不同生长条件下铁皮石斛内生细菌多样性及活性菌株的筛选

目的 比较和分析野生与人工栽培铁皮石斛Dendrobium officinale 内生细菌分布特点,筛选有较强定殖能力的活性菌株,为促进野生铁皮石斛驯化、提高药材品质奠定基础。方法 采用组织块分离法分离铁皮石斛根、茎、叶各部位的内生细菌,利用16S rDNA序列和系统发育树对分离菌株进行分析鉴定,体外筛选具有解磷、解钾、固氮、产铁载体、产IAA、拮抗病原菌的促生活性菌株,回接后再分离,观察内生细菌在组培苗中的定殖动态。结果 从铁皮石斛中分离到285株内生细菌,其中,217株分离自野生铁皮石斛,归类于3门9属,以芽孢杆菌属Bacillus和不动杆菌属Acinetobacter为优势菌群存在于根、茎、叶中,其菌株数分别占总分离菌株数的79.26%和8.76%;68株内生细菌分离自人工栽培铁皮石斛,归类于1门3属,以伯克霍尔德菌属Burkholderia和埃希菌属Escherichia为优势菌群存在于根、茎中,其菌株数分别占总分离菌株数的54.41%和30.88%。泛菌属Pantoea在野生和人工栽培铁皮石斛中均有分布。野生铁皮石斛内生细菌的物种数(9)和多样性指数(0.85)明显高于人工栽培铁皮石斛(物种数为3,多样性指数为0.61)。活性筛选共获得38株菌株,占筛选菌株的45%,4株野生铁皮石斛的活性内生细菌中有3株在人工组培苗具有较好的定殖性。结论 野生与人工栽培铁皮石斛内生细菌的类群结构和生物多样性具有明显差异,铁皮石斛内生细菌蕴含丰富的促生潜力。     

患爆发性败血症斑点叉尾鮰病原的分离与鉴定

从患爆发性败血症斑点叉尾鮰肝、脾和肾分离到大量形态和色泽一致的细菌。随机挑选5株细菌注射健康斑点叉尾鮰,感染鱼72 h内全部死亡,且患病症状与自然发病症状一致,确认分离株为斑点叉尾鮰败血症的致病菌。依据其菌落形态、生理生化特征,结合其16S rRNA和gyrB基因序列分析,鉴定5个分离株为蜡样芽孢杆菌。用20种抗微生物药敏纸片对分离株进行药敏实验,发现5株菌均对7种喹诺酮类药物、5种氨基糖苷类药物,麦迪霉素,克林霉素和新生霉素敏感,而对2种头孢菌素类药物和复方新诺明有耐药性。     

核桃炭疽病病原鉴定及抑菌药剂筛选

为四川省雅安市石棉县核桃炭疽病病害防治提供依据,对该地区发病叶片、果实和枝干分别进行发病组织培养、分离纯化,通过致病性测定、菌落形态观察和rDNA-ITS序列测定对病原菌进行鉴定,并采用菌丝生长速率法和孢子萌发法,室内测定25种杀菌剂配方对病原菌菌丝生长和孢子萌发的抑制作用。结果表明:1)病原菌经分离纯化后得到的9个菌株,根据各菌株在PDA平板正反面的不同形态分为2类,分别选择1个具有代表性的菌株P51和P57作后续鉴定。2个菌株接种果实和叶片后发病率均为100%,病原重分离均得到接种的病原,其形态特征均与刺盘孢属Colletotrichum gloeosporioides真菌相似;将2个菌株rDNA-ITS序列与Genbank中相关菌株的ITS序列进行同源性比较,发现其与C.gloeosporioides真菌同源性达到100%。使用DNAMAN6.0邻接法进行序列同源性比对并构建系统发育树,菌株P51、P57与已鉴定为C.gloeosporioides的AB981196、HQ645082、KC355249和KJ676453以自展支持率100%聚类在一起。2)杀菌剂配方筛选:100%链霉素3 000倍液等5种配方对病原菌菌丝生长抑制作用最强,不同配方之间差异不显著;100%链霉素3 000倍液等4种配方之间差异不显著,对病原菌孢子萌发抑制作用最强,对菌丝生长和孢子萌发抑制作用都强的是100%链霉素3 000倍液、25%咪鲜胺500倍液、50%福美双500倍液、70%甲基硫菌灵500倍液。通过上述研究结果可以确定引起雅安地区核桃炭疽病的病原为刺盘孢属C.gloeosporioides真菌;100%链霉素3 000倍液、25%咪鲜胺500倍液、50%福美双500倍液、70%甲基硫菌灵500倍液4种配方对C.gloeosporioides真菌生长萌发抑制作用最强。     

