猪圆环病毒2型与猪细小病毒混合感染对仔猪致病性的研究

对35日龄健康仔猪进行人工单独或混合感染猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒2型(PCV2),采用临床症状、组织病理学变化和血清学检测等手段,比较了不同实验组攻毒后仔猪的症状差异。实验结果显示:PPV和PCV2混合感染能够引起更加严重的断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)症状,并加重PCV2引起的间质性肺炎和仔猪消瘦的严重程度;混合感染后,仔猪病毒血症出现更早,持续时间更长,且病毒含量明显高于单独感染组;混合感染组仔猪的PCV2 ELISA抗体水平和血清抗体水平均显著高于PCV2单独感染组的。说明PPV能够明显增强PCV2的临床症状,加重PMWS的发病程度。     

猪圆环病毒2型与猪细小病毒混合 感染对仔猪致病性的研究

对35日龄健康仔猪进行人工单独或混合感染猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒2型(PCV2),采用临床症状、组织病理学变化和血清学检测等手段,比较了不同实验组攻毒后仔猪的症状差异。实验结果显示:PPV和PCV2混合感染能够引起更加严重的断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)症状,并加重PCV2引起的间质性肺炎和仔猪消瘦的严重程度;混合感染后,仔猪病毒血症出现更早,持续时间更长,且病毒含量明显高于单独感染组;混合感染组仔猪的PCV2 ELISA抗体水平和血清抗体水平均显著高于PCV2单独感染组的。说明PPV能够明显增强PCV2的临床症状,加重PMWS的发病程度。     

PCV-2感染仔猪淋巴结中的病毒定位与细胞凋亡

 【目的】了解PCV-2感染仔猪后,病毒在腹股沟淋巴结中的位置、凋亡细胞的类型及其两者之间的关系。【方法】选用9头32日龄PCV-2抗体阴性的普通断奶仔猪,随机分为3组,即对照组、PCV-2攻毒组（PCV-2组）、PCV-2攻毒后再用钥匙孔血蓝蛋白（KLH）刺激组（PCV-2＋KLH组）,每组3头。感染后32 d采集腹股沟浅淋巴结制作石蜡切片。采用免疫组织化学方法对病毒进行定位,用末端标记法（TUNEL）进行细胞凋亡的定位测定,并用流式细胞法对细胞周期和细胞凋亡进行定量检测。【结果】PCV-2组和PCV-2＋KLH组仔猪淋巴结的主要病变为皮质和副皮质区淋巴细胞严重缺失,上皮样巨噬细胞浸润,巨噬细胞胞浆内见有病毒包涵体,病毒主要存在淋巴小结的上皮样巨噬细胞中;PCV-2组和PCV-2＋KLH组仔猪淋巴结中的淋巴细胞凋亡严重,且主要是淋巴小结内的淋巴细胞发生凋亡;流式细胞仪检测PCV-2组和PCV-2＋KLH组仔猪淋巴结的细胞凋亡率分别为3.34%、4.88%,明显高于对照组0.41%的细胞凋亡率（P＜0.05 和P＜0.01）;表明细胞增殖活性的增殖指数(PI)分别是：0.17±0.01、0.12±0.01和0.12±0.04,3组间虽无统计学差异,但对照组高于2个实验组。【结论】PCV-2可通过抑制细胞增殖和促进细胞凋亡导致淋巴结中淋巴细胞的严重缺失,这可能是PCV-2感染引起仔猪免疫抑制的重要机理之一。     

高致病性PRRSV与PCV2共感染协同致病性研究

【目的】为阐明高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（HP-PRRSV）和猪圆环病毒2型（PCV2）的协同致病作用,澄清两种病毒不同时间顺序共感染与其协同致病力之间的关系。【方法】选取35日龄阴性健康猪30头,随机分6组,PCV2/HP-PRRSV顺序共感染组、HP-PRRSV/PCV2顺序共感染组、HP-PRRSV+PCV2同时共感染组、HP-PRRSV感染组、PCV2感染组、未接种对照组。感染后每天测量体温、观察临床症状,每周称量体重、采血。用流式细胞仪检测血液中的CD3+ CD4+ CD8-、CD3+ CD4- CD8+、γδT、NK细胞及粒细胞和单核细胞变化;免疫过氧化物酶单层细胞试验（IPMA）检测这两种病毒抗体变化;用ELISA法检测血清中IFN-γ、TNF-α、IL-10、IL-2、GM-CSF细胞因子变化;用荧光定量PCR法检测血清和组织中病毒载量。对各组试验猪进行组织病理学观察。【结果】HP-PRRSV/PCV2顺序共感染组临床症状最严重,死亡率达60%;组织和血清中病毒载量显著高于其它组,抗体滴度明显低于其它组;淋巴细胞亚群及细胞因子（尤以TNF-α）变化也最为明显。【结论】HP-PRRSV和PCV2之间存在协同致病作用,且猪群先感染HP-PRRSV后感染PCV2可明显提高猪群发病率和死亡率。本研究对临床HP-PRRSV和PCV2的综合防制提供科学依据。     

