致病性荧光假单胞菌FK-1的分离鉴定及其感染草鱼后免疫因子的变化研究

对具有典型病症的染病草鱼进行了病原菌分离鉴定。从其肝脏中分离得到病原菌菌株FK-1,经VITEK-32全自动细菌鉴定仪鉴定为荧光假单胞菌。同时,研究了荧光假单胞菌FK-1侵染草鱼对草鱼机体免疫因子的影响,通过腹腔注射荧光假单胞菌FK-1,在侵染后不同时间点取草鱼的血液和肝脏组织,分别采用分光光度计法和ICP-AES法检测血清和肝脏中的铁元素含量,同时采用实时荧光定量PCR法对铁调素基因(hepc)、白细胞介素基因(il-6)、JAK/STAT信号通路的蛋白质酪氨酸激酶3基因(jak3)、信号转导和转录激活因子3基因(stat3)等基因表达量进行检测。结果表明,荧光假单胞菌FK-1侵染草鱼后,草鱼机体血清中铁元素浓度明显降低,在24、48 h时显著低于对照组,总铁结合力有所上升,但没有达到显著水平;肝脏中铁元素含量相对于对照组没有达到显著性差异水平,但仍有明显升高。肝脏中hepc基因的表达量显著上升; il-6、jak3和stat3基因表达量开始均明显上调,随后上升不明显,但各时间点的表达量均高于对照。表明草鱼机体通过调节铁调素基因(hepc)等铁元素相关基因的表达,进而降低自身游离铁元素和增加储存铁元素来应对荧光假单胞菌FK-1的侵染。     

溶血性嗜水气单胞菌XF-6的分离鉴定及其对鲥鱼机体免疫功能的影响

【目的】本文研究了湖北省武汉市一些养殖场鲥鱼发病原因以及致病菌对其免疫因子的影响。【方法】采用划线培养方法对染病鲥鱼进行了病原菌分离鉴定,从其肝脏中分离得到病原菌XF-6,经VITEK-32全自动细菌分析仪鉴定,为嗜水气单胞菌。用多重PCR方法确认嗜水气单胞菌XF-6属于溶血性嗜水气单胞菌,含有气溶素基因(aer A)和溶血素基因(ahh1)。同时研究了嗜水气单胞菌XF-6侵染对鲥鱼机体免疫功能的影响,通过腹腔注射嗜水气单胞菌XF-6,在侵染后不同时间点采集鲥鱼的血液和肝脏,分别采用分光光度计法和ICP-AES法检测血清和肝脏铁浓度,运用实时荧光定量PCR法对铁调素基因(hepc)、白细胞介素基因(il-6)、JAK3/STAT3信号通路的酪氨酸激酶3基因(jak3)、信号转导和转录激活因子3基因(stat3)的表达量进行检测。【结果】侵染嗜水气单胞菌XF-6后,鲥鱼血清中铁浓度明显降低,在12、24、48 h时显著低于对照组;血清中总铁结合力有所上升,但没有达到显著水平;肝脏中铁浓度相对于对照组没有达到显著性差异水平,但仍有升高。肝脏中hepc基因的表达量在6、12、24 h时显著上升;肝脏中il-6基因的表达量在12、24、48 h时显著上升、肝脏中jak3基因的表达量在12、24 h时显著上升,肝脏中stat3基因的表达量在6、12、24 h时显著上升。这4种基因表达量随后有所下降,但各时间点的表达量均高于对照。【结论】鲥鱼机体通过调节铁调素基因(hepc)、白细胞介素基因(il-6)、JAK3/STAT3信号通路的酪氨酸激酶3基因(jak3)、信号转导和转录激活因子3基因(stat3)等铁相关基因的表达,进而降低自身游离铁浓度和增加储存铁浓度来应对病原菌的侵染。     

