植物病毒表达载体pClYVV/CP/W的构建及GFP表达的研究

[目的]研究植物病毒表达载体pC1YVV/CP/W的构建及用pC1YVV/CP/W表达绿色荧光蛋白(GFP),为植物反应器生产有用蛋白、开发有效的植物病毒载体提供参考。[方法]用三叶草黄脉病毒侵染性全长cDNA克隆pC1YVV基因组的Mb/CP基因之间的一段多克隆位点和两侧含有病毒蛋白酶NIa切割识别序列的多聚脱氧核糖核苷酸接头,构建pC1YVV/CP/W载体,并将绿色荧光蛋白基因插入pC1YVV/CP/W中构建pC1YVV/CP/W/GFP载体,用反转录PCR对重组病毒克隆转录情况进行检测,并用Western杂交对重组病毒克隆表达的目的基因产物进行测定。[结果]pC1YVV/CP/W/GFP接种的蚕豆幼苗表现出与野生型C1YVV相同的症状,发病率达100%,表明重组病毒克隆pClYVV/CP/W/GFP有侵染性,外源基因的插入没有破坏载体pClYVV/CP/W的开放阅读框;外源基因在F_4子代病毒基因组中稳定存在;重组病毒克隆pC1YVV/CP/W/GFP至少到F_4子代病毒能稳定表达GFP。[结论]该研究结果为用植物表达有用蛋白提供了有用的植物病毒载体。     

植物病毒载体介导的可溶性甲烷单加氧酶B亚单位在蚕豆植物中的表达

用基因操作技术将编码可溶性甲烷单加氧酶B亚单位（Soluble Methane Monoxygermse-B component：SMMO-B）的基因全长序列导入来自三叶草黄脉病毒（Clover yellow vein virus；CIYVV）侵染性全长cDNA克隆的侵染性植物病毒表达载体pCIYVV／CP／W基因组的NIb／CP基因之间，构建了重组病毒克隆pCV—mmoB。用上述重组病毒克隆接种该病毒的自然寄主植物蚕豆，表现了与野生型CIYVV相同的症状。RT—PCR检测结果表明，子代病毒基因组中的外源基因获得了转录。蛋白质杂交（Western blotting；WB）检测结果表明，sMMO—B亚单位蛋白在被重组病毒克隆侵染的寄主植物中获得了表达。     

植物病毒表达载体pCIYVV／CP／W的构建及GFP表达

[目的]研究了植物病毒表达载体pCIYVV／CP／W的构建及用pClYVV／CP／W表达绿色荧光蛋白（GFP）,为植物反应器生产有用蛋白、开发有效的植物病毒载体提供参考。[方法]用三叶草黄脉病毒侵染性全长cDNA克隆pCIYVV基因组的NIb／CP基因之间的一段多克隆位点和两侧含有病毒蛋白酶NIa切割识别序列的多聚脱氧核糖核苷酸接头,构建pCIYVV／CP／W载体,并将绿色荧光蛋白基因插入pCIYVV／CP／W中构建pCIYVV／CP／W／GFP载体,用反转录PCR对重组病毒克隆转录情况进行检测,并用Western杂交对重组病毒克隆表达的目的基因产物进行测定。[结果]pCIYVV／CP／W／GFP接种的蚕豆幼苗表现出与野生型CIYVV相同的症状,发病率达100％,表明重组病毒克隆pCIYVV／CP／W／GFP．有侵染性,外源基因的插入没有破坏载体pCIYVV／CP／W的开放阅读框;以感染叶总RNA为模板,对pCIYVV／CP／W／GFP表达GFP外源基因的稳定性进行了检测,从F0（重组病毒质粒最初转录出的病毒）一直检测到Fd子代病毒。检测结果表明,外源基因在L子代病毒基因组中稳定存在;以从感染叶中提取的总蛋白为抗原,以GFP抗体为第1抗体,以碱性磷酸酶标记抗体为第2抗体,用Western杂交对重组病毒克隆pCVYVV／CP／W／GFP表达外源蛋白进行了定性检测。从F0一直检测到F4子代病毒。检测结果表明,重组病毒克隆pCIYVV／CP／W／GFP至少到F4子代病毒能稳定表达GFP。     

用植物病毒载体表达小球状病毒抗原蛋白的研究

将引起人类腹泻主要病原物小球状病毒(Small round structured virus;SRSV)编码抗原蛋白基因的全长序列1605bp,导入来自三叶草黄脉病毒(Clover yellow vein virus;ClYVV)侵染性全长cDNA克隆的侵染性植物病毒表达载体pClYVV/CP/W基因组的NIb/CP基因之间,构建了重组病毒克隆pClYVV-NV1.6。用上述重组病毒克隆接种蚕豆植物,表现了与野生型ClYVV相同的症状。从发病叶中提取总RNA,用反转录PCR(RT-PCR)对上述重组病毒克隆的转录进行了检测,结果表明,外源基因在F4子代病毒基因组中仍然稳定存在。从发病叶中提取总蛋白,用酶联免疫吸附分析(Enzyme-linked immunosorbent assay;ELISA)及蛋白质杂交(Western blotting;WB)对上述重组病毒克隆表达的目的基因产物抗原蛋白进行了测定,结果表明,重组病毒克隆pClYVV-NV1.6之目的基因产物的表达量随寄主植物发病后时间的推移而变化,最大表达是在寄主植物发病后第9天,最大表达量为每克鲜叶可表达160.00μg,这一研究结果为用植物生产抗SRSV口服疫苗提供了有力的基础。     

