鱼类干扰素系统的初步研究

根据哺乳类β-干扰素基因的保守区合成了两对简并引物。用其中的一对(5’TCCTGC／TTGTGC／TTTCTCCACN3’和5’GTCTCAT／GT／ACCAG／CCCAGTGCN3’)作PCR引物。从草鱼(Ctenopharygodon idellus)DNA中扩增获得了一预期大小的片段(约278bp)。Southern杂交的结果表明该片段与人的β-干扰素基因有一定的同源性。     

鱼类干扰素系统的初步研究(英文)

根据哺乳类β－干扰素基因的保守区合成了两对简并引物。用其中的一对（5’TCCTGC／TTGTT／TTTCTCCACN3’和5’GTCTCAT／GT／ACCAG／CCCAGTGCN3’）作PCR引物，从草鱼（Ctenopharygodonidellus）DNA中扩增获得了一预期大小的片段（约278bP）。Southern杂交的结果表明该片段与人的β－干扰素基因有一定的同源性。     

巴夫杜氏藻β-肌动蛋白基因的克隆和分析

[目的]获得巴夫杜氏藻β-肌动蛋白基因cDNA全长序列。[方法]以巴夫杜氏藻cDNA为模板,采用简并引物进行PCR扩增,获得533bp特异cDNA片段。在此基础上,设计特异引物,采用5’-Genome Walking和3’-RACE的方法,获得基因的5’-端DNA序列和3’-端cDNA序列,进而获得β-肌动蛋白基因cDNA全长序列。[结果]获得了巴夫杜氏藻β-肌动蛋白基因的特异cDNA片段、5’-端DNA和3’-端cDNA片段。经拼接后,扩增出全长cDNA。β-肌动蛋白基因cDNA全长1754bp,包括1137bp的开放读码框和617bp的3’-非翻译区序列。氨基酸序列相似性分析发现,巴夫杜氏藻β-肌动蛋白氨基酸序列与杜氏盐藻、莱茵衣藻等的同源性较高。系统发育分析表明,巴夫杜氏藻β-肌动蛋白与杜氏盐藻的相似性最高。[结论]首次获得了巴夫杜氏藻β-肌动蛋白基因cDNA全长序列,并发现巴夫杜氏藻β-肌动蛋白基因非常保守。     

5种植物花瓣ACS基因的克隆与分析

分析已发表的植物1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC）合成酶（ACS）基因序列,设计一对简并引物,在随机选择的非洲菊、月季、桂花、茶梅和山茶等5种植物花瓣cDNA中进行PCR扩增．结果表明,在5种植物花瓣中都能扩增出约800bp的特异片段,登录GenBank发现均未被注册,因此将序列提交到GenBank并获得了序列号．在NCBI上进行Blast比对,发现所克隆的5个Acs基因均与其他植物花瓣的ACS基因有一定的序列相似性,最高达94％,最低为80％．将5个ACS基因的片段进行多序列比较分析,发现茶梅ACS基因与山茶ACS基因的序列差异最小,序列相似性达99％．本试验设计的ACS基因简并引物在植物中有一定的通用性,后续可以适当调整引物的简并度,以得到高通用性的简并引物．     

我国鸡传染性支气管炎病毒地方分离株的形态观察和S1基因的RT-PCR扩增

参照已发表的IBVBeaudette株全基因组序列 ,自行设计合成了 3条引物 (youl 、you2 -、youM ) ,引物you1 和you2 -在S1基因两侧 ,跨幅约 16 10bp ,引物you2 -和youM 在S1基因的 3’端 ,跨幅约 5 30bp。用这两对引物对 5个IBV地方分离株 (HN2 ,HN4,JX1,SC2和SC1)进行RT -PCR ,均成功地扩增出相应大小的目的片段。病毒在电镜下观察可见到形态多变的冠状病毒粒子     

简并引物设计与大戟科3种植物WAX基因片段的克隆

在大戟科3种重要经济植物木薯、蓖麻、小桐子中,扩增WAX基因片段。利用CODEHOP方法设计简并引物,同时在3种植物中提取高质量的总RNA并反转录为cDNA,结果扩增在3种植物中得到特异性片段,克隆测序,并采用生物信息学技术进行序列分析。结果证明CODEHOP简并引物设计科学。同时证明WAX基因的保守性较高,在大戟科3个物种中同时得到了WAX基因片段序列信息,具有较高同源性。为以后WAX基因研究奠定重要基础。     

巴夫杜氏藻β-肌动蛋白基因的克隆和分析(英文)