红龙鱼源β-溶血性嗜水气单胞菌AH的分离及其对机体铁代谢的影响

对具有典型败血症病症的染病红龙鱼进行病原菌分离鉴定分析。从其肝脏中分离得到病原菌菌株AH,经VITEK-32全自动细菌分析仪鉴定为嗜水气单胞菌。通过多重PCR检测确认该嗜水气单胞菌AH属于β-溶血性嗜水气单胞菌,含有气溶素基因(aer A)和溶血素基因(ahh1)。此外研究嗜水气单胞菌AH侵染红龙鱼后对其机体铁代谢的影响,通过腹腔注射嗜水气单胞菌AH,在侵染后不同时间点收集红龙鱼的血液和肝脏组织,分别采用分光光度计法和电感耦合等离子体原子发射光谱(inductively coupled plasma-atomic emission specrometry,简称ICP-AES)法检测红龙鱼血清和肝脏中的铁含量,同时采用实时荧光定量PCR法对铁调素基因(hepc)、白细胞介素基因(il-6)、JAK/STAT信号通路的蛋白质酪氨酸激酶3基因(jak3)、信号转导子和转录激活因子3基因(stat3)表达量进行检测。结果表明,侵染嗜水气单胞菌AH后,红龙鱼血清中铁浓度明显降低,在24、48h时显著低于对照组,总铁结合力有所上升,但没有达到显著水平;肝脏中铁含量相对于对照组差异没有达到显著水平,但仍有明显升高。肝脏中hepc基因的表达量在一定时间范围内显著上升;il-6、jak3和stat3基因表达量开始均有所上调,随后有所下降,但在各时间点的表达量均高于对照。由结果可知,机体通过调节铁调素基因(hepc)等铁相关基因的表达,进而降低自身游离铁含量,并增加储存铁含量来应对细菌的侵染。     

嗜水气单胞菌感染对团头鲂肝脏铁代谢的影响

为研究细菌感染对鱼类肝脏铁代谢的影响,以团头鲂为研究对象,通过腹腔注射嗜水气单胞菌,在感染后不同时间点取团头鲂的血液和肝脏组织,分别采用分光光度法和ICP法检测血清和肝脏中的铁含量,采用实时荧光定量PCR法对铁代谢调节相关基因——铁调素(hepc)、白细胞介素6(il-6)、JAK/STAT信号通路的蛋白质酪氨酸激酶3(jak3)、信号转导子和转录激活因子3(stat3)等表达量进行检测。结果显示:感染嗜水气单胞菌后,团头鲂血清中铁浓度明显降低,在12、24h时显著低于对照组,总铁结合力有所上升,但没有达到显著水平;肝脏中铁含量相对于对照组虽没有达到显著性差异水平,但仍有明显升高。肝脏中hepc基因的表达量显著上升;il-6、jak3和stat3基因表达量开始均有所上调,随后有所下降,但各时间点的表达量均高于对照。试验结果说明,机体通过调节hepc等铁代谢相关基因的表达,进而降低自身游离铁和增加储存铁来应对病原菌的感染。     

养殖大菱鲆感染迟缓爱德华氏菌的分离、毒力基因及ERIC-PCR分析

为了调查辽宁省葫芦岛市养殖患病大菱鲆Scophthalmus maximus病原菌感染情况,选用迟缓爱德华氏菌Edwardsiella tarda特异性引物对分离菌株进行PCR鉴定,共分离得到22株迟缓爱德华氏菌。结果表明:迟缓爱德华氏菌毒力基因的PCR扩增显示,22株菌均含有kat B、fim A、gad B、esa V等基因;人工感染试验表明,22株迟缓爱德华氏菌感染并致大菱鲆累积死亡率均为100%;ERIC-PCR结果显示,迟缓爱德华氏菌模式菌株(ATCC15947)与分离株可分为2个基因型,分别标记为Ⅰ和Ⅱ型,其中22株迟缓爱德华氏菌分离株均为Ⅱ型,与ATCC15947菌株为Ⅰ型明显不同。本研究结果为养殖大菱鲆迟缓爱德华氏菌感染的防控提供了依据。     