番木瓜eIF4E家族蛋白的亚细胞定位

真核翻译起始因子eIF4E是多种病毒侵染植物的必须因子。笔者通过扩增番木瓜eIF4E家族基因Cp-eIF4E和Cp-e IFiso4E,分别构建他们与绿色荧光蛋白(GFP)融合的植物表达载体,转化烟草叶片的原生质体后研究了番木瓜eIF4E家族蛋白的亚细胞定位情况。结果表明,Cp-eIF4E和Cp-e IFiso4E在细胞质和细胞核中均有表达。本研究为进一步探讨番木瓜eIF4E家族蛋白与病毒的互作机制以及解析其在病毒侵染中的功能奠定了理论基础。     

新疆加工番茄上南方番茄病毒外壳蛋白基因的克隆与原核表达

【目的】克隆南方番茄病毒(STV)的外壳蛋白(CP)基因,构建其原核表达载体并进行诱导表达,为制备检测该病毒的高效价血清提供参考。【方法】利用一步法RT-PCR从新疆加工番茄上克隆STVCP基因,将其连接到原核表达载体pET-28a(+)上,获得重组质粒pET-28a-STV CP。将重组质粒转化大肠杆菌BL21后用IPTG进行诱导表达。【结果】成功克隆了STVCP基因,其长度为1 134bp。构建了原核重组表达质粒pET-28a-STV CP,其在1mmol/L IPTG诱导下,成功表达出分子质量约47ku的蛋白。【结论】成功克隆了STV CP基因,并诱导了pET-28a-STV CP重组蛋白的原核表达。     

拟南芥乙烯应答基因HLS1的原核表达及多克隆抗体制备

【目的】制备乙烯应答基因HLS1多克隆抗体,在过表达植物中检测HLS1的积累,为深入研究HLS1响应乙烯信号通路的分子机制奠定基础。【方法】构建pET28a-HLS1c原核表达载体,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导获得重组蛋白HLS1c-His;镍柱亲和纯化重组蛋白后免疫家兔获得抗HLS1血清,利用抗原亲和纯化抗血清获得高纯度的HLS1多克隆抗体;用HLS1抗体和GFP抗体,检测原生质体瞬时转化体系中GFP-HLS1c融合蛋白的表达;用农杆菌蘸花法获得过表达GFP-HLS1g的转基因植物,用HLS1抗体和GFP抗体检测GFP-HLS1g融合蛋白的表达。【结果】成功构建了原核表达载体pET28a-HLS1c,并在大肠杆菌系统中诱导获得重组蛋白HLS1c-His,且多以包涵体形式存在。纯化的HLS1c-His多克隆抗体,能清晰检测到约80 ng原核表达的HLS1抗原。纯化的HLS1抗体不仅能检测到原生质体中瞬时表达的GFP-HLS1c融合蛋白,也能检测到过表达转基因植物株系中的GFP-HLS1g融合蛋白,并且与标签蛋白GFP对应抗体所检测到的特异性条带大小一致。【结论】成功制备了拟南芥HLS1蛋白多克隆抗体,为HLS1蛋白在植物发育中的功能研究奠定了基础。     

齿兰环斑病毒外壳蛋白的原核表达、抗体制备及检测应用

齿兰环斑病毒(Odontoglossumringspot virus,ORSV)是感染兰花的主要病毒之一.用RT-PCR方法从感染ORSV兰花中克隆到该病毒的477 bp外壳蛋白基因(CP),外壳蛋白基因再亚克隆到原核表达载体pET-32a中构建重组原核表达载体pET-32a-CP;将重组表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,Ni2+-NTA亲和柱纯化获得分子量约为37 ku含硫氧还蛋白的融合蛋白.以纯化的重组蛋白为抗原免疫新西兰大白兔制备ORSV外壳蛋白的多克隆抗体,并用制备的多抗建立了可靠、灵敏、特异的检测ORSV的免疫捕获RT-PCR及dot-blot ELISA方法,为该兰花病毒病的诊断、兰花抗病育种和脱毒苗的建立打下了基础.     

