棉花GhCCR4基因表达载体构建及GUS基因的瞬时表达

研究以GUS基因为报告基因,构建CCR4基因的瞬时表达载体,首先酶切带有CCR4基因的 pGEM-T-CCR4载体,获得CCR4基因目的片段,然后将其克隆到瞬时表达载体pGUS/NIa中,获得由CaMV35S启动子调控目的基因的pGUS-CCR4融合表达载体,使目的基因能够和GUS基因同时表达.采用基因枪法将pGUS-CCR4转化到洋葱表皮细胞中,暗培养24 h,经GUS组织化学染色,检测到多个洋葱细胞呈现蓝色,表明构建的瞬时表达载体可在植物细胞中高效表达.为进一步在棉花中研究GhCCR4基因的功能奠定了实验基础.     

棉花GhCAD6基因表达载体构建及GUS基因的瞬时表达

[目的]以GUS基因为报告基因,构建GhCAD6基因的瞬时表达载体.[方法]采用PCR方法和基因枪法.[结果]用PCR法,以pGEM-T-CAD6质粒为模板,获得GhCAD6基因目的片段.然后将其克隆到瞬时表达载体pRTL2-GUS/NIa中,获得由CaMV35S启动子调控目的基因的pGUS-CAD6融合表达载体,使目的基因能够和GUS基因同时表达.采用基因枪法将pGUS-CAD6转化到洋葱表皮细胞中,暗培养24 h,经GUS组织化学染色,检测到多个洋葱细胞呈现蓝色.[结论]构建的瞬时表达载体可在植物细胞中高效表达,为进一步研究棉花GhCAD6基因的功能奠定了实验基础.     

利用透明颤菌血红蛋白基因vgb改造毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K的研究

为了解决酵母发酵时贫氧限制目的蛋白表达量,利用透明颤菌血红蛋白基因vgb设计毕赤酵母分泌 型表达载体pPIC9K-vgb,并以人乳铁蛋白基因为目的基因转入毕赤酵母GS115。研究结果表明,该表达载体具 有转化操作简单、后期工程菌筛选简便、菌体耐低氧能力强、目的蛋白摇瓶表达量高等优点。该表达载体也可 以通过直接替换目的基因而用于其他蛋白表达系统的开发研究。     

pcDNA3.1-GFP-LC3B真核表达载体的构建

[目的]构建含G FP-LC3B基因的真核表达载体.[方法]从HEK293细胞中提取总RNA,以反转录得到cDNA为模板,根据Gen Bank公布的人源LC3B基因序列设计引物,通过PCR方式扩增目的基因,将基因和pcDNA3.1-GFP载体双酶切后,通过T4连接酶将基因连接到pcDNA3.1-GF载体上,得到cDNA3.1-GFP-LC3B真核表达载体.[结果]扩增出目的基因,构建了含目的基因的真核表达载体cDNA3.1-GFP-LC3B.[结论]成功构建了含有人LC3B基因的真核表达载体pcDNA3.1-GFP-LC3B,为研究细胞自噬提供了基础.     

乙型肝炎病毒X基因真核表达载体的构建

目的：构建HBVX基因与pCI-neo相融合的高效真核表达载体。方法：设计并合成HBVX基因的引物,以HBVDNA阳性血清PCR扩增得到HBVX基因全序列,将X基因连接到真核表达载体pCI—neo上后,酶切图谱分析、PCR检测和扩增产物序列分析等,鉴定所构建的真核表达载体。结果：以重组载体为模板扩增得到的片段大小与已知HBVX基因大小相同,酶切也得到目的基因片段,测序结果也显示与已知X基因序列相同。结论：成功构建了HBVX基因的真核表达载体,为进一步研究HBVX基因及其产物的功能奠定了基础。     

盐穗木HcGKR基因亚细胞定位表达载体的构建及定位分析

[目的]以GFP基因为报告基因,构建HcGKR基因的亚细胞定位表达载体.[方法]采用PCR方法和基因枪法.[结果]用PCR法,以pGEM- T- HcGKR质粒为模板,获得HcGKR基因的目的片段.然后将其克隆到亚细胞定位表达载体35S:GFP中,获得由CaMV35S启动子调控目的基因的35S - GFP - HcGKR融合表达载体,使目的基因能够和GFP融合同时表达.采用基因枪法将35S - GFP - HcGKR转化到洋葱表皮细胞中,暗培养24 h后,经共聚焦显微镜观察确定发出绿色荧光的位置,对HcGKR基因进行亚细胞定位.[结论]构建的亚细胞定位表达载体可在植物细胞中表达,通过洋葱细胞中绿色荧光的位置确定目的基因定位在细胞膜上,为进一步盐穗木HcGKR基因的功能奠定了理论基础.     