[目的]获得巴夫杜氏藻β-肌动蛋白基因cDNA全长序列。[方法]以巴夫杜氏藻cDNA为模板,采用简并引物进行PCR扩增,获得533 bp特异cDNA片段。在此基础上,设计特异引物,采用5′-GenomeWalking和3′-RACE的方法,获得基因的5′-端DNA序列和3′-端cDNA序列,进而获得β-肌动蛋白基因cDNA全长序列。[结果]获得了巴夫杜氏藻β-肌动蛋白基因的特异cDNA片段、5′-端DNA和3′-端cDNA片段。经拼接后,扩增出全长cDNA。β-肌动蛋白基因cDNA全长1 754 bp,包括1 137 bp的开放读码框和617 bp的3′-非翻译区序列。氨基酸序列相似性分析发现,巴夫杜氏藻β-肌动蛋白氨基酸序列与杜氏盐藻、莱茵衣藻等的同源性较高。系统发育分析表明,巴夫杜氏藻β-肌动蛋白与杜氏盐藻的相似性最高。[结论]首次获得了巴夫杜氏藻β-肌动蛋白基因cDNA全长序列并发现巴夫杜氏藻β-肌动蛋白基因非常保守。     

巴夫杜氏藻β-肌动蛋白基因的克隆和分析

[目的]获得巴夫杜氏藻β-肌动蛋白基因cDNA全长序列。[方法]以巴夫杜氏藻cDNA为模板,采用简并引物进行PCR扩增,获得533 bp特异cDNA片段。在此基础上,设计特异引物,采用5′-GenomeWalking和3′-RACE的方法,获得基因的5′-端DNA序列和3′-端cDNA序列,进而获得β-肌动蛋白基因cDNA全长序列。[结果]获得了巴夫杜氏藻β-肌动蛋白基因的特异cDNA片段、5′-端DNA和3′-端cDNA片段。经拼接后,扩增出全长cDNA。β-肌动蛋白基因cDNA全长1 754 bp,包括1 137 bp的开放读码框和617 bp的3′-非翻译区序列。氨基酸序列相似性分析发现,巴夫杜氏藻β-肌动蛋白氨基酸序列与杜氏盐藻、莱茵衣藻等的同源性较高。系统发育分析表明,巴夫杜氏藻β-肌动蛋白与杜氏盐藻的相似性最高。[结论]首次获得了巴夫杜氏藻β-肌动蛋白基因cDNA全长序列并发现巴夫杜氏藻β-肌动蛋白基因非常保守。     

猪羊生长激素基因保守性研究

生长激素基因在猪羊间的差异 ,通过两对引物 ,分别为P1:5’ -agctggattctttacggctgagcc - 3’和P2 :5’ -tccggaagcaggagagcagaccgtag - 3’ ,P3:5’ -gctgacacctacaaggagtttg - 3’和P4:5’ - gtttgcttgaggatctgtcctg - 3’。对它们的DNA进行聚合酶链反应 ,电泳及序列分析结果表明 :P1-P2和P3-P4引物都能扩增出猪羊DNA样 ,得到大小一致的扩增带 (对应引物的带 ) ,但southern杂交结果的差别很大 ;生长激素基因的碱基组成在猪羊间的差异为 6 5 % ,即猪羊生长激素基因保守性很强     

山羊LHβ基因多态性与产羔数的相关分析

【目的】研究布尔山羊和西农萨能奶山羊LHβ基因多态性及其与产羔数的相关性。【方法】采集布尔山羊和西农萨能奶山羊的血样,针对LHβ基因5′调控区及3个外显子设计6对引物,利用PCR-SSCP技术检测LHβ基因在6个位点上的多态性,并用最小二乘法研究该基因多态性与产羔数的关系。【结果】引物P1与P5扩增片段具有多态性,引物P1扩增产物有PP、PQ和QQ 3种基因型,P5扩增产物有LL和LM 2种基因型,其余4对引物的扩增片段没有多态性。LHβ基因P1引物位点PP与QQ基因型相比,PP型在第153 bp处发生了C→A突变;引物P5位点LL与LM基因型相比,LL型在第64 bp处发生了T→C突变,2处突变均未导致氨基酸变化,为沉默突变。在引物P1位点,布尔山羊PP型个体第3,4胎产羔数均极显著高于PQ型个体(P<0.01),西农萨能奶山羊PP型个体第4,5胎产羔数均显著高于PQ型个体(P<0.05);在引物P5位点,布尔山羊LL型个体第4,5胎产羔数分别极显著(P<0.01)和显著(P<0.05)高于LM型个体,西农萨能奶山羊LL型个体第5胎产羔数极显著高于LM型个体(P<0.01)。【结论】引物P1与P5扩增片段具有多态性,引物P1和P5位点可能对山羊的产羔数有影响。     