多花黄精根茎内生真菌的物种多样性研究

多花黄精是一种著名的中药材，其药用部位（根茎）含有多种内生真菌，是新化合物、新药源和生防制剂的潜在资源。为研究黄山市祁门县多花黄精根茎内生真菌的物种多样性，为其开发利用提供种质资源，采用组织分离法分离培养多花黄精根茎内生真菌，通过经典形态分类学并结合rDNA ITS序列比对鉴定分离得到的真菌，并进行物种多样性分析。结果表明，从多花黄精根茎中共分离出182株内生真菌，经鉴定为2门、5纲、13目、28科、33属和49种，另外有4株未确定其分类地位。其中子囊菌门(Ascomycota)为优势门，分离频率为83.52％；粪壳菌纲(Sordariomycetes)为优势纲，分离频率为59.34％；肉座菌目(Hypocreales)为优势目，分离频率为46.70％；优势科是麦角菌科(Clavicipitaceae)，分离频率为33.52％；Metapochonia是优势属，分离频率为33.52％。物种多样性研究结果表明黄山市祁门县多花黄精根茎的内生真菌物种丰富，群落结构复杂，且春季的多花黄精根茎内生真菌的Shannon-Wiener指数、Pielou均匀度指数、Simpson优势度指数和丰富度指数均高于夏季。     

基于28S rDNA序列的2种飞虱内生真菌多样性研究

飞虱是农业的重要害虫之一,其体内存在大量共生菌,它们为寄主提供氨基酸、固醇类物质以及蛋白质等多种营养成分,保证飞虱的正常生长和繁殖。利用对飞虱内生真菌28S rDNA基因克隆和序列比对分析的方法,首次对烟翅白背飞虱Sogatella Kolophon和长绿飞虱Saccharosydne procerus体内内生真菌的多样性进行研究。结果显示,烟翅白背飞虱腹部脂肪体内可能存在4种内生真菌,其中热带假丝酵母Candida tropicalis为优势共生菌;长绿飞虱可能存在6种内生真菌,其中担子菌酵母Derxomyces anomala和泡状莫氏黑粉菌Moesziomyces bullatus系为飞虱首次发现。另外,在这2种飞虱体内均发现了一种与白地霉 Galactomyces geotrichum相似度为99%的内生真菌,这也是该菌在飞虱体内的首次报道。本研究为以后探讨内生真菌与其宿主的进化关系及探索利用内生菌防治飞虱害虫奠定了基础。     

北苍术根腐病病原菌分离鉴定及其生防菌筛选

为明确导致北苍术根腐病的病原菌,本实验从承德市感病北苍术块茎中分离病原微生物,并对病原微生物致病性进行回接验证。研究分离获得的具有致病性的病原菌鉴定为尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）。从健康药用植物根际土壤中分离获得94株根际微生物,通过平板拮抗筛选获得2株生防菌,分别为菌株SFJ-27和菌株SFJ-41,平板对峙实验结果表明2株生防菌抑菌率均在50%以上。通过分子生物学和形态学鉴定2株菌分别为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和贝莱斯芽孢杆菌（Bacillusvelezensis）。盆栽实验结果表明,菌株SFJ-27与菌株SFJ-41对北苍术根腐病具有明显的生防效果,防治效果分别为52.27%和68.19%。研究表明,尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）可以导致北苍术根腐病的发生,枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）对北苍术根腐病具有防治作用。     