RT-PCR克隆广谱抗病基因NPR1及其蛋白表达载体构建

[目的]克隆植物广谱抗病基因NPR1并构建其蛋白表达载体。[方法]提取拟南芥总RNA,设计相关引物,采用反转录PCR方法克隆NPR1基因;利用酶切连接方法,将该基因正向导入蛋白表达载体。[结果]经过相关检验,将NPR1正向插入pMXB10载体中,得到了pMXB10-NPR1蛋白表达载体。[结论]成功构建了包含NPR1的蛋白表达载体。     

RT-PCR克隆广谱抗病基因NPR1及其蛋白表达载体构建

[目的]克隆植物广谱抗病基因NPR1并构建其蛋白表达载体。[方法]提取拟南芥总RNA,设计相关引物,采用反转录PCR方法克隆NPR1基因;利用酶切连接方法,将该基因正向导入蛋白表达载体。[结果]经过相关检验,将NPR1正向插入pMXB10载体中,得到了pMXB10-NPR1蛋白表达载体。[结论]成功构建了包含NPR1的蛋白表达载体。     

无选择标记的甜瓜a-ACO1基因植物表达载体的构建及对烟草的共转化效果

从植物表达载体pCB-aACO1的T-DNA区段上切去nptⅡ基因,构建了无选择标记植物表达载体pCD-aACO1,其T-DNA区段只含有目的基因a-ACO1和GUS基因.从另一植物表达载体pCAMBIA2301的T-DNA区段切去GUS基因,构建了植物表达载体pCAMBIA2302,其T-DNA区段其只含有nptⅡ基因.用这2种新载体共转化烟草,在对40株抗性转基因烟草的PCR检测中,有14株扩增出a-ACO1基因,共转化率为35%.     

牛fabp3和fabp4基因真核表达载体的构建 及在小鼠成肌细胞中的表达

【目的】分别构建牛fabp3和fabp4基因真核表达载体,并观察载体转染小鼠成肌细胞后基因的表达以及对内源fabp3和fabp4基因表达的影响,检测肉质性状形成相关基因在转基因细胞中的表达及对内源功能基因的影响。【方法】 以pDsRED质粒为骨架载体,分别将人肌红蛋白启动子与目的基因相连、CMV启动子与红色荧光蛋白报告基因相连构建肌肉特异性表达fabp3基因的载体pDsHF3和表达fabp4基因的载体pDsHF4;用脂质体瞬时转染小鼠成肌细胞,72 h后用2%孕马血清诱导成肌细胞向肌管的分化;利用real-time PCR技术检测转染前后成肌细胞中外源牛fabp3和fabp4基因和内源小鼠fabp3和fabp4基因的表达量。【结果】与对照组相比,小鼠成肌细胞分别转染pDsHF3和pDsHF4表达载体,24 h后外源牛fabp3和fabp4基因均获得高水平的表达,48 h后有所回落;而内源小鼠fabp3和fabp4基因在成肌细胞和诱导分化的肌管细胞中的表达均受到不同程度的影响。【结论】构建的真核表达载体能在成肌细胞中高效表达,外源牛fabp3或fabp4基因的转入能够影响小鼠成肌细胞及肌管中内源fabp3和fabp4基因的表达。     

三种鸭防御素真核表达载体的构建及其表达分析

为研究鸭防御素的真核表达,人工合成了鸭防御素AvBD2、AvBD10和AvBD12基因,并将其插入到真核表达质粒pDoubleEx-EGFP-flag-N中构建重组表达质粒;重组表达质粒经酶切鉴定正确后,分别转染HEK293细胞进行表达,用RT-PCR和Westem-blot鉴定目的基因的表达情况。结果表明,酶切鉴定证实目的基因成功插入到真核表达质粒中;真核表达质粒转染HEK293细胞24 h后,在荧光显微镜下可见绿荧光蛋白表达;RT-PCR能检测到目的基因mRNA,但Western-blot没有检测到目的蛋白的表达条带。     