盐穗木HcGKR基因亚细胞定位表达载体的构建及定位分析

[目的]以GFP基因为报告基因,构建HcGKR基因的亚细胞定位表达载体.[方法]采用PCR方法和基因枪法.[结果]用PCR法,以pGEM- T- HcGKR质粒为模板,获得HcGKR基因的目的片段.然后将其克隆到亚细胞定位表达载体35S:GFP中,获得由CaMV35S启动子调控目的基因的35S - GFP - HcGKR融合表达载体,使目的基因能够和GFP融合同时表达.采用基因枪法将35S - GFP - HcGKR转化到洋葱表皮细胞中,暗培养24 h后,经共聚焦显微镜观察确定发出绿色荧光的位置,对HcGKR基因进行亚细胞定位.[结论]构建的亚细胞定位表达载体可在植物细胞中表达,通过洋葱细胞中绿色荧光的位置确定目的基因定位在细胞膜上,为进一步盐穗木HcGKR基因的功能奠定了理论基础.     

羊口疮病毒F1 L融合Fe蛋白的表达与鉴定

本研究克隆了羊口疮病毒安徽分离株的F1L基因,融合Fe蛋白编码基因后,插入载体pET-32a中,构建了重组质粒pET-F1L-Fe。将pET-F1L-Fe转化BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG诱导表达重组蛋白F1L-Fe。SDS-PAGE分析结果显示,羊口疮病毒F1L-Fe基因在BL21(DE3)获得了正确表达。将大量表达的F1L-Fe蛋白进行纯化,然后免疫BALB/c鼠,制备了抗F1L蛋白的多克隆抗体。最后,以制备的多克隆抗体对F1L-Fe融合蛋白进行Western-blot检测和分析,结果表明F1L-Fe蛋白能与制备的多克隆抗体发生特异性反应,具有良好的反应原性。本研究结果为进一步研发羊口疮病毒亚单位疫苗提供了物质基础。     

论植物配置与植物保护之间的联系

近几年,随着城市化建设的快速发展,各种植物配置在城市化建设中起到了重要作用。但是人类的行为在一定程度上对自然造成了破坏,影响了生态平衡。由于植物配置的不合理、病虫的危害、灭虫手段不当等原因,给当前园林设计中的植物配置提出了新的要求。因此针对这些问题提出了新的解决方法。     

植物化感作用在植保领域的研究进展

植物化感作用在植保领域的研究已经成为一个热点。综述了化感物质的种类、化感研究对象以及化感作用在植保领域的应用。同时,对化感作用研究与应用中存在的一些问题以及未来发展趋势进行了归纳与总结。     

植物抽提物防治植物病毒病的研究

进行了 3种植物 (药菊、紫茉莉和板蓝根 )丙酮抽提物对不同病毒抑制作用的比较试验 ,结果表明 :稀释 5 0倍的紫茉莉根组织抽提物对TMV、CMV和TuMV的抑制效果最好 ,药菊次之 ,板蓝根最差 ;这几种植物抽提物对不同种病毒的抑制效果也有差异 ,紫茉莉根组织抽提物对TMV抑制作用最明显 ,对TuMV次之 ,对CMV稍差。另外 ,紫茉莉根组织的抽提物对病毒系统的抑制作用也较明显。     

植物铁蛋白与植物发育

植物铁蛋白是一类铁贮存蛋白,可以贮藏可溶、无毒和生物体可以利用形式的铁.简要介绍了植物铁蛋白在植物发育方面的作用.     

从植物检疫执法检查结果浅谈加强植物检疫的管理

为了加大植物检疫执法力度 ,增强法律意识 ,落实省“十五”期间植保工作的目标 ,配合省植保站开展“全省农药和植物检疫专项检查工作” ,依法治农 ,依法行政 ,确保农业生产安全 ,适应加入ＷＴＯ后对植物检疫管理的需要。 2 0 0 2年 3月 1 0日至 4月 1 0日 ,由沈阳市植物保护站牵头 ,各区、县 (市 )植物保护站配合 ,对沈阳市所属的苏家屯、于洪、新城子、东陵、新民、辽中、康平、法库八个区、县 (市 )开展了为期一个月的植物检疫执法活动。在各区、县 (市 )植物保护站自查的基础上 ,沈阳市植物保护站与各区、县 (市 )植物保护站联合对 1 60…     

基因沉默与植物抗病毒的可能机制

本文根据目前RNA介导的植物病毒抗性(RMVR)、转录后基因沉默(PTGS)的研究成果,从RMVR与PTGS的关系和机制、植物采用基因沉默产生抗性、病毒抑制基因沉默致病及共同进化等几个方面进行介绍了基因沉默可能是植物抵抗病毒的一种机制,深入研究基因沉默不仅在抗病机制上有重要的理论意义,而且对彻底解决植物病毒问题有较大的潜在实用价值。     

张家口市污水处理厂植物景观设计

以张家口市污水处理厂植物景观设计为例,通过对工厂环境设计理念的分析,介绍了在厂区不同区域采用适宜的植物品种及各具特色的植物配植方式,通过植物造景来营造一个清新、优美、舒适的现代花园式厂区环境.