杜仲内生真菌中抗苹果炭疽病活性菌株的筛选

对杜仲植株中的内生真菌进行分离纯化,共得到32株内生菌株。通过离体平板对峙培养检测、光学显微镜观察,以及测定在活体果实上的拮抗活性,研究杜仲拮抗真菌与病原菌及其寄主植物苹果果实之间的相互作用。对峙培养显示杜仲内生真菌DZGS07对苹果炭疽菌有较强拮抗作用,具有较强的营养和空间竞争能力,显微观察表明其能造成病原菌菌丝畸形等现象。在生防研究中,内生真菌DZGS07对苹果炭疽病具有较好的生防潜力,处理后的第7天防效达84.19%;对该菌株的ITS 序列进行测定分析,初步鉴定DZGS07为炭疽菌属(Colletotrichum)的真菌。     

西瓜枯萎病内生拮抗细菌YGRE24的分离鉴定及其特性研究

采用稀释涂布平板法结合平板对峙法,从表面消毒的西瓜根中筛选到一株能够高效抑制尖孢镰刀菌西瓜专化型3种生理小种的内生细菌YGRE24。菌株YGRE24对尖孢镰刀菌西瓜专化型3种生理小种的抑制率分别为54.76%、55.95%和55.24%,且其除菌后的培养液也具有明显的抑菌效果。该菌株对小麦赤霉病菌、水稻纹枯病菌等也具有很强的拮抗作用。此外,菌株YGRE24还具有溶磷、产吲哚乙酸、产铁载体的促生特性。盆栽试验表明,该菌株能够在接种病原菌的情况下促进西瓜苗的生长,使地上部分的鲜重和干重分别增加44.75%和30.32%,可以缓解病害对西瓜苗生长的影响。经形态特征、生理生化特性及16S rDNA序列分析初步确定菌株YGRE24为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。     

陕西市售婴幼儿食品中阪崎克罗诺杆菌流行状况及相关特性研究

对陕西省62个品牌的366份市售婴幼儿配方乳粉和米粉及其他食品中阪崎克罗诺杆菌的污染状况进行调查,并对分离株的相关特性进行分析,旨在阐明陕西市售婴幼儿食品的食用安全性。结果表明,87份样品检出阪崎克罗诺杆菌阳性,平均检出率为23.8%。乳粉阳性样品检出率为18.3%,米粉为27.3%,其他婴幼儿配方食品检出率20.0%。共检出169株阪崎克罗诺菌,其中168(99.4%)株对利福平产生抗性,对其他抗生素耐药的菌株比例依次为阿莫西林20.12%、链霉素18.93%、四环素17.16%、氨苄西林12.43%、庆大霉素11.24%和头孢曲松0.59%等。135株(79.88%)分离株携带ompX基因,120株(71.01%)携带cpa基因、111株(65.68%)携带sip基因、93株(55.03%)携带hly基因。按照95%的相似性,169株分离株脉冲场凝胶电泳(Pulse field gel electrophoresis,PFGE)分型后可被分为4个大簇、8个小簇和1个单基因型,部分源于不同品牌或批次食品的菌株基因型相似性较高,表明陕西省市售婴幼儿配方粉及婴幼儿食品中阪崎克罗诺杆菌染问题不容忽视,存在严重的食品安全危胁。     

