检疫性真菌病害向日葵黑茎病菌和茎溃疡病菌的三重PCR分子检测

向日葵黑茎病菌Leptosphaeria lindguistii和向日葵茎溃疡病菌Diaporthe helianthi是向日葵上寄生的2种重要的检疫性真菌病害.针对这2种致病菌,目前国内外已有形态学鉴定和危害的研究报道以及向日葵黑茎病菌的ITS序列分析和RFLP初步研究,但未见有2种病原菌同步分子检测的报道.本研究首先通过培养,观察比较了2种病原菌的菌落和形态特征.发现前者菌落絮状,分生孢子器深褐球型,分生孢子为单胞肾形;后者菌落短绒毛状,分生孢子器柠檬黄,分生孢子为线型.通过油菜黑茎病菌L.biglobosa的肌动蛋白基因设计供试材料的通用引物act F/act R,扩增产物片段约为720 bp,然后采用真菌通用引物ITS1/ITS4和引物act F/act R,针对所有菌株菌丝DNA进行ITS区域和Actin基因PCR扩增,经克隆测序结果比对分析发现,向日葵黑茎病菌和向日葵茎溃疡病菌的ITS区域存在极高的相似度.因此,依据Actin基因特异位点分别设计出向日葵黑茎病菌和向日葵茎溃疡病菌的特异引物LLF/LLR和DHF/DHR.在同一PCR管中3组引物(ITS1/ITS4,LLF/LLR和DHF/DHR)经优化体系后,ITS1/ITS4扩增序列作为所有菌株菌丝基因组DNA提取模板的质量监控,针对向日葵黑茎病菌和向日葵茎溃疡病菌单一模板的ITS区域与Actin基因中的两个位点同时进行三重PCR扩增.利用此方法检测向日葵黑茎病菌出现580 bp的ITS保守区扩增片段和255 bp的Actin基因的特异扩增带,向日葵茎溃疡病菌出现580 bp的ITS保守区扩增片段和394 bp的Actin基因特异扩增带.所有菌株均未见非特异性片段的干扰.此三重PCR检测体系的建立为此两种检疫性真菌病害的同步分子检测提供了特异方法.     

应用PCR法检测向日葵茎溃疡病菌的研究

[目的]设计出向日葵茎溃疡病菌(Phomopsis helianthi M.Muntanola - Cvetkovic)的特异性引物,建立该病菌PCR快速检测方法.[方法]用真菌通用引物ITS4/ITS5对向日葵茎溃疡病菌进行PCR扩增,将扩增产物进行克隆、酶切分析和测序,用DNAMAN软件设计出检测该病菌的特异性引物PHDF1和PHDF2,优化PCR反应体系.[结果]PCR反应体系为:25 mM MgCl2 2.4 μL,10 mM dNTP 0.3 μL,10 uM引物各1.5 μL,模板7 ng,最佳退火温度61.6C,建立了该病菌PCR检测方法.[结论]应用该方法检测供试的13个菌株,该对引物可以准确的将向日葵茎溃疡病菌与其他拟茎点霉属的真菌区分开来,该病菌的PCR扩增片段为326 bp.     

引起新疆向日葵列当茎基腐病的镰刀菌分离与鉴定

[目的]向日葵列当在新疆严重发生,从田间自然死亡的列当植株上分离致病菌并进行鉴定,为新疆列当生物防治提供菌种来源.[方法]采用组织分离法分离采集的样品,采用形态学及分子生物学方法对采集的镰刀菌进行鉴定.[结果]从587个生病的向日葵列当样品上共计分离获得377个分离物,其中镰刀菌234个,占总分离物的62.07;;丝核菌114个,占30.24;;腐霉菌6个,占1.59;;其它23个,占6.10;.在镰刀菌中鉴定出了3个种,分别为尖孢镰孢Fusarium oxysporum、茄病镰孢Fusarium solani和Fusarium cerealis.[结论]镰刀菌是引起新疆向日葵列当的主要致病菌,为向日葵列当生防菌的进一步筛选提供了菌株来源.     