一种实用的双链RNA病毒基因组克隆方法

以克隆水稻矮缩病毒(Rice dwarf virts,RDV)基因组片段S11、S12为例,报道一种克隆植物dsRNA病毒基因组的方法.具体过程为:利用T4 RNA连接酶将5′-磷酸、3′-氨基修饰的引物Primer 1连接到RDV病毒基因组第11、12片段dsRNA的3′-OH端,经逆转录、退火、补齐形成全长双链cD-NA,使用单一的互补引物Primer 2进行PCR扩增,扩增产物克隆在pMD 18-T载体上,对重组子进行两次限制性内切酶分析,结合序列测定分离鉴定S11、S12.结果表明,这种方法能同时克隆RDV基因片段S11、S12,是一种有效实用的dsRNA病毒基因组克隆方法.     

利用CODEHOP设计简并引物克隆镰刀菌果胶酶基因片段

利用CODEHOP(Consensus-degenerate hybrid oligonucleotide primers)设计真菌果胶酶基因片段的简并引物,并对设计的多对引物进行筛选,比较了普通PCR和Touchdown-PCR(TD-PCR)程序的扩增效果,并对产物进行了测序、比对和分析。结果表明:利用CODEHOP设计简并引物可信性强,阳性率高,能够从供试菌株中获得与目的片段大小相近的产物。利用TD-PCR程序扩增比普通PCR扩增效果好。扩增产物序列BLASTX比对和分析结果表明,产物片段编码的氨基酸序列与镰刀菌属来源的果胶酶氨基酸片段相似性均超过90%,说明所扩增的序列即为镰刀菌果胶酶基因片段。     

苏云金芽孢杆菌cry1Da5基因的克隆与表达

采用5对引物组合经2轮PCR扩增对苏云金芽孢杆菌QL75-2菌株中的cry基因进行鉴定,克隆得到1个cry1Da型基因片段。通过设计全长引物扩增得到该cry基因的全长序列,转入原核表达载体pET-28a中,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达,最后对表达蛋白进行生物活性分析。序列分析结果表明,该cry1Da基因全长3 495 bp,推测其编码1 164个氨基酸,组成分子量约132.01 ku的蛋白质。该预测蛋白质与已知的Cry1Da3蛋白质具有最高的序列同源性(99.7%),该基因被国际杀虫晶体蛋白基因命名委员会正式命名为cry1Da5。生物活性分析结果表明,Cry1Da5蛋白质对鳞翅目的甜菜夜蛾幼虫具有较强的杀虫活性,其LC_(50)为21.47μg/mL,而对鳞翅目的棉铃虫幼虫无杀虫活性。因此,cry1Da5基因可作为一个新的cry基因资源在甜菜夜蛾的生物防治中应用。     

黄瓜性别基因连锁的分子标记筛选

利用RAPD(random amplified polymorphic DNA)技术对黄瓜性别特异基因进行分子标记连锁研究。共选用300个10碱基的随机引物按BSA法对黄瓜性别表型分离群体进行PCR扩增,筛选出5个在全雌和弱雌株基因池(gene pool)中表现多态性的引物。单株检测表明,引物B11具有全雌特异性,在检测的大多数全雌性单株中均可扩增出一条约1000bp的特征带。而在雌雄同株的单株中则未见。因此,将该全雌性特异的片段命名为B11-1000。该标记的获得为黄瓜性别特异基因的分离和克隆奠定了基础。另外,以ACC合酶基因(CSACS1)特异引物检测分离群体单株,发现该酶基因存在于所有性型的单株中,不具有性别特异性。     

大豆7S球蛋白(α+β)-亚基缺失型种质的α-与β-亚基基因的测序与分析

 【目的】明确大豆7S球蛋白（α+β）-亚基双缺失特性是否是由于α-与β-亚基基因的缺失或变异引起的。【方法】聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析和α-与β-亚基基因的PCR扩增、克隆、测序和序列比较。【结果】该种质α-亚基基因特异性引物的PCR扩增结果与对照基本一致,β-亚基基因的则与对照不同。α-亚基基因扩增片段与对照的同源性较高,为90.9%, 二者的区别主要存在于扩增片段的5′-端;β-亚基基因间的同源性较低,仅为53.1%。另外,在该材料β-亚基基因扩增片段的两端,检测到一对短的反向重复序列。【结论】该种质α-与β-亚基同时缺失的特性不是由α-与β-亚基基因的缺失引起的;α-与β-亚基基因的扩增序列与对照存在一定的差异,基因序列间的差异是否为导致α-与β-亚基缺失的直接原因,尚需进一步研究确认。     