建鲤体内外急性肝损伤模型的建立

以四氯化碳(CCl4)为肝毒剂,建立建鲤体内外急性肝损伤模型.体内,采用腹腔注射法造模,按0.1 mL/10g一次性分别注射0、6.25％、12.5％和15％ CCl4-橄榄油溶液(v/v),于造模后24 ～ 144 h取血,测定建鲤血清中谷丙转氨酶(GPT)、谷草转氨酶(GOT)、乳酸脱氢酶(LDH)和丙二醛(MDA)水平;体外,0、2、4、8、16、32 mmol·L-1 CCl4分别作用于原代培养的建鲤肝细胞4h后,用噻唑蓝(MTT)法检测细胞生存状况,同时收集细胞培养上清,测定其GPT、GOT、LDH、MDA、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽(GSH)活力.结果显示,12.5％、15％ CCl4-橄榄油溶液腹腔注射建鲤24 h后即能引起血清中GOT、GPT和MDA显著升高,15％ CCl4溶液造模组48 h能显著提高血清中LDH水平,4个指标均在CC14作用96 h后恢复到接近正常水平;8～ 32 mmol·L1 CCl4作用体外培养肝细胞4h时,细胞上清中GPT、GOT、LDH和MDA含量显著升高、SOD和GSH活力显著下降,肝细胞存活率显著下降,分别为空白对照组的66.29％、54％和37％且有剂量依赖性.结果表明,分别采用15％ CCl4-橄榄油腹腔注射建鲤72 h和8 mmol·L-1 CCl4作用体外培养肝细胞4h可以构建体内外急性肝损伤模型.     

耐重金属的植物促生芽孢杆菌筛选及其强化香蒲去除Cd的作用

为探讨细菌对水生植物修复水体重金属污染的影响,从南京某矿区废弃地的湿地植物柳树(Salix babylonica)、芦苇(Phragmites australis)、香蒲(Typha latifolia)根际和根内分离筛选到8株芽孢杆菌,这些芽孢杆菌都具有产铁载体、吲哚乙酸、多糖和淀粉酶活性,且对重金属的抗性较强,对温度、pH和盐浓度具有一定的耐受性。采用水培试验研究了Cd胁迫下耐重金属植物促生芽孢杆菌强化狭叶香蒲(T.angustifolia)吸收积累Cd的作用,结果表明,在2.5 mg·L~(-1)Cd~(2+)的条件下接种芽孢杆菌处理能够促进香蒲生长和组织中Cd含量增加。其中Bacillus megaterium P24和P37促进香蒲根和地上部干重显著增加40.0%~46.4%,B.amyloliquefaciens P29能使地上部Cd含量和总吸收量显著增加31.1%和63.5%;溶液中Cd去除率最高可达79.5%。研究表明,耐重金属芽孢杆菌能够促进香蒲生长、增加香蒲Cd含量,从而增加香蒲Cd总吸收量,达到去除水中Cd污染的作用,具有应用于水体重金属污染修复的潜力。     

苹果树腐烂病生防链霉菌A144的鉴定及其代谢产物的抑菌活性

旨在明确菌株A144的分类地位及其代谢产物的抑菌活性。基于形态学观察、生理生化特征以及16S rDNA序列分析将菌株A144鉴定为娄彻氏链霉菌(Streptomyces rochei)。采用含药平板法测定菌株A144的抑菌谱,结果表明其发酵滤液对苹果树腐烂病菌(Valsamali var.mali)、西瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum)、水稻恶苗病菌(Fusarium moniliforme)以及番茄早疫病菌(Alternaria solani)均有抑菌活性,抑菌率分别为68.15%±2.62%、28.90%±1.79%、33.77%±2.59%和11.43%±0.81%。以苹果树腐烂病菌为指示菌,从12种不同培养基中筛选出ISP2培养基为菌株A144的最佳发酵培养基,其发酵滤液的抑菌率达85.06%±0.86%。平板涂抹法和平板对扣法试验结果表明,其脂肽粗提物、蛋白粗提物和挥发性物质对苹果树腐烂病菌均有抑菌活性,抑菌率分别为81.44%±0.92%、47.92%±2.25%和22.87%±4.40%。可见,菌株A144在苹果树腐烂病的生物防治中具有良好的开发潜力。     