不同营养和培养条件对向日葵黑茎病菌生长特性的影响

[目的]对向日葵黑茎病菌Phoma helianthi Taberosi生态适应性中的营养和培养条件进行研究,以期建立常规生物学检测方法,以便采取有效检疫处理措施.[方法]不同营养和培养条件下(包括培养基、碳源、氮源、温度、酸碱度、光照),对该菌培养7 d,测量其菌落直径大小和观察其生长状况.并用SPSS 12.0软件进行相应的计算处理、统计分析.[结果]向日葵黑茎病菌在PDA、HLA培养基上生长较好,在WA培养基上生长较慢.该病菌能充分利用可溶性淀粉和硝酸钾.在温度4-32℃均能生长,最适生长温度为24-28℃,适宜生长的PH4.0-8.0,最适PH5.0-7.0;在全光照培养条件下有助于菌丝的生长.[结论]通过不同营养和培养条件下的生长情况,可知该病菌的最适生长条件,有助于对该病菌进行有效的检疫处理.     

向日葵黑茎病发生规律及综合防治技术研究

[目的]向日葵黑茎病 Leptosphaeria ifndquisdi Frezzi,无性态:Phorna macdonaldi Boerma是国内新发生的检疫性病害,严重威胁着我国向日葵产业的发展.对新疆向日葵黑茎病发生分布、危害、病原菌、症状及发病规律等进行了综述,提出了防控对策.[结果]明确了向日葵黑茎病在新疆的发生分布范围、症状特征、病原形态和发病规律.[结论]向日葵黑茎病现分布新疆伊犁哈萨克自治州、博尔塔拉蒙古自治州、昌吉回族自治州9县3市;田间症状为叶柄处黑色椭圆形病斑,造成植株死亡;日照时数与病情指数呈负相关,与降雨次数无关,与降雨量呈正相关,与日照时数呈负相关;加强以植物检疫和种植抗病品种为主的防控措施,能控制其发生蔓延危害.     

国内新病害——向日葵茎点霉黑茎病在新疆伊犁河谷的发生初报

2005~2007年在新疆伊犁河谷发现一种蔓延迅速、危害严重的向日葵病害。经鉴定,确定其为国内新病害——向日葵茎点霉黑茎病。病原菌无性态分类地位为半知菌亚门,茎点霉属,种名为:Phoma macdonal-diiBoerma;有性态分类地位为子囊菌亚门,小球腔菌属,种名为:Leqtosphaeria lindquistiiFrezzi。该病目前已在伊犁河谷5县1市的向日葵产区普遍发生,造成严重危害。根据2007年在严重发病县的调查,该病在特克斯县发病面积达2 625 hm2,田间发病率平均为47%,绝收面积达267 hm2;新源县发病面积达1 333 hm2,平均田间发病率为35%;绝收面积达133 hm2。严重受害的向日葵品种有瑞特姆、JN-2519,M0314,KWS303。     

茄子烂秆病的病原鉴定

从湖南省寄来茄子病样中分离出引起茄子烂秆病的病原真菌,对该菌进行了形态学观察、致病性测定及分子鉴定。结果表明,病原菌形态学鉴定为拟茎点霉(Phomopsis vexans)。对菌株HNQJ的核糖体RNA基因内转录间隔区(rDNA-ITS)进行PCR扩增和序列测定,并在GenBank中进行比对分析,根据rDNA-ITS序列分析结果结合病株症状和病菌的形态学特征,认为湖南茄子烂秆病的病原菌为拟茎点霉。     