Epstein-Barr病毒胸苷激酶（TK）基因表达质粒的构建

目的：构建高效表达EBVTK的重组克隆体系。方法：以pUC8X为模板，5'-CTGAATTCATG—GCTGGATTTCC-3’及5’CAACTGCAGCCTAGTCCCGATT-3’为引物，用PCR技术扩增出EBVtk基因的DNA片段。EcoR I／Pst I双酶切PCR产物和载体pBV220，T4连接酶使目的基因tk定向克隆至选定质粒pBV220中。结果：重组质粒pBV220-tk经EcoR I／Pst I双酶切后得两条电泳带分别位于1．8kb、3．6kb处；以pBV220-tk为模板，两引物同上进行PCR扩增，产物电泳带于1．8kb处。结论：目的基因tk已定向克隆至质粒pBV220中。     

水稻类黄酮3''-羟化酶基因克隆及植物表达载体的构建

参考GenBank中发布的水稻品种日本晴位于10号染色体的F3’H基因序列设计特异引物,用PCR方法从水稻基因组中克隆F3’H基因片段,并将该片段克隆到pMD18-T载体进行测序和序列分析。结果表明,克隆的F3’H基因全长1 789 bp,GenBank登录号为HQ876708,该基因与日本晴基因组序列同源性为100%。分别将F3’H基因插入植物双元表达载体pPZP2Ha3(-)和pPZP2Ha3(+)中,获得F3’H基因正义和反义植物表达载体,同时转入根癌农杆菌中。该研究为利用农杆菌介导法转化F3’H基因,进一步研究F3’H基因功能奠定基础。     

梭梭HaACT基因片段的克隆和3’UTR序列分析

【目的】以克隆HaACT基因为出发点,为进一步分析其表达特点奠定基础。【方法】根据NCBI上已发表的藜科其他植物肌动蛋白(Actin)序列的保守区设计一对简并性引物,以梭梭(Haloxylon ammodendron)同化枝为材料提取总RNA,采用RT-PCR法和3’RACE技术克隆了HaACT基因部分片段及3’UTR序列。【结果】得到HaACT基因片段1 107 bp,该序列编码257个氨基酸,3’UTR序列长度为416 bp。使用NCBI和DNAMAN软件对3’UTR序列进行了同源性分析。HaACT基因3’UTR序列与CaACT基因3’UTR序列的相似性高达93%,与BvACT基因3’UTR序列相似性为92%,与GhACT基因3’UTR序列相似性最低,为86%。【结论】HaACT基因与其他植物Actin基因可能具有相似的调控机制。     

苏云金杆菌杀虫晶体蛋白基因crylA的克隆及特征分析

苏云金芽孢杆菌猝倒亚种(Bacillus tburingiensis subsp sotto)对鳞翅目幼虫有高毒力。根据crylA类基因序列设计特异引物，应用PCR技术从该茁株中扩增得到一大小约为3．6kL的DNA片段。将获得的片段克隆至pGEM7zf中并转化大肠杆菌DH5α。在ABI PRISM377自动测序仪上对其5’及3’端进行部分测字，结果表明其核苷酸序列与crylA基因高度同源。     

蝴蝶兰2种病毒的同步检测及其CP融合反义表达载体构建

【目的】建兰花叶病毒(CyMV)和齿兰环斑病毒(ORSV)是侵染蝴蝶兰最主要的2种病毒,给蝴蝶兰产业造成巨大经济损失。本文建立了快速检测这2种病毒的方法,并为培育同时抗CyMV和ORSV的蝴蝶兰新品种奠定基础。【方法】根据2种病毒CP基因序列设计了2对特异性引物,运用RT-PCR方法同时检测这2种病毒,利用反义RNA技术构建2种病毒CP基因的融合表达载体。【结果】利用设计的特异性引物检测12株蝴蝶兰样品,有25%同时检测出2种病毒,在同一PCR反应体系中,扩增出2个目的条带清晰无杂带。从感病蝴蝶兰叶片总RNA中克隆出CyMV CP基因的125 bp片段和ORSV CP基因的164 bp片段。将CyMV的CP基因片段以3’→5’方向与表达载体p CAMBIA1300连接,命名为p CAMBIA1300-CyMV,经酶切及菌落PCR鉴定可获得125 bp的小片段;再将ORSV的CP基因片段以3’→5’方向与p CAMBIA1300-CyMV连接,命名p CAMBIA1300-CyMV-ORSV,经酶切及菌落PCR鉴定可获得289 bp的片段。【结论】所设计的2对特异性引物能够在同一PCR体系中快速高效地检测出CyMV和ORSV,含2种病毒CP基因的反义融合表达载体构建成功。