生防放线菌TGNBSA5的鉴定及其活性物质的研究

牛蒡内生放线菌TGNBSA5对猕猴桃溃疡病菌有较好拮抗作用。为开发该生防菌的生物防治价值,采用生理生化活性测定、形态观察及16SrDNA序列分析,并经发酵培养后,发酵液采用乙酸乙酯萃取、柱层析和薄层层析、HPLC检测等方法分离纯化抑菌活性组分。结果表明,该内生放线菌为链霉菌属的孢杆链霉菌(Streptomyces sporovirgulis),经紫外和NMR鉴定活性组分之一为苯甲醇。孢杆链霉菌为第一次从植物中分离获得,且活性组分苯甲醇的明确将为猕猴桃溃疡病的防治提供理论依据。     

江苏地区渔源嗜水气单胞菌流行病学调查

以江苏地区主要淡水渔业养殖品种为研究对象,无菌采集样品肝、脾、肾、腹腔积液和血液增菌纯化后,用API20E试剂条检测嗜水气单胞菌阳性样品92份,阳性率为17.79%。同时用PCR方法对92株初筛阳性进行验证核对,得到60株可鉴定到种的嗜水气单胞菌,其余32株可以鉴定到气单胞菌属。同时对92株阳性菌株进行溶血性试验,其中60株菌具有溶血性,32株不具有溶血性。对采样数据进行综合分析,在12个采样地区样品中均有携带,携带率最低为金坛的10%,最高为大丰的30.77%。在3(-1)0月采样期内均有检出,其中从6月份开始增加,7-9月份较其他月份具有比较明显的增加。从病原生物侵染品种上看,此次调查的主要淡水养殖品种嗜水气单胞菌平均品种检出率为17.79%。     

耐盐植物虎尾草内生解烃细菌的筛选及其降解特性

从耐盐植物中分离具有石油烃降解功能内生细菌并研究其降解特性,为内生细菌协同宿主植物修复石油污染盐渍化土壤提供基础。以黄河三角洲长期受石油污染重盐碱地生长的耐盐植物虎尾草为材料,分离出能以柴油为唯一碳源生长的内生细菌24株。通过柴油降解试验,筛选得到1株高效石油烃降解内生细菌BF04。经生理生化特性及16S r DNA同源序列分析,确定BF04为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)。通过液体培养试验研究了BF04对不同烃的利用能力和对柴油的降解动力学特征。结果表明:BF04能够利用直链烷烃、支链烷烃和单环芳烃,不能利用多环芳烃和苯酚。BF04能降解柴油中大部分烷烃,其中对短链烷烃(n C11~n C23)降解率高于长链烷烃(n C24~n C27)。BF04对柴油降解可以用一级反应动力学模型表示。在含有3%Na Cl的液体培养基中,BF04具有较强的降解柴油能力,在修复石油污染高盐环境中具有一定的应用潜力。     

甘草内生细菌对4种植物病原菌的抑菌谱及其16S rRNA系统发育分析

旨在筛选对4种植物病原真菌具有拮抗活性的甘草内生细菌,为新疆甘草内生细菌的开发应用提供理论依据。采用平板对峙培养法从100株甘草内生细菌中筛选对石榴枯萎病甘薯长喙壳、草果叶斑病镰刀菌、草果假茎黑斑病小孢拟盘多毛孢、墨兰炭疽病胶孢炭疽菌等4个病原菌具有拮抗活性的菌株,并测定其16SrRNA基因序列,建立系统发育树对其进行初步鉴定。结果显示,61株菌株对甘薯长喙壳具有拮抗作用,其中13株菌的抑菌半径均大于15mm。进一步研究表明,10株菌对4种植物病原菌都表现出较高的抑菌能力。基于16Sr RNA基因序列分析与系统发育分析表明,其中11株菌为萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus),另外2株菌分别为副氧化微杆菌(Microbacterium paraoxydans)和莫哈韦芽胞杆菌(B.mojavensis)。     