猪PRRSV单独感染及与PCV2混合感染的免疫病理学研究

通过人工感染40日龄断奶仔猪建立PRRSV单独感染以及与PCV2混合感染病理模型,对两种感染所致猪免疫器官组织和外周血淋巴细胞的病理变化进行比较研究。结果表明PRRSV单独感染以及与PCV2混合感染均能引起猪的淋巴结指数升高,混感组多处淋巴结指数显著高于PRRSV单独感染组,病理组织学观察表明,指数升高并非缘于淋巴组织增生,而是急性渗出性或慢性特殊肉芽肿性炎症所致。PRRSV单独感染能引起免疫器官以淋巴细胞及巨噬细胞变性坏死为特征的急性炎症,而混合感染不但加重了上述病变,后期还造成脾脏严重的淋巴滤泡缺失和淋巴结肉芽肿性炎症。两种感染均可诱发不同程度的淋巴细胞和巨噬细胞凋亡,但混合感染时细胞凋亡更加严重且持续时间更长。凋亡主要见于早期,后期则主要表现坏死性病变。早期淋巴细胞凋亡以及后期淋巴组织坏死是造成免疫器官实质细胞缺失,机体出现免疫抑制的主要原因之一。     

PCV2与PPV体外混合感染猪肺泡巨噬细胞对细胞因子的影响

通过PCV2与PPV混合感染猪肺泡巨噬细胞,探讨PCV2与PPV体外混合感染的致病机制。体外分离猪肺泡巨噬细胞(PAMs),分为PCV2、PPV、PCV2/PPV混合感染组和对照组,采用实时荧光定量PCR技术检测PAMs中PCV2与PPV病毒拷贝数及细胞因子IFN-γ、TNF-α和IL-10的mRNA转录水平的变化。结果表明,PPV能在PAMs中增殖,而PCV2在肺泡巨噬细胞中增殖效率较低;PCV2能促进PPV增殖;PPV单独感染PAMs后能促进IFN-γ和TNF-α的表达;PCV2单独感染PAMs后能促进IFN-γ的表达,并在感染早期促进TNF-α的表达;PCV2与PPV混合感染后能显著抑制IFN-γ的表达,在感染早期对TNF-α的促进作用高于PCV2单独感染组,并能短暂的刺激IL-10的过量表达。说明PCV2与PPV混合感染存在协同致病作用,两种病毒共同刺激了TNF-α和IL-10的大量表达,抑制了IFN-γ的表达。     

猪圆环病毒2型感染不会诱发猪肺泡巨噬细胞凋亡

将猪圆环病毒2型(PCV2)BF株经口、鼻接种40日龄健康普通仔猪,在接种后不同时相宰杀,收集肺泡巨噬细胞,用流式细胞术和琼脂糖凝胶电泳检测其凋亡现象,分析PCV2感染对猪肺泡巨噬细胞凋亡的影响。结果显示,在整个试验期内,与对照组相比,两种方法均未检测到攻毒组肺泡巨噬细胞出现凋亡上升现象,表明PCV2感染不会诱发猪肺泡巨噬细胞凋亡。     

PCV2对体外培养仔猪淋巴细胞凋亡的影响

选用4头猪圆环病毒2型（porcine circovirus 2,PCV2）血清抗体阴性的普通断奶仔猪,无菌取脾脏,分离淋巴细胞,分为对照组和试验组进行体外培养。试验组在培养体系中加入一定量的PCV2。分别在培养后的0、2、4、6、12、24、36和48h收获淋巴细胞。用电子显微镜、DNA琼脂糖凝胶电泳对细胞凋亡进行定性测定,用流式细胞术对细胞周期和细胞凋亡率进行定量测定,同时测定了凋亡相关蛋白半胱天冬酶3（Caspase-3）的表达情况。结果显示,PCV2作用后不同时间,DNA电泳均呈现出具细胞凋亡特征的梯形条带;电镜下出现细胞凋亡各期的形态学变化。从培养后4h开始,试验组淋巴细胞凋亡率均显著高于对照组（P〈0．05）;而表示细胞增殖活性的增殖指数（PI）,试验组在2、4、6、12和24h均比对照组显著下降（P〈0．05）;表达Caspase-3的细胞百分率,除0h外,试验组均显著高于对照组（P〈0．05）。上述结果表明,PCV2能引起体外培养的仔猪淋巴细胞凋亡率增加,细胞增殖活性下降,且Caspase-3是PCV2诱导淋巴细胞凋亡的重要调节物。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒2型混合感染的流行病学调查

