCR法结合cDNA末端快速扩增（RACE）法从苎麻中克隆了与木质素合成相关的COMT基因的全长cDNA序列。所获得的COMT基因全长1318bp,包含一个开放阅读框1098bp,编码365个氨基酸。序列相似性检索结果表明,苎麻COMT全长cDNA与杨树COMT基因的序列同源性达82%,其编码的氨基酸序列与杏的COMT氨基酸序列同源性最高,达93%。同时还检索到该氨基酸序列包含一个O-甲基转移酶的保守结构。     

2个新的鳞翅目OR83b类化感蛋白基因的克隆和序列分析

【目的】分离和克隆昆虫触角中一类非常保守的嗅觉受体蛋白基因全序列。【方法】采用简并引物反转录多聚酶链式反应(RT-PCR)和cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆基因,用生物信息学方法对获得的cDNA全序列及推导的氨基酸序列进行分析。【结果】从甜菜夜蛾(Spodoptera exigua Hübner)和斜纹夜蛾[Spodoptera litura(Fabricius)]雄蛾触角中扩增得到2个分别为1906bp和2483bp的OR83类化感蛋白基因的cDNA,开放阅读框(ORF)编码473个氨基酸,命名为SexiOR2和SlitOR2。通过在GenBank中进行序列的同源性比较,发现这2个鳞翅目化感蛋白新序列与已知蛾类昆虫的OR83b类化感蛋白氨基酸序列具较高的同源性。【结论】明确了所获得的2个鳞翅目蛋白新序列属于OR83b类化感蛋白。     

亚洲玉米螟pdp1的克隆及功能分析

【目的】克隆获得亚洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）蛋白酶激活受体类转录因子pdp1（protease- activated receptor-domain protein1）（Ofpdp1）cDNA序列（GenBank登录号：KC857457）,明确其基因结构特征,并进一步研究该基因的表达特性及其在生长发育过程中的作用,为亚洲玉米螟的遗传控制提供潜在的靶标基因。【方法】采用RT-PCR和PCR技术,克隆Ofpdp1 cDNA序列,利用相关软件进行生物信息学分析;利用qPCR（quantitative real-time polymerase chain reaction）研究卵期及幼虫期Ofpdp1表达特征;在原胚期利用RNA干扰技术（RNAi）研究其生物学功能。【结果】克隆得到基因Ofpdp1,全长为960 bp,开放阅读框804 bp,编码267个氨基酸,同源比对发现OfPDP1 C-末端与其它昆虫PAR bZIP（basic leucine zipper）转录因子非常相似,含有3个高度保守的结构域,系统发育分析的分类结果与生物学上物种分类相吻合。qPCR结果显示Ofpdp1的mRNA表达量在卵发育76 h左右存在显著的表达高峰。在亚洲玉米螟原胚期,注射Ofpdp1的双链RNA（dsRNA）48 h后,Ofpdp1 mRNA表达量被沉默了71%。【结论】成功地从亚洲玉米螟中克隆得到Ofpdp1,Ofpdp1进化非常保守,属于PAR bZIP亚家族;Ofpdp1可能在幼虫定型时期胚胎生理结构的变化过程中起到重要作用。     

中国野葡萄锌指蛋白基因的克隆及生物信息学分析

【目的】在受白粉病菌侵染的中国野葡萄叶片中克隆锌指蛋白基因全长,研究葡萄抗白粉病的分子机制。【方法】在前期采用mRNA差异显示技术获得的中国野葡萄华东葡萄株系白河35-1抗白粉病基因表达差异cDNA片段T11GG/B0324-292的基础上,利用cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆了该cDNA全长序列,并结合生物信息学方法对所获取的序列进行分析。【结果】该cDNA全长2663bp(GenBank登录号HM008621),具有完整的开放阅读框,基因全长2223bp,编码1个由740个氨基酸组成的锌指蛋白(Zinc finger protein),5′和3′非翻译区长度分别为395和44bp。多重比较分析表明,该基因推导的氨基酸序列与拟南芥、蒺藜苜蓿、水稻的C3H亚型CCCH型锌指蛋白的同源性分别为61%,70%和60%。【结论】利用RACE技术获得了锌指蛋白基因全长,为进一步研究锌指蛋白基因与葡萄抗白粉病的关系奠定了基础。     