一株蓝麻黄拮抗内生真菌的分离鉴定及代谢物的初步分析

[目的]分离获得对农作物致病菌有高效拮抗作用的植物内生菌,并对其进行系统鉴定和代谢成分分析.[方法]用研磨法从蓝麻黄中分离内生真菌,并用琼脂扩散法筛选具有抗农作物致病菌活性的内生真菌;利用菌株形态特征和ITS-5.8S rDNA序列分析进行拮抗菌鉴定,经酚硫酸法测定多糖含量.[结果]从蓝麻黄中分离得到5株内生真菌,其中XJEG-GF-79对葡萄白腐病菌的抑菌圈直径为23 mm.经形态学观察和分子分类学分析鉴定,内生拮抗真菌XJEG-GF-79与Pleosporaceae sp. SN-2008同源性达到100;,该菌株代谢产物中含有生物碱和多糖,其经测定,发酵液中多糖含量为1.914 mg/mL.[结论]蓝麻黄内生真菌XJEG-GF-79对葡萄白腐病菌有明显的拮抗作用,最终鉴定为链格孢霉 Pleosporaceae sp..     

国内新病害——向日葵茎点霉黑茎病在新疆伊犁河谷的发生初报*

 2005~2007年在新疆伊犁河谷发现一种蔓延迅速、危害严重的向日葵病害。经鉴定,确定其为国内新病害——向日葵茎点霉黑茎病。病原菌无性态分类地位为半知菌亚门,茎点霉属,种名为：Phoma macdonaldii Boerma;有性态分类地位为子囊菌亚门,小球腔菌属,种名为：Leqtosphaeria lindquistii Frezzi。该病目前已在伊犁河谷5县1市的向日葵产区普遍发生,造成严重危害。根据2007年在严重发病县的调查,该病在特克斯县发病面积达2625hm ²,田间发病率平均为47%,绝收面积达267hm ²;新源县发病面积达1333hm ²,平均田间发病率为35%;绝收面积达133hm²。严重受害的向日葵品种有瑞特姆、JN-2519,M0314,KWS303。     

湖南永州奈李果实一种新病害的病原鉴定

[目的]明确危害湖南永州奈李果实新发生病害的病原物种类,为更好地识别并防控该病害提供理论依据.[方法]用常规分离方法对湖南永州奈李果园发病样品进行病原菌分离,通过形态学特征观察,ITS、TUB、CAL和ACT序列和系统发育进化树分析及致病性测定,对分离获得的病原菌进行鉴定.[结果]分离获得的病原菌形态学特征与大豆拟茎点霉(Phomopsis longicolla)一致;其ITS、TUB、CAL、ACT序列与P.longicolla同源性分别为98%、99%、99%和98%.室内人工接种病原菌3~5 d后果实形成椭圆形至不规则形褐色病斑、后转腐烂等症状,与田间果实危害症状一致.[结论]初步确定危害湖南永州奈李果实的病原菌为P.longicolla YZ.     

寡糖诱导向日葵抗锈病超微结构

 【目的】利用电子显微镜技术研究寡糖处理向日葵植株后对锈菌侵染的抑制作用,以揭示寡糖诱发子在细胞学水平的作用机理。【方法】通过寡糖喷雾处理向日葵叶片,2 d后接种锈菌,利用扫描和透射电镜对寄主及病原菌超微结构进行了研究。【结果】诱导处理后有部分夏胞子向内凹陷,萌发受到抑制。寄主细胞对于病原菌的侵入产生了防卫反应结构和物质。表现为寄主细胞壁加厚,染色加深,寄主细胞壁下产生黑色物质沉积;吸器壁加厚,吸器外间质变宽,部分吸器畸形坏死;细胞器变形、空泡化,最终寄主细胞解体、坏死。【结论】寡糖处理对病原菌有一定的抑制作用并可诱导向日葵产生对锈病的抗病性。     

向日葵白锈病菌巢式PCR检测方法的研究

[目的]建立向日葵白锈病菌(Albugo tragopogi(Persoon)Schruter var helianthi Novotlenova)的巢式PCR检测方法.[方法]用通用引物NL1/NL4对采自伊犁的向日葵白锈病菌进行PCR扩增、克隆、酶切和测序,设计该病菌的特异性引物,用巢式PCR法检测供试样品.[结果]序列测定和比对结果表明,该病菌的核酸序列与GeneBank公布的向日葵白锈病菌核酸序列同源率为97;.针对该段基因设计向日葵白锈病菌的特异性引物ATHP3/ATHP4,用巢式PCR法对供试样品进行扩增,扩增片段为370bp.[结论]成功建立了向日葵白锈病菌巢式PCR检测方法.     