为研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪圆环病毒2型(PCV2)在我国猪场混合感染的发病情况,根据Gen Bank中PRRSV ORF5及PCV2 ORF1基因序列设计合成引物,建立了分别用于检测PRRSV、PCV2的RT-PCR及PCR方法,对2013—2015年采自吉林、辽宁、黑龙江、山西、山东、广东6省192份样品进行检测。结果发现:PRRSV感染率为22.9%,PCV2感染率为64.3%,28份样品为混合感染阳性,阳性率达14.58%。猪群中PRRSV和PCV2的感染比较普遍,混合感染率也较高,加重了疫病防控的难度。     

猪圆环病毒2型（PCV2）的致病机理

猪圆环病毒2型（PCV2）是近年来发现的一种新病毒。该病毒主要侵害哺乳仔猪和育肥猪。PCV2感染可造成猪免疫系统的损伤．引起感染猪的T淋巴细胞、B淋巴细胞数量减少：细胞因子的表达量改变。同时,PCV2感染的靶细胞在胎儿期是心肌细胞、肝细胞和巨噬细胞,而出生后只有巨噬细胞。因而推测猪感染PCV2后,机体的免疫力下降,感染猪处于亚健康状态．其它病原如猪呼吸与繁殖综合症病毒（PRRSV）、猪细小病毒（PPV）等,或应激因素如免疫刺激等多种因素都可加重PCV2感染猪的病情．进而发展成临床症状和病理变化较明显的断奶后多系统衰竭综合症、皮炎和肾病综合症等与猪圆环病毒相关的疾病。     

多重PCR检测猪伪狂犬病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒2型的研究

根据GenBank上已发表的猪伪狂犬病毒(PRV)的gH基因、猪细小病毒(PPV)的VP2基因序列和猪圆环病毒2型(PCV2)的ORF2基因序列,设计合成了3对特异引物,分别建立了PRV,PPV和PCV2的单项PCR诊断方法;通过对扩增条件的筛选,建立了PRV,PPV,PCV2的复合PCR诊断方法,利用1次PCR反应,即可同时扩增PRV的355 bp,PPV的195 bp和PCV2 487 bp的特异性片段,而猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、正常细胞(PK-15)扩增结果均为阴性,对PRV,PPV,PCV2的最低检出量分别为100 fg,1 pg和10 pg的DNA.该方法适合对PRV,PPV和PCV2的联合检测和鉴别诊断.     

猪源Lin28基因的克隆及其在猪胎儿成纤维细胞中的表达

Lin28广泛地表达于早期胚胎中,是重编程的一个重要诱导因子.根据GenBank中公布的猪源Lin28的序列设计合成引物,以猪桑葚胚cDNA为模板,通过RT-PCR方法扩增其编码区全序列.将此克隆片段连接到PMXs表达载体上,构建逆转录病毒载体PMXs-Lin28.在293T细胞中包装携带Lin28基因的逆转录病毒,感染猪如猪胎儿成纤维细胞(Porcine embryonic fibroblasts, PEF).免疫荧光及Real-time结果显示,PMXs-Lin28载体能够介导Lin28 mRNA和蛋白质在猪胎儿成纤维细胞中的高效表达,Lin28基因能够激活Oct4、Sox2、Nanog、Klf4和c-Myc基因的表达.     