丝氨酸蛋白酶Pic在迟缓爱德华氏菌侵染鱼类中的作用

本研究用染色体步移的方法从一株鱼类致病性迟缓爱德华氏菌TX01中克隆了丝氨酸蛋白酶的一个重要成员Pic基因,并利用缺失突变的方法构建了其基因突变株TXPic。通过比较突变株与野生株侵染大菱鲆及其外周血白细胞和头肾单核细胞的差异,发现TXPic的侵染能力较TX01有明显降低,这表明Pic可能作为毒力因子在迟缓爱德华氏菌侵染过程中发挥重要作用。     

地图鱼迟钝爱德华氏菌病病原菌的鉴定及毒力基因的检测

从患病地图鱼Astronotus ocellatus肝脏组织中分离到菌株AO1,经人工感染试验证实其为致病菌。通过ATB Expression半自动细菌鉴定仪和常规生理生化特性的分析,初步鉴定该菌株为迟钝爱德华氏菌Ed-wardsiella tarda。测定菌株AO1的16S rRNA基因序列并进行分析,结果显示,该菌株与迟钝爱德华氏菌的同源性最高,达99.9%。因此,可鉴定该菌株为迟钝爱德华氏菌。根据迟钝爱德华氏菌的毒力基因菌毛亚基(fimA)基因序列设计引物,进行PCR扩增,得到383 bp序列,该序列与迟钝爱德华氏菌的fimA基因序列相似性达99.0%,进一步说明菌株AO1具有fimA基因,有一定的致病力。药物敏感试验结果表明,菌株AO1对阿米卡星、氧氟沙星、庆大霉素、新生霉素、氨苄西林、氨曲南、卡那霉素、头孢咪啉、诺氟沙星、环丙沙星、呋喃妥因、妥布霉素、氨苄青霉素13种抗生素较为敏感。     

不同盐度下5种中草药对2种水产动物致病菌的抑菌效果比较

采用牛津杯法比较不同盐度(0、1%、2%、3%、4%)下五倍子、石榴皮、诃子、黄芩、乌梅5种中草药对迟缓爱德华氏菌和嗜水气单胞菌的抑菌效果,测定了最小抑菌浓度。结果表明,5种中草药对迟缓爱德华氏菌和嗜水气单胞菌都有不同程度的抑菌效果,其中黄芩和五倍子抑菌作用较强,乌梅抑菌作用较差,而诃子和石榴皮的抑菌作用一般,但石榴皮对嗜水气单胞菌的抑菌作用较为明显。不同盐度下,5种中草药对这2种致病菌的最小抑菌浓度(MIC)有差异。高盐度时,5种中草药对迟缓爱德华氏菌的MIC较低,均≤25 mg/m L,抑菌效果较好;而低盐度时,各个中草药MIC均在25 mg/m L及以上,抑菌效果较差。在盐度为0时,5种中草药对嗜水气单胞菌的MIC最低,抑菌效果最好。     

养殖大菱鲆迟缓爱德华氏菌的分离鉴定与系统发育分析

从患病的大菱鲆成鱼体内分离到一株致病菌(编号1101),经人工感染试验证实该菌具有较强的毒力(LD50=3.34×106CFU/mL),并能从病鱼中重新分离出此菌.应用API20E自动鉴定卡及16S rRNA序列分析等方法对该菌进行了综合鉴定.结果显示菌株1101为革兰氏染色阴性、氧化酶阴性、触酶阳性,API20E鉴定系统鉴定为迟缓爱德华氏菌,相似率达99%.测定了其16S rRNA序列,长度为1419 bp,在GenBank上经同源性比对与迟缓爱德华氏菌聚为一类,同源性达99%,据此鉴定为迟缓爱德华氏菌(Ewardsiela tarda).药敏试验结果表明菌株1101对多粘菌素较敏感,而对其它药物中度或不敏感.     

