野油菜黄单胞菌野油菜致病变种一个新的致病相关基因的克隆和鉴定

野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xcc)是十字花科植物重要的病原菌,能引起十字花科作物发生黑腐病.本课题组采用转座子Tn5gusA5对Xcc野生型菌株8004诱变,获得17280株Tn5gusA5突变体,并从中筛选到一批致病缺陷突变体,采用TAIL-PCR对致病缺陷突变体的Tn5gusA5插入位点进行定位,发现5株突变体的Tn5gusA5插在8004菌株的基因组ORF1857内(未发表资料), 该ORF功能尚未见报道.序列分析表明,ORF1857演绎的编码产物与铜绿假单胞菌(Pseudomonase aeruginosa)的wbpL基因演绎的编码产物具有33%的一致性和45%的相似性,并具有第4家族的糖基转移酶功能域,因此本文暂将ORF1857命名为wbxL基因.对 wbxL基因进行缺失,获得的缺失突变体用剪叶法接种到寄主萝卜叶片时,缺失突变体完全丧失致病性,一段PCR合成的包含wbxL基因的DNA片段能互补缺失突变体,恢复缺失突变体的致病性.这证实wbxL基因是Xcc的一个新的致病相关基因.     

野油菜黄单胞菌的XopR基因功能

野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv.campestris,Xcc)是一种能够引起十字花科植物产生黑腐病的重要病原菌。笔者以野油菜黄单胞菌Xcc8004菌株XopR基因为研究对象,通过qRTPCR发现,XopR基因的表达受Ⅲ型调控基因hrpG和hrpX的调控,并且XopR蛋白的分泌依赖于Ⅲ型分泌系统结构基因hrcV,这表明XopR是Xcc8004的一个Ⅲ型分泌效应蛋白。利用同源重组的方法,笔者获得了XopR基因的缺失突变体ΔXopR。将野生型Xcc8004和ΔXopR突变体分别接种甘蓝品种中甘15、中甘21和大白菜品种中白83,发现ΔXopR突变体菌株致病性下降,表明XopR对于Xcc8004在甘蓝上的完整毒性是必须的。GFP融合蛋白分析发现XopR定位于拟南芥原生质体的细胞膜上,可以在拟南芥原生质体中抑制细菌鞭毛蛋白诱导的FRK1基因表达。     

野油菜黄单胞菌的HpaA基因功能

野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv.Campestris,Xcc)是使十字花科植物产生黑腐病的重要病原细菌。Xcc通过Ⅲ型分泌系统分泌效应蛋白到植物体内帮助Xcc的侵染和繁殖。Hpa A蛋白是一个广泛存在于黄单胞菌中的效应蛋白,在辣椒斑点病菌(Xanthomonas campestris pv.vesicatoria,Xcv)中,Hpa AXcv85-10已经被证明是一个Ⅲ型效应蛋白,并且参与其他效应蛋白的分泌过程,但是在Xcc中,对Hpa A的功能还不是了解得很清楚。本研究以Xcc8004菌株的Hpa A蛋白为研究对象,通过分泌蛋白检测和亚细胞定位分别研究Hpa AXcc8004是否也由Ⅲ型分泌系统分泌以及Hpa AXcc8004在植物细胞的作用部位。结果表明,Hpa AXcc8004的分泌依赖于Xcc8004的Ⅲ型结构基因hrc V,暗示着Hpa AXcc8004也是作为Ⅲ型分泌效应蛋白来发挥功能。在拟南芥原生质体细胞中,将Hpa AXcc8004与GFP蛋白融合表达,发现Hpa AXcc8004定位于植物细胞核中。进一步通过同源重组的方法获得了Xcc8004 Hpa A基因缺失突变体,在寄主甘蓝、萝卜、拟南芥上分别接种野生型Xcc8004和Hpa A基因缺失突变体,发现基因缺失突变体毒性显著降低,表明Hpa AXcc8004在上述寄主植物上对于Xcc8004的完整毒性是必须的。在Hpa A的拟南芥转基因植株上,Hpa AXcc8004还可以减弱假单胞菌DC3000和Xcc8004发黄的表型。     