苦苣菜内生菌的筛选及其次级代谢产物分析

为开发陕北野生苦苣菜内生菌资源,发现潜在药用活性成分和新的医药先导化合物。以苦苣菜健康植株的根、茎、叶为材料,采用平板对峙培养法测定其对11株供试指示菌的抑菌活性,以苦苣菜提取液为对照,对各拮抗菌株的发酵液进行薄层层析、硅胶柱层析和高效液相色谱分析。从中共筛选出95株内生菌,通过抑菌试验发现其中20株对1种或多种指示菌具有抑菌活性,占分离菌株数的21.05%,其中UG-004、UG-036、UY-085、CY-009、CJ-014、CG-033和CG-035 7株具有较强谱抑菌活性。薄层层析检测结果表明,菌株CG-035的发酵产物在R_f为0.35处有与苦苣菜提取液的层析带迁移率相当的显色带。并通过高效液相色谱分析确定其主要成分为黄酮类物质。菌株CG-035能发酵产生黄酮类或其类似化合物,表明苦苣菜内生菌在次级代谢产物方面具有研究潜力,这为内生菌在微生物药物研究方面提供了理论依据。     

杜仲内生细菌对植物病原菌的拮抗作用

为进一步丰富玉米病害的生防资源,通过平板稀释法,对健康杜仲组织进行内生细菌的分离纯化,共得到内生细菌55株, 55株内生细菌分别属于芽孢杆菌属（Bacillus）、类芽孢杆菌属（Paenibacillus）、伯克霍尔德菌（Burkholderia）、贪铜菌属(Cupriavidus)和赖氨酸芽孢杆菌属（Lysinibacillus）等5个属。利用平板对峙方法,筛选出对玉米小斑病和玉米茎基腐均有较好的抑制作用的内生细菌DZSY21,其抑菌率分别达到61.30%和79.10%,显微观察显示,拮抗菌株 DZSY21可引起病原菌菌丝断裂、畸形等现象。随后,对内生细菌DZSY21开展了gyrB及趋化性研究,结果表明,DZSY21为枯草芽孢杆菌,且对玉米根系分泌物具有较好的趋化性。     

油菜内生拮抗细菌SF4对油菜菌核病菌的抑制作用研究

从油菜幼苗中分离出110个内生细菌。采用平板对峙法进行筛选,有4株菌对核盘菌有不同程度的抑制作用。经连续传代10次后,菌株SF4仍具有较高的生防活性。该菌株对核盘菌的菌丝生长发育有显著的抑制效果。在显微镜的观察下,被抑制的菌丝发生畸形,内含物分布不均匀。菌株SF4的挥发性产物及无菌发酵液都能抑制核盘菌的菌丝生长。挥发性产物对菌丝的最高抑制率为33.13%。无菌发酵液的抑制效果随培养时间的不同而有显著差异,96 h的无菌发酵液抑制效果最好。菌株SF4的无菌发酵液可推迟核盘菌菌核形成的时间,减少菌核数目,也可推迟菌核的萌发。在油菜叶片离体实验中,该菌株的菌悬液及无菌发酵液对发病有明显的抑制作用。     

玉米内生真菌的分离与鉴定

对不同品种的玉米种子及不同地区、不同部位的玉米内生真菌进行分离和鉴定。结果显示,8个不同品种的玉米种子,内生真菌检出率为25%,不同玉米品种的种子内所含的内生真菌种类和数目都不同,最高的检出率为40%,最低的检出率为10%。从玉米种子中分离得到的92个菌株,经形态学鉴定,分别属于14个属,出现频率最高的是木霉属,为34.78%。从不同地区的玉米组织中一共分离得到内生真菌168株,其中10株未产孢的没有鉴定,其他菌株经形态学鉴定分别属于26个属,以青霉属、曲霉属、头孢霉属为主,占内生真菌分离物总数的41.07%。对形态学鉴定为白僵菌属的10个菌株进行分子鉴定,均确定为球孢白僵菌(Beauveria bassiana)。此外,球孢白僵菌作为玉米的内生真菌,在国内还是首次分离得到。