养殖大菱鲆迟缓爱德华氏菌的分离鉴定与系统发育分析

从患病的大菱鲆成鱼体内分离到一株致病菌(编号1101),经人工感染试验证实该菌具有较强的毒力(LD50=3.34×106CFU/mL),并能从病鱼中重新分离出此菌.应用API20E自动鉴定卡及16S rRNA序列分析等方法对该菌进行了综合鉴定.结果显示菌株1101为革兰氏染色阴性、氧化酶阴性、触酶阳性,API20E鉴定系统鉴定为迟缓爱德华氏菌,相似率达99%.测定了其16S rRNA序列,长度为1419 bp,在GenBank上经同源性比对与迟缓爱德华氏菌聚为一类,同源性达99%,据此鉴定为迟缓爱德华氏菌(Ewardsiela tarda).药敏试验结果表明菌株1101对多粘菌素较敏感,而对其它药物中度或不敏感.     

乌鳢体表粘液的抑菌作用

分析了乌鳢体表粘液对爱德华氏菌、溶藻弧菌、哈维氏弧菌3种海洋致病菌的抑菌效果及影响因素。结果表明,同浓度的提取物对不同致病菌的抑菌活性不同,对爱德华氏菌抑制活性最大,其次是溶藻弧菌,最差的是哈维氏弧菌。此外,温度、紫外线和pH对提取物抑制活性都有不同程度的影响。     

感染迟缓爱德华氏菌杂交鳢血清指标动态变化

[目的]研究感染迟缓爱德华氏菌后杂交鳢血清指标的动态变化。[方法]杂交鳢人工感染迟缓爱德华氏菌后,测定其血清指标的水平,并分析其动态变化特征。[结果]不同时间点感染组血糖浓度的平均值逐渐升高;不同时间点总蛋白、球蛋白、总胆红素、尿酸、尿素氮、肌酐、钙离子浓度的平均值以及谷丙转氨酶、谷草转氨酶、超氧化物歧化酶、碱性磷酸酶、溶菌酶、酚氧化酶活力的平均值先升高后降低,但不同时间点感染组的尿素氮之间无显著性差异(P0.05);淀粉酶、酸性磷酸酶的活力则先降低后升高。不同时间点对照组上述指标之间无显著性差异(P0.05)。[结论]杂交鳢感染迟缓爱德华氏菌后,除球蛋白和尿素氮外,其他血清指标相比对照组均发生了明显的异常变化(P﹤0.05),但最终大多数指标恢复至对照组水平。     

六须鲶暴发性败血症病原菌的分离与鉴定

从患暴发性败血症的六须鲶Silurus soldatovi身上分离到致病菌株（FY-024）,用常规细菌培养方法对其观察,并进行生理生化特性测试。结果表明,该致病菌均符合鲶爱德华氏菌Edwardsiella ictaluri特征。为了进一步确认该致病菌的分类地位,对其进行了16S rRNA基因序列分析、遗传距离距阵及系统发育树分析,共扩增出1 417 bp基因片段（GenBank登录号为GQ924477）。系统发育结果显示,菌株FY-024与鲶爱德华氏菌的16S rRNA基因同源性达99.6%～99.9%,聚为同一分支,进一步确认致病菌是鲶爱德华氏菌。药敏试验和毒力试验结果显示,菌株FY-024对环丙沙星、恩诺沙星药物高度敏感,按Reed和Muench氏法计算LD50=1.08×106 cfu/尾。     