十字花科黑腐病菌中假定糖基水解酶基因与致病力相关研究

[目的]已报道的十字花科黑腐病菌Xcc 8004菌株基因组中XC1077被注释编码一个假定糖基水解酶,初步研究XC1077基因的致病性,为深入研究Xcc 8004中的糖基水解酶在植物病原菌侵染及定殖过程中的作用奠定基础.[方法]通过同源单交换构建XC1077整合突变体NK1077,用带有全长XC1077基因序列的pLAFRJ质粒对NK1077进行功能互补并检测致病性.[结果]PCR及酶切验证表明整合突变体NK1077和互补菌株C1077构建成功.在MMX基本培养基上,NK1077及C1077的生长情况与Xcc 8004一致.致病性试验结果表明,NK1077在满身红萝卜的致病性下降到Xcc 8004的48.3％,过敏反应(HR)检测结果表明NK1077在辣椒ECW-10R上产生的HR反应明显滞后,而互补菌致病力及过敏反应能恢复至野生型水平.[结论]XC1077基因在Xcc 8004中是一个与致病相关的基因.     

胞外多糖对野油菜黄单胞菌野油菜致病变种气孔入侵能力的 …

利用Ｔｎ５ｇｕｓＡ５插入诱变和标记置换等分子遗传学方法,构建了时取油菜黄单胞菌野油菜致病变种（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｃａｍｐｅｓｔｒｉｓｐｖ,ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）８００４菌株的系列突变体,其中有６个突变体的胞多多糖产量显著降低,将它们喷雾接种寄主植物萝卜时,有２个突变体仍具有一定的致病性,４个突变体无致病性,结合扫描电镜观察,我们认为胞外多糖产量影响着该病菌气孔入侵能力。     

不同接种浓度对野油菜黄单胞菌野油菜致病变种胞外多糖突 …

利用转座子Ｔｎ５ｇｕｓＡ５诱变和标记置换方法,构建了野油菜黄单胞菌野油菜致病变种（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｃａｍｐｅｓｔｒｉｓｐｖ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）系列标记置换变突体,其中６个突变体的胞外多糖产量显著降低,致病试验结果表明,胞外多糖产量对Ｘｃｃ的致病性有明显的影响,不同接种浓度对Ｘｃｃ胞外多糖突变体致病性亦有明显影响。     

野油菜黄单胞菌葡萄糖激酶基因的克隆与表达

葡萄糖激酶催化葡萄糖磷酸化生成葡萄糖-6-磷酸,是糖酵解的第一步反应,在野油菜黄单胞菌(Xcc)利用碳源代谢及其致病性中起重要作用.为了初步鉴定Xcc葡萄糖激酶基因功能,为研究其利用碳源相关代谢及致病性提供理论依据,以pQE30为表达载体,采用常规PCR技术对野油菜黄单胞菌Xcc8004基因组上注释为葡萄糖激酶的3个基因(XC_1166、XC_1223和XC_1976)进行了克隆与表达,该3个基因在大肠杆菌JM109中有较高表达量,经Ni2+金属层析柱纯化后分别得到带有3个His的融合蛋白XC_1166-His6、XC_1223-His6和XC_1976-His6,分析表明仅XC_1976的表达产物具有葡萄糖激酶活性,为Xcc8004葡萄糖激酶基因,经测定XC_1976-His6的最适反应温度为45℃,最适pH值为7.1,最适反应条件下比活力为(380.6±1.123) U/mg.     

转录调节因子VrhR负调控野油菜黄单胞菌的致病力

以野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris pv. campestris, Xcc）转录调节因子VrhR，VrhA和VrhB为研究对象，通过基因敲除和致病性分析确定它们在Xcc与宿主互作过程中的作用。结果表明:VrhR只含有HTH（helix-turn-helix）结构域；在基因组上vrhR位于其他2个lysR类转录调节因子（vrhA和vrhB）之间，但转录方向相反。vrhR突变会提高Xcc的致病能力，但vrhA和vrhB突变对病原菌的致病能力没有影响。同时, vrhR，vrhA和vrhB突变均不影响细菌的运动性及胞外酶（蛋白酶、纤维素酶和淀粉酶）的活性。     