SQR基因在大肠杆菌和乳酸菌中的表达

为了研究硫化物-醌氧化还原酶(SQR)基因的乳酸菌表达载体pMG36e-SQR-Myc的构建及其在大肠杆菌DH5a和乳酸菌MG1363中的表达,通过限制性内切酶酶切大肠杆菌-乳酸菌穿梭表达载体pMG36e与目的片段SQR-Myc,回收纯化并用T4连接酶进行连接,连接产物通过KCM法转化到大肠杆菌DH5a中,提取所得到阳性大肠杆菌菌株质粒pMG36e-SQR-Myc进行双酶切鉴定与普通PCR鉴定;并通过电转化将重组质粒导入乳酸菌MG1363中,采用SDS-PAGE电泳和Western-blotting检测SQR蛋白质在其中的表达情况。结果显示,SQR乳酸菌重组表达载体pMG36e-SQR-Myc被成功构建,目的蛋白质SQR在大肠杆菌和乳酸菌MG1363中被成功检测到。因此,乳酸菌MG1363可以用来表达硫化物-醌氧化还原酶(SQR)。     

猪Cathepsin B基因和Cystatin B基因mRNA表达的发育性变化及组织差异

 【目的】研究猪肉嫩度性状候选基因-组织蛋白酶B（cathepsin B,CTSB）和半胱氨酸蛋白酶抑制素B（cystatin B,CSTB）在体内不同组织、不同发育阶段的表达变化规律,为研究嫩度性状的遗传调控机理提供依据。【方法】采用荧光探针RT-PCR,定量分析CTSB和CSTB mRNA在两个品种猪的多个组织、多个发育时间点的表达量。【结果】RT-PCR结果表明,CTSB和CSTB mRNA表达量最高的组织为肾脏,心肌和骨骼肌中表达丰度低,股四头肌CSTB mRNA表达量极显著高于背最长肌。CTSB mRNA表达量在0～5月龄长白猪和梅山猪背最长肌中表现出先升高后降低的变化趋势,梅山猪峰值出现较早,并在4月龄后再次出现急剧上升。CSTB mRNA表达量在梅山猪中表现出生初期较高,随后逐渐降低的表达模式,长白猪的表达模式则为出生后表达量急剧升高,2月龄达到峰值,随后逐渐降低。2品种猪背最长肌组织CTSB和CSTB mRNA表达量表现出显著正相关。【结论】CTSB和CSTB mRNA表达量受到组织、发育阶段和品种影响,2基因mRNA表达量呈显著正相关。     

拟南芥ERF转录因子基因应答非生物胁迫表达模式

以122条拟南芥(Arabidopsis thaliana)ERF转录因子家族基因为研究对象,用RT-q PCR检测其应答盐胁迫情况,分析15个盐胁迫敏感基因在盐、干旱和ABA胁迫条件下的表达模式。在盐胁迫条件下,有36个基因上调表达,42个基因下调表达,44个基因无明显变化。其中,15个盐胁迫敏感基因在不同胁迫条件下表现出不同的表达模式。在盐胁迫条件下,15个ERF基因的表达水平随胁迫时间的延长均表现出明显升高,在36和72 h两个时间点达到极显著水平。在ABA胁迫条件下,15个ERF基因中大多数表达水平提高。在干旱胁迫下,15个ERF基因表达水平均随胁迫时间延长有所提高,在48 h达到最高。AT1G06160、AT1G21910、AT2G35700、AT4G17490、AT4G39780和AT5G61890等6个基因在非生物胁迫条件下表达模式相似,表明其可能参与相似的基因调控途径。其他9个ERF基因在非生物胁迫下表现出不同的表达模式,表明其可能参与不同基因调控途径。     

6个小麦抗叶锈病近等基因系的cDNA-AFLP差异表达分析

应用cDNA-AFLP技术对小麦抗叶锈病近等基因系TcLr9、TcLr15、TcLr19、TcLr25、TcLr38、TcLr45和感病亲本Thatcher间的表达差异进行分析,共选用226对引物组合对其进行筛选,检测出7 554条条带,平均每对引物可获得33条扩增条带。筛选出68对引物能够在小麦抗叶锈病近等基因系TcLr9、TcLr15、TcLr19、TcLr25、TcLr38、TcLr45和感病亲本Thatcher之间扩增出特异表达条带,特异表达检出率为30.1%。68对引物共扩增出84条特异表达条带,并根据基因表达与否及表达量划分为9种不同的特异表达类型(I~IX)。其中,I、V和VII型特异表达类型为组成型表达,共49条;II、IV、VI和VIII型特异表达类型表达上调,共21条;III和IX型特异表达类型表达下调,共14条。有5种特异表达类型(IV、V、VI、VII、VIII型)可能与小麦的抗病反应相关,并且这5种特异表达类型又分为两类亚型,第一类亚型是小麦抗叶锈病近等基因系与小麦叶锈菌互作时特异表达(I V型)或者表达量明显增加(VI、VIII型),为诱导性特异表达类型;第二类亚型为组成型特异表达类型(V、VII型)。     