副溶血弧菌VP-5的分离鉴定及其与鲈鱼免疫信号通路相互关系研究

为探讨福建省漳州市盛明养殖场鲈鱼的致病菌及其与鲈鱼免疫信号通路的相互关系,从而可以预防和治疗该疾病。解剖患病鲈鱼肝脏组织后划线培养分离纯化了致病菌VP-5。显微镜观察该致病菌VP-5形态为球杆状,弧形,有单鞭毛,运动活跃,革兰阴性菌。在VITEK-32全自动微生物分析仪鉴定后,该致病菌对酪氨酸、葡萄糖、甘露醇等反应阳性,对蔗糖,阿拉伯糖和棉子糖等反应阴性。分析了该致病菌16SrRNA和tdh1基因序列,发现其与副溶血弧菌的亲缘关系非常接近。综合后鉴定致病菌VP-5为副溶血弧菌。并研究了副溶血弧菌VP-5侵染鲈鱼后寄主免疫信号通路基因cd63/cxcr4/il-8的表达水平差异。鲈鱼腹腔注射感染副溶血弧菌VP-5,感染后0-96h解剖鲈鱼肝脏组织和表皮组织。采用Trizol试剂盒抽提鲈鱼总RNA,反转录后生成cDNA。利用实时荧光定量PCR技术对鲈鱼免疫信号通路基因cd63/cxcr4/il-8表达水平进行测定。鲈鱼受到副溶血弧菌VP-5感染后,免疫信号通路基因cd63/cxcr4/il-8在鲈鱼肝脏组织的表达量12h和24h时与对照组相比较差异显著(P<0.05)；在表皮组织的表达量在24h和36h时与对照组相比较差异显著(P<0.05)。证实鲈鱼肝脏组织免疫信号通路基因的表达与副溶血弧菌VP-5的感染正相关,相对于表皮组织反应更快。因此鲈鱼的免疫信号通路基因cd63/cxcr4/il-8积极反应于致病菌,这些基因的快速表达会引发鲈鱼自身免疫应答,增强其抵抗致病菌的能力。     

斑马鱼迟缓爱德华氏菌的鉴定、致病性及药物敏感性

从患病斑马鱼(Danio rerio)肝脏组织分离到菌株Z1,通过对该菌株形态特征、生理生化特性、ATB系统鉴定和16S rRNA、DNA促旋酶B亚单位蛋白(gyrB)基因测序等综合分析,鉴定Z1菌株为迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda).Z1菌株对健康斑马鱼和透明四带无须鲃(Puntius tetrazona)人工感染试验发现,感染发病症状与自然发病症状一致,再分离菌株的特性与Z1菌株相同,并再次感染成功,证实迟缓爱德华氏菌为斑马鱼病原菌.药敏试验发现Z1菌株对呋喃妥因等11种药物敏感,对苯唑西林等6种药物耐受.15种中草药对Z1菌株的体外抑菌试验结果发现,五倍子、石榴皮的抑菌作用明显,最小抑菌质量浓度(MIC)和最小杀菌质量浓度(MBC)均≤6.25 mg/mL;艾叶等有一定抑菌作用,MIC和MBC均在25～200 mg/mL;而野菊花等抑菌作用不明显,MBC＞200 mg/mL.     

爱德华氏菌疫苗的研究进展

爱德华民菌为重要的致病菌之一,能感染多种鱼类并造成大量死亡.该病原菌的暴发已经给美国、欧洲、亚洲（包括日本、中国等）国家带来了严重的社会和经济损失.长期以来,用于鱼类细菌性疾病防治的西药类药物,可导致病原菌产生耐药性,鱼体的药物残留会危害人类健康等,因而被限制使用.针对该菌的鱼类疫苗的研究又再度兴起,包括天然亚单位疫苗、活体重组疫苗、基因缺失苗和基因工程亚单位疫苗等.综述了爱德华氏菌的基本特征和各种疫苗的研究进展,以期为鱼类爱德华氏菌病的防治提供重要的参考资料.     