甘蓝黑腐病菌XC_3374基因功能的初步探究

【目的】初步探究XC_3374基因在甘蓝黑腐病菌Xcc8004中的功能,为深入研究甘蓝黑腐病菌Xcc8004中L-天冬酰胺酶的功能奠定基础。【方法】从KEGG数据库内获取XC_3374基因的旁侧序列,通过常规PCR对其进行克隆,同时利用自杀质粒pK18mobSacB通过同源双交换的方法构建了其缺失突变体DM3374并检测其表型。【结果】以引物D3374L-F/D3374R-R扩增,野生型菌株能够扩增出1789 bp的DNA片段,而候选突变体菌株能扩增出1367 bp的片段;以内部引物3374F/3374R扩增,野生型菌株能扩增出332 bp的片段,而候选突变体菌株不能扩增出任何片段,表明目标基因已缺失,缺失突变体DM3374构建成功。平板检测法结果表明,XC_3374基因突变后不影响胞外多糖及胞外酶的合成与分泌。在MMX基本培养基上,突变体菌株能够正常生长,形成的菌落大小与野生型菌株基本相同,表明缺失突变体不是营养缺陷性。游动平板检测结果表明, XC_3374缺失突变体的运动能力比野生型稍强,但差别不明显。采用剪叶法检测缺失突变体的致病性,结果表明,野生型Xcc8004和缺失突变体DM3374 病斑平均长度分别为13.000和11.983 mm,两者致病性无显著差异。【结论】XC_3374基因突变体在胞外多糖、几种胞外酶的合成与分泌、致病性等各种表型与野生型基本一致。     

甘蓝黑腐病菌XC_3374基因功能的初步探究

【目的】初步探究XC_3374基因在甘蓝黑腐病菌Xcc8004中的功能,为深入研究甘蓝黑腐病菌Xcc8004中L-天冬酰胺酶的功能奠定基础。【方法】从KEGG数据库内获取XC_3374基因的旁侧序列,通过常规PCR对其进行克隆,同时利用自杀质粒pK18mobSacB通过同源双交换的方法构建了其缺失突变体DM3374并检测其表型。【结果】以引物D3374L-F/D3374R-R扩增,野生型菌株能够扩增出1789 bp的DNA片段,而候选突变体菌株能扩增出1367 bp的片段;以内部引物3374F/3374R扩增,野生型菌株能扩增出332 bp的片段,而候选突变体菌株不能扩增出任何片段,表明目标基因已缺失,缺失突变体DM3374构建成功。平板检测法结果表明,XC_3374基因突变后不影响胞外多糖及胞外酶的合成与分泌。在MMX基本培养基上,突变体菌株能够正常生长,形成的菌落大小与野生型菌株基本相同,表明缺失突变体不是营养缺陷性。游动平板检测结果表明, XC_3374缺失突变体的运动能力比野生型稍强,但差别不明显。采用剪叶法检测缺失突变体的致病性,结果表明,野生型Xcc8004和缺失突变体DM3374 病斑平均长度分别为13.000和11.983 mm,两者致病性无显著差异。【结论】XC_3374基因突变体在胞外多糖、几种胞外酶的合成与分泌、致病性等各种表型与野生型基本一致。     

甘蓝黑腐病菌XC3374基因功能的初步探究

【目的】初步探究XC₃374基因在甘蓝黑腐病菌Xcc8004中的功能,为深入研究甘蓝黑腐病菌Xcc8004中L-天冬酰胺酶的功能奠定基础。【方法】从KEGG数据库内获取XC₃374基因的旁侧序列,通过常规PCR对其进行克隆,同时利用自杀质粒pK18mobSacB通过同源双交换的方法构建了其缺失突变体DM3374并检测其表型。【结果】以引物D3374L-F/D3374R-R扩增,野生型菌株能够扩增出1789bp的DNA片段,而候选突变体菌株能扩增出1367bp的片段;以内部引物3374F/3374R扩增,野生型菌株能扩增出332bp的片段,而候选突变体菌株不能扩增出任何片段,表明目标基因已缺失,缺失突变体DM3374构建成功。平板检测法结果表明,XC₃374基因突变后不影响胞外多糖及胞外酶的合成与分泌。在MMX基本培养基上,突变体菌株能够正常生长,形成的菌落大小与野生型菌株基本相同,表明缺失突变体不是营养缺陷性。游动平板检测结果表明,XC₃374缺失突变体的运动能力比野生型稍强,但差别不明显。采用剪叶法检测缺失突变体的致病性,结果表明,野生型Xcc8004和缺失突变体DM3374病斑平均长度分别为13.000和11.983mm,两者致病性无显著差异。【结论】XC₃374基因突变体在胞外多糖、几种胞外酶的合成与分泌、致病性等各种表型与野生型基本一致。     