RACE法克隆巴什拜羊SP-A基因及序列分析

【目的】为扩增巴什拜羊的肺表面活性物质相关蛋白A(Pulmonary surfactant-associated protein A,SP-A)基因cDNA全长序列并对该序列进行分析。【方法】根据已报道的GenBank中绵羊SP-A基因的开放阅读框序列来设计RACE引物,后用RACE法对巴什拜羊SP-A基因的3'端和5'端序列进行扩增,经华大公司测序和DNAMAN软件拼接最终得到巴什拜羊的SP-A基因cDNA序列全长。【结果】克隆得到SP-A基因的cDNA其全长为1962 bp,其开放阅读框序列长度为789 bp,编码的氨基酸数量为262,经DNASTAR软件分析其蛋白的分子量为27.53 kDa,等电点4.949。分析系统进化树后发现巴什拜羊与绵羊氨基酸的序列同源性最高。【结论】本研究结果可为后续更加深入研究新疆巴什拜羊SP-A基因的功能奠定基础。     

紫花苜蓿抗逆基因MsDUF的克隆及其功能分析

【目的】克隆紫花苜蓿（Medicago sativa L.）抗逆新基因MsDUF,并对其进行序列特征分析,了解该基因在逆境胁迫下的表达模式。【方法】利用RACE法获得紫花苜蓿MsDUF全长的cDNA序列,对该序列进行生物信息学分析;用基因枪法进行MsDUF的亚细胞定位分析;采用实时荧光定量PCR研究该基因在高含量NaCl和PEG-6000的胁迫下,以及ABA和GA3诱导下的表达模式。【结果】测序结果显示,该基因cDNA全长714 bp,包含一个633 bp的完整开放阅读框,编码210个氨基酸,命名为MsDUF,GenBank登录号为JX183734。氨基酸BLASTP分析表明,MsDUF氨基酸序列与拟南芥、大豆和蒺藜苜蓿等具有53%—98%的相似性,属于DUF4228 superfamily。实时荧光定量PCR研究表明,该基因在逆境胁迫下上调表达。【结论】从紫花苜蓿中克隆了抗逆相关基因MsDUF,发现其定位于细胞质中,实时荧光定量PCR结果分析表明该基因在紫花苜蓿的抗逆反应中起着重要作用。     

橘小实蝇谷氨酸脱羧酶的生化及分子特性

【目的】在测定橘小实蝇（Bactrocera dorsalis）γ-氨基丁酸（GABA）含量和谷氨酸脱羧酶（GAD）活性的基础上,克隆获得橘小实蝇GAD基因（BdGAD1）全长序列,进一步解析GABA、GAD以及BdGAD1在橘小实蝇各发育阶段、成虫不同体段以及经阿维菌素刺激后的表达模式,分析橘小实蝇GAD对阿维菌素作用的应激反应,为系统解析GABA介导的阿维菌素抗药性机制提供基础数据。【方法】采用高效液相色谱法测定橘小实蝇体内GABA含量,分析阿维菌素刺激对GABA含量的剂量和时间效应;以谷氨酸为底物,采用微量滴度酶标板法测定橘小实蝇经阿维菌素刺激后GAD活力的变化;通过同源序列比对的方法,从橘小实蝇转录组数据中筛选出1条GAD基因片段,利用cDNA末端快速扩增技术（RACE）获得该基因的全长cDNA序列;应用生物信息学分析软件对该基因的开放阅读框、编码的氨基酸序列、分子量等信息进行预测,并基于最大似然法构建该基因与其他昆虫相关基因序列的系统发育树,明确其系统进化关系。此外,分别提取橘小实蝇各发育阶段和成虫不同体段的RNA,以表达稳定的α-Tubulin为内参基因,应用qPCR技术,解析BdGAD1在橘小实蝇各发育阶段（卵、幼虫、蛹和成虫）和成虫不同体段（头、胸、腹）以及经阿维菌素刺激后的表达模式。【结果】经阿维菌素刺激后,橘小实蝇体内GABA含量升高,且与阿维菌素剂量及处理时间呈正相关,暗示橘小实蝇可能通过调节GABA含量以抵御阿维菌素的毒害。同时,橘小实蝇体内GAD的比活力也随药剂剂量增加而升高。通过RACE扩增,获得了橘小实蝇BdGAD1的cDNA全序列,长度1 755 bp,开放阅读框1 197 bp,编码398个氨基酸,GenBank登录号为KC763804。基于最大似然法构建的系统发育树显示,该基因编码的蛋白质与冈比亚按蚊的GAD亲缘关系最近,序列一致性高达97%。qPCR分析结果表明,BdGAD1在幼虫期表达量最高,不同体段间相比较发现该基因在成虫腹部的表达量最高。经阿维菌素刺激后,BdGAD1表达水平上调。【结论】BdGAD1的表达具有发育阶段和体段特异性。阿维菌素能够刺激橘小实蝇体内BdGAD1表达水平上升,进而引起GAD活力增加促使虫体合成产生大量的GABA,这可能是橘小实蝇抵御阿维菌素毒害甚至产生抗药性的原因。     