新疆甜瓜枯萎病、根腐病病原菌鉴定

[目的]采用形态学观察和分子鉴定方法对甜瓜病原菌新疆株(前人鉴定为枯萎病病原菌Fusarium oxysporum(Schi)f.sp.melonis Snyder et Hansen)、枯萎病病原菌辽宁株和根腐病病原菌(Fusarium solani (Mart.) Sacc.)进行研究,确定病原菌新疆株的种类.[结果]对病原菌新疆株进行形态学观察发现其有蓝色色素,维管束变褐不向上发展.此后又对三种病原菌进行了大亚基rDNA-D1/D2区序列分析、rDNA-ITS区序列分析,两者分析结果表明病原菌新疆株与根腐病病原菌同源性高.[结论]分子鉴定与形态学鉴定结果一致,表明病原菌新疆株为腐皮镰孢菌(Fusarium solani (Mart.) Sacc.)而非尖镰孢菌(Fusarium axysporum(Schi.)f.sp.melonis Snyder et Hansen),是根腐病病原菌,与前人鉴定结果不同.     

向日葵黄萎病菌生物学特性及致病性研究

[目的]明确新疆向日葵黄萎病病原菌种类,分析病害规律,研究防病关键技术.[方法]采用形态分类方法对病原菌进行种的鉴定,采用一般生物学方法对病原菌重要生物学特性及致病性进行研究.[结果]病原菌种的鉴定结果表明,新疆向日葵黄萎病主要致病菌为大丽轮枝菌(Verticillum dahliae)和硫色轮枝菌(Verticillum sulphurellum);病原菌生物学特性研究表明:两种病原菌的生长周期及温度适应性基本一致,生长周期约为10 d,病菌生长温度范围为10～ 30℃,最适生长温度为25℃,致死温度为52C;大丽轮枝菌较适宜的酸碱范围为pH5.1～11.1;硫色轮枝菌在pH4.1 ～11.1均可生长;在多种常用培养基中,燕麦培养基是大丽轮枝菌的最适培养基;而玉米片培养基是硫色轮枝菌的最适培养基.致病性研究表明:自然条件下,病菌自苗期开始整个生育期均可侵染;人工接种条件下,高湿及有伤接种有利于侵染和发病.[结论]新疆向日葵黄萎病的主要病原菌为大丽轮枝菌和硫色轮枝菌,两种病原菌对向日葵均有较强的致病性.     

阿克苏地区枣黑斑病菌 PCR 检测方法的建立与应用

【目的】建立枣黑斑病菌的分子检测方法,研究枣黑斑病菌田间侵染动态,分析病害防治的最佳时间,为枣黑斑病的高效防治奠定基础。【方法】利用文献公布的枣黑斑病菌(Alternaria alternata) HSP70序列特异性引物,通过PCR技术进行引物特异性验证与灵敏度检测,优化反应体系,建立病原菌分子检测技术,并应用该技术确定枣黑斑病菌侵染动态监测和越冬场所。【结果】该检测技术对枣黑斑病菌的检测的最低浓度为4.886 pg/μL,可在病害症状未显症之前检测到病原菌,对病原菌的越冬场所进行检测与验证病果、病叶及冠下表层土壤是枣黑斑病菌越冬的主要场所。【结论】建立的枣黑斑病菌检测技术能够快速准确的检测和鉴定病原菌,可应用于枣黑斑病菌田间侵染动态和越冬场所的监测与验证,为阿克苏地区枣黑斑病的流行监测和早期防治提供了技术支持。