黄单胞菌葡萄糖转运系统相关基因的敲除及功能分析

分别敲除了植物病原体野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris pv. campestris 8004）的3个葡萄糖转运蛋白和2个葡萄糖脱氢酶,获得了5株相应基因敲除的突变体。在营养丰富的培养基中,这5株突变体的生长曲线、胞外纤维素酶活性和胞外多糖量与野生型相比并无显著差异。在以葡萄糖为唯一碳源的M63培养基中,XC_2460基因的敲除显著影响了黄单胞菌的生长;在以CMC作为唯一碳源的M63培养基中,XC_2460基因的敲除使突变体的胞外葡萄糖累积量达到野生菌株的167倍。这些结果首次显示阻遏葡萄糖的跨膜转运是改进纤维素分解菌株积累葡萄糖量的有益途径。     

油菜菌核病菌不同致病力菌株生物学特性的比较研究

以从安徽省桐城、望江、宁国、旌德、南陵、寿县等油菜产区采集的油菜菌核病病组织或菌核上分离获得的24株油菜菌核病菌菌株为供试菌株,采用离体叶片接种法接种测定这些菌株对供试油菜的致病力。结果表明,各菌株间的致病力有显著差异,存在明显分化,这种致病性差异与菌株的地理来源有一定相关。进一步选取致病力较强的菌株NG4和致病力较弱的菌株NL1进行生物学特性的比较研究。结果表明,两菌株在5～30℃条件下均能生长,最适生长温度为20～25℃;菌丝在pH 2～12均能生长,以pH 5～7为最适;光暗交替条件有利于菌丝的生长;但强致病力菌株在相同温度、pH和光照条件下的菌丝生长速率和菌丝干重均大于弱致病力菌株。     

十字花科黑腐病菌编码RNA聚合酶ω亚基的基因(rpoZ_(Xcc))突变导致细胞生长减慢

ω(Omega)亚基是组成细菌RNA聚合酶(RNA polymerase,RNAP)核心酶的5个亚基(2α、β、β′andω)中最小的一个,也是5个亚基中唯一可以去除而不会导致细胞死亡的亚基。尽管ω亚基存在于所有细菌中并且序列非常保守,但迄今为止,人们对ω亚基的功能却知之甚少。基因组注释结果表明,十字花科黑腐病菌8004菌株(Xanthomonas campestris pv.campestris strain 8004,简称Xcc8004)基因组中存在一个编码ω亚基的基因rpoZXcc(ORF编号为XC0957)。为了研究Xcc RNA聚合酶ω亚基的功能,采用自杀质粒pK18mob整合突变方法,构建了rpoZXcc基因的非极性突变体NK0957。表型检测结果显示,NK0957在基本培养基MMX和丰富培养基NYG中的生长比野生型菌株Xcc8004的生长明显减慢,而且NK0957的生长缓慢表型能被rpoZXcc反式互补。这些结果说明,ω亚基在Xcc的生长过程中发挥重要作用。     

十字花科黑腐病菌编码RNA聚合酶ω亚基的基因（rpoZXcc）突变导致细胞生长减慢

ω（Omega）亚基是组成细菌RNA聚合酶（RNA polymerase,RNAP）核心酶的5个亚基（2α、β、β′andω）中最小的一个,也是5个亚基中唯一可以去除而不会导致细胞死亡的亚基。尽管ω亚基存在于所有细菌中并且序列非常保守,但迄今为止,人们对ω亚基的功能却知之甚少。基因组注释结果表明,十字花科黑腐病菌8004菌株（Xanthomonas campestris pv.campestris strain 8004,简称Xcc8004）基因组中存在一个编码ω亚基的基因rpoZXcc（ORF编号为XC0957）。为了研究Xcc RNA聚合酶ω亚基的功能,采用自杀质粒pK18mob整合突变方法,构建了rpoZXcc基因的非极性突变体NK0957。表型检测结果显示,NK0957在基本培养基MMX和丰富培养基NYG中的生长比野生型菌株Xcc8004的生长明显减慢,而且NK0957的生长缓慢表型能被rpoZXcc反式互补。这些结果说明,ω亚基在Xcc的生长过程中发挥重要作用。     

水稻基腐细菌Tn5插入突变体库的构建及其致病相关突变体的筛选

采用转座子Tn5插入突变技术,共获得5 261个接合子。通过马铃薯软腐快速筛选和PCR检测验证,获得267个使马铃薯软腐能力丧失或下降的Tn5插入突变体,并测定其在水稻上的致病力和烟草上的过敏性坏死反应(HR)。结果表明:在267个突变体菌株中,对水稻无致病力的有71个,其中在烟草上无HR反应的有59个,产生HR反应的有12个;对水稻致病力下降的有68个,其余突变体菌株对水稻致病力与野生菌株差异不明显。另外,267个突变体菌株中有146个无HR反应,其中有90个对水稻无致病力或者致病力下降。致病力的分析结果表明,获得的突变体是由Tn5插入Dickeya zeae染色体上不同的致病相关基因位点导致的。     