水稻瘤矮病毒基因组第6片段（S6）序列测定与分析

 【目的】了解水稻瘤矮病毒（RGDV）基因组结构与功能。【方法】根据已报道的RGDV基因组各片段末端序列及其反向重复特性，采用4轮RT-PCR的方法扩增RGDV基因组第6片段（S6），用生物学软件进行序列分析。【结果】得到了该病毒S6的全序列。S6全长1 651 bp，G+C含量39.13%，包含一个长的ORF，起始于第25位，终止于第1 497位，编码490个氨基酸，分子量为53.3 kD。 【结论】该蛋白与伤瘤病毒（WTV）的P7的相似性为30.0%，与水稻矮缩病毒(RDV)的P7的相似性为31.7%。这是RGDV S6全序列的首次报道。     

黄曲条跳甲JH诱导蛋白基因的克隆与表达分析

【目的】克隆黄曲条跳甲保幼激素诱导蛋白（Juvenile hormone-inducible protein,Ps-jhip-1）基因,并分析其表达特征。【方法】克隆黄曲条跳甲Ps-jhip-1基因,对其进行系统发育分析,并对其编码蛋白进行生物信息学分析。利用荧光定量PCR方法分析Ps-jhip-1基因在黄曲条跳甲不同组织器官及1个生物钟周期内表达量的变化趋势。【结果】成功克隆了Ps-jhip-1全长cDNA,其长度为1 252 bp,开放阅读框为1 230 bp,编码409个氨基酸。Ps-jhip-1基因编码蛋白具有典型的类蛋白激酶C超家族的蛋白功能域,不具备保幼激素膜受体分子的特征。系统发育分析结果表明,Ps-jhip-1与同为鞘翅目昆虫赤拟谷盗的8种JH诱导蛋白基因聚为一支。荧光定量PCR结果表明,Ps-jhip-1基因mRNA在黄曲条跳甲雌雄成虫的多种组织器官中都有表达,其中在触角和头部的表达量相对较高,而在中足和后足的表达量相对较低,约为触角表达量的6%;Ps-jhip-1基因mRNA表达水平在1个生物钟周期内存在4个下调表达时段,但并未表现出明显的节律性特征。【结论】成功克隆了黄曲条跳甲Ps-jhip-1基因,并分析了其在不同组织及1个生物钟周期内表达量的变化。     

扩展莫尼茨绦虫β微管蛋白基因的克隆及序列分析

[目的]从扩展莫尼茨绦虫中克隆β微管蛋白基因,进行序列测定和生物信息学分析,为进一步研究该基因的功能奠定基础.[方法]构建扩展莫尼茨绦虫成虫cDNA文库,随机挑取重组阳性克隆进行测序,对部分序列进行引物步移法测序,获得其全长cDNA序列;采用生物信息学等技术对该cDNA序列进行开放阅读框(ORF)的寻找、编码氨基酸的推导、核苷酸和氨基酸同源性比较以及蛋白二级结构的初步预测.[结果]获得了1个扩展莫尼茨绦虫新基因——β微管蛋白基因,全长1571 bp,编码444个氨基酸,与日本血吸虫的β微管蛋白氨基酸序列具有78.6;的同源性.编码蛋白的理论分子量为49.6 ku,等电点为4.96;1 -4位氨基酸MREI为β微管蛋白转录后调控信号,140～146位GGGTGAG存在一个微管蛋白标志信号片段,在99～106位和391～410位存在两个典型的β微管蛋白保守区;亚细胞定位分析其为细胞的骨架蛋白.[结论]获得了扩展莫尼茨绦虫β微管蛋白基因的全长cDNA序列,为该基因功能的实验性鉴定工作奠定基础.     