猪尿酸氧化酶基因的克隆及表达

本研究主要涉及猪尿酸氧化酶(urate oxidase,EC 1.7.3.3)的原核表达载体的构建及蛋白表达,并对其酶活性进行测定。从猪肝组织细胞中提取总的RNA,利用RT-PCR技术克隆pUOX(porcine urate oxidase),插入原核表达载体pET-22b中,构建重组表达载体pET-22b/pUOX,并转化到大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中。通过IPTG诱导获得的重组蛋白经SDS-PAGE检测,在约34 ku处有一清晰蛋白条带,这与预期分子量一致。测定该重组蛋白的酶活力达到1.962 U,这为后期实验奠定了重要的基础。     

猪传染性胸膜肺炎的诊断与治疗

安阳某猪场暴发了以体温升高,呼吸困难为临床特征的急性传染病,经病理学变化和实验室诊断,确诊该病为猪传染性胸膜肺炎。经药敏试验筛选出高敏抗生素恩诺沙星,用于临床治疗,有效控制了该病。     

猪伪狂犬病病毒的分离与鉴定

用猪睾丸细胞(ST细胞)从1只发病仔猪的脑组织中分离到1株病毒,第6代时的毒价为107.75 TCID50/mL.用猪伪狂犬病病毒特异性引物可从该病毒细胞培养物中扩增出与预期大小相同的gB基因部分核苷酸片段.测序结果表明:该gB基因的部分序列与GeneBank登录的5株PRV同源性为98.0％～99.5％.接种家兔后可观察到典型的伪狂犬病临床症状,ELD50为10-7.50/mL,分离毒可被PRV阳性血清中和.该分离毒为猪伪狂犬病病毒强毒株.     

PRRSV对猪树突细胞可溶性CD83释放影响的分析

为研究猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)感染是否促进猪树突细胞可溶性CD83(sCD83)的释放,在体外用PRRSV感染猪树突细胞,通过ELISA检测了树突细胞培养基sCD83的含量,结果显示PRRSV可明显提高猪树突细胞培养基sCD83的含量,表明PRRSV促进树突细胞sCD83的释放。为研究PRRSV对猪树突细胞CD83表达的影响,用RT-PCR和流式细胞术分别检测了细胞CD83mRNA的水平和细胞膜CD83的含量。结果显示PRRSV可提高猪树突细胞CD83 mRNA的水平,然而对细胞膜CD83的含量影响不大,说明PRRSV促进sCD83释放的作用高于刺激CD83表达的作用,致使膜结合的CD83保持较低的水平。PRRSV诱导树突细胞sCD83的释放为探讨PRRSV感染引起免疫抑制提供了重要的线索。     

猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒的RT-PCR鉴别诊断

猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）为套式病毒目冠状病毒科、冠状病毒属的病毒，引起猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea，PED）。该病是一种猪肠道传染病，以水泻、呕吐和脱水为特征，各种年龄的猪均易感染，哺乳仔猪、架子猪或育肥猪的发病率可达100％，尤其是哺乳仔猪受害最严重，该病主要发生于冬季，夏季也可发生。猪传染性胃肠炎病毒（porcine transmissible gastroenteritis virus，TGEV）为套式病毒目冠状病毒科、冠状病毒属的病毒，是猪传染性胃肠炎（porcine transmissible gastroenteritis，TGE）的主要病原。该病是一种急性、高度接触性传染病，以呕吐、严重腹泻、脱水为特征的传染病，对新生仔猪具有高度致死率。虽然不同年龄的猪对这种病毒均易感，但5周龄以上的猪死亡率较低，多成僵猪，使养猪饲料报酬降低。     

猪PRRSV、PCV2、大肠杆菌与沙门氏菌四重混合感染的报道

应用RT-PCR、PCR和细菌分离等方法,对陕西某规模化养猪场发生的仔猪渐进性消瘦、呼吸困难和母猪繁殖障碍为主要特征的疾病进行了流行病学调查和病原分离鉴定。结果表明,该猪场猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和2型猪圆环病毒(PCV2)感染相当严重,从出现胸肺粘连的病猪实质脏器中可分离到致病性大肠杆菌和沙门氏菌,未分离到胸膜肺炎放线杆菌。该猪场此次疫情主要是由于猪PRRSV、PCV2、大肠杆菌和沙门氏菌四重混合感染而引起。     

猪Musclin基因片段克隆与序列分析

【研究目的】克隆并分析猪musclin基因;【方法】肌肉组织提取总RNA,利用设计的引物进行RT-PCR,PCR产物与pMD19-T连接后转化E.coliDH5α,检测阳性克隆并测序;【结果】克隆的猪musclin基因片段与人、大鼠、小鼠同源性分别为86%、78%、75%,预测的氨基酸序列含有“KKKR”结构和与小鼠ANP、BNP、CNP蛋白的同源性区域;【结论】克隆了猪musclin基因片段并注册GenBank(Ac-cession.EF369511)。     

猪转基因克隆技术的研究与应用

综述了国内外利用转基因克隆技术生产转基因猪的技术途径、研究状况以及发展趋势.