十字花科黑腐病菌hrpW基因导入油菜之研究初报

为了研究十字花科植物黑腐病菌(Xanthomonas campestris pathovar campestris,简称Xcc)hrpW基因的功能及Xcc的致病机理,实验以甘蓝型油菜为试验材料,以5～6d无菌苗的带柄子叶为外植体,建立了高效稳定的带柄子叶再生体系,同时探索了影响根癌农杆菌介导转化甘蓝型油菜子叶柄的各种因素;并用农杆菌介导法将hrpW基因导入甘蓝型油菜中,经PCR检测法分析,证明hrpW基因已整合到油菜基因组中。hrpW基因编码HarpinXcc(十字花科植物黑腐病菌Harpin蛋白),该转基因植株的获得,为进一步研究十字花科植物黑腐病菌的致病机理提供了材料,也为选育高效抗病油菜种质奠定了基础。     

PEG介导的Botryosphaeria dothidea突变体库表型分析及致病突变体筛选

对已建立的PEG突变体库中随机挑选的320株突变体菌株进行表型和致病性筛选,获得表型或致病性显著变化的菌株。将突变菌株及野生菌株接种至PDA培养基,观察生长3d和7d时菌落颜色及形态,测量菌落直径。将表型变化菌株及野生菌株接种于离体富士叶片,测量接种5d后病斑直径。生长速率检测显示有40株生长速率加快,有3株生长速率显著下降。14株突变体菌落颜色发生明显变化,菌落呈黑色或纯白色;15株突变体菌落形状不规则且气生菌丝稀疏;其中7株同时具有两种表型特征。致病性测定获得致病性增强突变体s104和致病性减弱突变体s172。所筛选的320株突变体中,表型异常菌株占6.8%,同时获得两株致病性变化菌株,对进一步揭示Botryosphaeria dothidea的致病机理具有重要价值。     

苹果树腐烂病菌T-DNA插入突变体表型及致病突变体研究

【目的】筛选苹果树腐烂病菌T-DNA插入表型或致病突变体,为研究该病菌的表型及致病相关基因提供起始材料。【方法】从建立的T-DNA插入突变体库中,随机挑选230株突变体菌株进行表型观察及致病性测定,并对部分致病突变体进行TAIL-PCR侧翼扩增。【结果】大部分的突变体与野生型菌株03-8在表型及致病性方面无明显差异,仅30.87%的突变体表现出了明显的变化;其中16株突变体(占突变体总数的6.95%)致病性发生了明显的增强,而表型与03-8相比无明显的变化;20株突变体(占突变体总数的8.69%)致病性与03-8无显著性差异,但是表型发生了明显的变化;16.1%的突变体则同时表现出表型及致病性的显著差异,其中28株表现为致病性显著降低,7株致病性丧失。通过对15株致病突变体侧翼序列的扩增,获得了7条T-DNA侧翼序列,其中突变体X912的侧翼序列被注释为黄曲霉(Aspergillus flavus)阿魏酸酯酶B前体。【结论】获得了多个不同的苹果树腐烂病菌表型或致病突变体,为研究该病菌的生长发育及致病相关基因奠定了良好的基础。     

柑橘溃疡病菌胞外蛋白水解酶对其致病力的作用

采用异源表达方法从柑橘黄单胞柑橘亚种(Xcc)中国菌株Xcc 29-1中鉴定出6个编码胞外蛋白水解酶的基因.运用同源重组方法将6个编码基因全部敲除,得到胞外蛋白水解酶缺失突变体,对其致病力、形成生物膜的能力和生长繁殖速度进行检测.结果显示,蛋白水解酶突变体在柑橘上的致病力减弱,并且附着到试管壁的细菌数量显著减少,形成生物膜的能力下降.在野生型菌株中过表达蛋白水解酶后,形成的溃疡病斑水渍状程度加大,在柑橘中的繁殖速度变快;在柑橘叶片中,6个胞外蛋白水解酶基因的转录水平都增强表达.这些结果表明Xcc的胞外蛋白水解酶是一个重要的致病因子.