扩展莫尼茨绦虫蛋白激酶C相互作用蛋白(PICK1)基因的克隆及序列分析

[目的]分离和鉴定扩展莫尼茨绦虫(Monieziaexpansa)新基因,为进一步研究该基因的功能奠定基础.[方法]构建扩展莫尼茨绦虫成虫cDNA文库,随机挑取重组阳性克隆进行测序,对部分序列进行引物步移法测序,获取其全长cDNA序列;采用生物信息学等分析技术对该cDNA序列进行开放阅读框(ORF)的寻找、编码氨基酸的推导、核苷酸和氨基酸同源性比较及蛋白质二级结构的初步预测.[结果]获得了1个扩展莫尼茨绦虫新基因蛋白激酶C相互作用蛋白,全长1 527 bp,编码447个氨基酸,CDS预测存在明显的BAR,PDZ结构域.编码蛋白的理论分子质量为50.173 3 ku,等电点为5.22.[结论]获得了扩展莫尼茨绦虫蛋白激酶C相互作用蛋白的全长cDNA序列,为该基因功能的试验性鉴定工作奠定基础.     

苹果NADP依赖的苹果酸酶基因克隆、序列和表达分析

【目的】克隆苹果（Malus×domestica B.）中苹果酸代谢的关键酶基因MdNADP-ME,进行序列特征分析,研究MdNADP-ME在苹果中组织表达的情况。【方法】利用RT-PCR技术获得苹果MdNADP-ME1,2,3全长的cDNA序列。对该序列进行生物信息学分析,采用荧光实时定量PCR技术研究MdNADP-ME1,2,3的组织表达。【结果】测序结果显示,获得的3个NADP-苹果酸酶基因（MdNADP-ME1、MdNADP-ME2 和 MdNADP-ME3; GenBank 登录号为JX971883、JX971884和JX971885）,其ORF分别为1 512、1 782和1 926 bp,推测其分别编码503、593和641个氨基酸的多肽。氨基酸序列和结构分析显示,这3个基因均含有5个保守的氨基酸区域（motif I-V）,含有2个功能结构域：malic和NAD_bind_1_malic_enz。进化树分析结果显示,MdNADP-ME1 和MdNADP-ME2属于双子叶植物细胞质NADP-ME型,MdNADP-ME3属于双子叶植物质体NADP-ME型。荧光实时定量PCR结果表明,MdNADP-ME1-3在被检测的组织中均有表达,但表达差异明显。【结论】MdNADP-ME1-3属于植物NADP-ME家族,结构高度保守,并且在苹果的不同组织中有不同表达模式。     

桃果实磷脂酶Dα基因的电子克隆及序列分析

 【目的】克隆桃果实中的磷脂酶Dα基因,并对其进行序列分析和低温表达模式分析。【方法】采用电子克隆与RT-PCR相结合的方法分离桃果实PLDα 基因cDNA全长序列;半定量RT-PCR和Northern杂交检测目的基因在桃果实低温贮藏过程中的表达情况。【结果】成功获得全长为2 859 bp的桃果实PLDα基因序列,该序列具有完整的开放阅读框架（ORF,172～2 604 bp）,编码810个氨基酸。对ORF进行的RT-PCR验证结果与电子克隆序列一致。序列分析显示,桃果实PLDα基因编码的氨基酸序列与草莓、番茄、葡萄等物种的磷脂酶Dα氨基酸序列之间具有高度的保守性,含有N端C2结构域及两个保守的活性中心。半定量RT-PCR和Northern杂交分析显示,桃PLDα基因在低温贮藏过程中被诱导表达。【结论】本研究首次通过电子克隆的方法获得了桃果实PLDα基因的全长序列,揭示了其序列特征,并初步明确了其在桃低温贮藏期间的表达模式。结果证明基于EST数据库的电子克隆已经是获取植物新基因的有效途径,同时为更深入研究桃果实的耐冷性及低温贮藏方法奠定了基础。