迟钝爱德华氏菌外膜蛋白基因工程表达产物的免疫原性

构建迟钝爱德华氏菌外膜蛋白重组表达载体后,表达纯化获得分子质量约53ku的外膜蛋白。将100尾日本鳗鲡均分为2组,分别腹腔注射牛血清白蛋白(BSA,0.5mg/mL)和迟钝爱德华氏菌外膜蛋白(Omp,0.5mg/mL)0.2mL/尾。于免疫后第7、14和28天采集鳗鲡血液、粘液、肝脏和肾脏,测定各时间点的补体活性、溶菌酶活性、全血细胞转化水平和血清抗体效价。结果发现,外膜蛋白组鳗鲡的补体活性于免疫后第7天极显著高于对照组;其抗体效价于第14天和第28天显著或极显著高于对照组。免疫后第28天以迟钝爱德华氏菌、嗜水气单胞菌和创伤弧菌(1.0×107 cfu)腹腔注射感染鳗鲡。结果发现,外膜蛋白组鳗鲡对迟钝爱德华氏菌、嗜水气单胞菌和创伤弧菌的相对免疫保护率分别为71.4%、50.0%和12.5%。表明鳗鲡注射迟钝爱德华氏菌基因工程表达外膜后显著提高了其对迟钝爱德华氏菌感染的抵抗力,对嗜水气单胞菌的感染也有明显的交叉保护效果,但对创伤弧菌的交叉保护效果较弱。     

7种常用渔药及组合对致病性鮰爱德华氏菌的体外抗菌试验

为探讨7种常用抗菌渔药对致病性鮰爱德华氏菌的体外抗菌作用,采用2倍稀释法测定了7种渔药对致病菌的最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC),在初筛MIC的基础上,以MIC、5倍MIC、10倍MIC和20倍MIC下平板抑菌圈直径为参数,分别比较5种药物抗菌效果并优化最佳参数;利用优化的最佳参数比较5种药物单独用药与联合用药对鮰爱德华氏菌的抑菌效果.结果表明,抗菌先锋对鮰爱德华氏菌的MIC和MBC最小,分别为3.2和6.4μg/mL,其次是伯乐立康,分别为12.8和25.6μg/mL,而鱼康和肠炎烂鳃灵的浓度为1638.4μg/mL时仍无抗菌效果;5倍MIC下抑菌圈直径为筛选抗菌药物的最佳参数,5倍MIC下,鮰爱德华氏菌对抗菌先锋高度敏感,对伯乐立康、菌必清、菌毒康和海鱼安中度敏感;菌必清+抗菌先锋的联合抗菌效果最佳.     

大菱鲆造血器官肿大病的病原分离、鉴定及药物敏感性

从患造血器官肿大病大菱鲆(Scophthalmus maximus)肾脏中分离到菌株NY79,对该菌株形态特征、生理生化特性和16S r RNA等综合分析,鉴定NY79为迟缓爱德华氏菌。NY79菌株对健康大菱鲆进行人工感染的试验发现,感染发病症状与自然发病症状一致,每条鱼的LD50为2.4×104 cfu,表明迟缓爱德华氏菌为大菱鲆造血器官肿大病的病原。药敏试验发现,NY79对阿莫西林等17种药物敏感,对红霉素等4种药物具耐受性。     

鱼用三联口服疫苗的制备方法及其对大菱鲆的免疫效果

为探究海水养殖中安全可靠、经济适用的疫苗接种方法,以药用淀粉、麦芽糊精,以及经0.5%甲醛灭活的溶藻弧菌Vibrio alginolyticus、副溶血弧菌V.parahemolyticus和迟缓爱德华氏菌Edwardsiella tarda为主要原料,采用挤出-滚圆法制备鱼用三联口服疫苗,并用其对大菱鲆Scophthalmus maximus免疫,分别在免疫0、7、14、21、28 d时测定溶藻弧菌、副溶血性弧菌和迟缓爱德华氏菌特异性抗体,以1×109cfu/m L活菌(3种菌液比例为1∶1∶1)进行攻毒试验并计算免疫保护率。结果表明,药用淀粉150 g、麦芽糊精50g、菌液60 m L、挤出速度200 r/min、滚圆时间60 s时,为比较成熟的三联口服疫苗制备工艺,用该疫苗免疫大菱鲆后,3种细菌的大菱鲆血清和后肠黏膜抗体效价均显著高于对照组,且免疫保护率达50%以上。