板栗氮素营养与花性的表现

在板栗不同物候期间对其叶片,芽和枝皮中的蛋白态氮,非蛋白态氮和蛋白质氨基酸等进行测定,结果表明：能分化雌花的芽比只能分化雄花的芽含较多的非蛋白态氮和蛋白态氮,不同性别表现的新梢叶片非蛋白态氮含量及利用的时机不同,结果母枝上雌性表现区段枝皮比只有雄性表现区段枝皮中含较多的非蛋白态氮,氮素营养中以非蛋白态氮与雌性表现关系密切,花芽与叶芽中组成蛋白质的氨基酸种类没有差别,即花性表现与所测的１７种蛋白质氨     

拟南芥β-1,3-葡聚糖酶基因(BG1)在不同组织及非生物胁迫下的表达研究

[目的]研究拟南芥β-1,3-葡聚糖酶基因(BG1)在不同组织及胁迫条件下的表达规律.[方法]研究以拟南芥为材料,以28S rRNA为内参,利用半定量RT-PCR法研究了低温(4℃)、高温(37℃)、NaCl胁迫(200 mmol/L)和与之等渗的PEG(21.5;)干旱胁迫处理在不同组织(叶、薹、花、果)ep BGl的表达情况.[结果](1)正常植株中,BG1在不同组织的表达量不同:花、果>叶>薹.(2)胁迫处理对BGI的表达量有影响.在叶中,盐胁迫不影响其表达,其他处理都使其表达量减少;在薹中,除低温处理使其表达量明显增加,其他情况的表达都减少,37℃和干旱胁迫后几乎不表达;在花中,NaCl胁迫处理后表达量明显增加,PEG处理及高温胁迫后表达量下降;在果实中,BGI在PEG胁迫后表达量稍有增加,而37℃和盐胁迫表达稍有下降.[结论]在正常植株中,BG1的表达具有差异性;BG1对各种胁迫处理的响应不同.     

家蚕Notch信号通路基因的表达研究

[目的]研究家蚕Notch信号通路基因的表达情况。[方法]在实验室前期工作的基础上,用特异引物对家蚕的Notch信号通路上下游基因进行克隆,并对这些基因在家蚕5龄幼虫不同组织部位的表达进行研究。[结果]这些基因在各组织的表达量不同,其中fringe和groucho在家蚕头部表达量较多,在丝腺、精巢、卵巢中的表达量较少;notch在家蚕尾部表达量较少,在其他组织中表达量无明显差别。[结论]该研究为进一步研究家蚕Notch信号通路奠定了基础。     

粳稻杂种后代胚乳淀粉分支酶基因表达特性分析

选用籽粒直链淀粉含量有显著差异的亲本和杂种后代,分析籽粒灌浆过程中直链淀粉积累和淀粉分支酶活性以及淀粉分支酶基因mRNA表达量等变化特点。结果表明,直链淀粉含量高的亲本及后代在灌浆过程中合成和积累的直链淀粉量显著高于直链淀粉含量低的亲本及后代;直链淀粉含量高的亲本及后代的淀粉分支酶活性均比直链淀粉含量低的亲本及后代高,灌浆不同时期的籽粒直链淀粉含量与淀粉分支酶活性间均呈正相关;亲本及杂种后代籽粒OsSBE1和OsSBE3的mRNA表达量随灌浆进程逐渐增加,达到峰值后又逐渐下降,呈单峰曲线变化,其表达量峰值都出现在抽穗后17 d,在灌浆过程中胚乳OsSBE4基因的mRNA表达量相对比较小;杂种后代籽粒淀粉分支酶基因mRNA表达量随籽粒直链淀粉含量的变化发生变化,且能超亲表达;直链淀粉含量和淀粉分支酶活性高的基因型其SBE1和SBE3的mRNA表达量也高,低的基因型其mRNA表达量也低,SBE4的表达量与此相反。