三个品系蛋鸭β2m基因的克隆及多态性研究

为明确鸭主要组织相容性复合体Ⅰ(major histocompatibility complex,MHCⅠ)β微球蛋白(β2-microglobulin,β2m)分子的多态性和特征,推进相关免疫研究,本试验对我国3个地方品系蛋鸭的多条β2m基因进行克隆,序列经特征分析、同源比对和遗传进化分析后,进行了高变异位点的计算,并将重要变异位点在3D结构上进行了定位。结果表明,鸭β2m基因高度保守,仅个别碱基发生突变,序列中半胱氨酸、免疫球蛋白超基因家族的特征基序"Yx Cx Vx H"和与重链相互作用的位点均保守性存在;筛选的47条β2m氨基酸序列同源性为95%~100%,完全一致序列普遍存在;鸭β2m氨基酸序列与鸡同源性最高,与鱼类和两栖类最低,结果与遗传进化分析相一致;成熟肽中高变异位点和与重链相互作用的变异位点多位于β折叠上,但不会对β2m的功能产生影响。综合来看,鸭β2m基因保守性高,仅存在一种类型,与MHCⅠ重链的作用方式也相对固定。本试验结果有助于深入理解鸭β2m的分子特性,推动MHCⅠ相关免疫研究的开展。     

鲢长江群体与国外移居群体间遗传变异的主要组织相容性复合体分析

利用MHCⅠ类α2结构域基因片段,分析鲢长江群体(YZL)与多瑙河群体(DAN)、密西西比河群体(MIS)间的遗传变异。从3群体共40尾个体的117个有效克隆中,获得MHCⅠ类α2结构域等位基因68个。主要结果为:(1)YZL、DAN和MIS群体的等位基因数分别为21、27和20个,且群体间核苷酸序列(54.1%～99.5%)、氨基酸序列(39.4%～98.6%)的同源性变异范围大,揭示3群体MHCⅠ类α2结构域的多态性都较丰富。(2)群体内平均核苷酸/氨基酸序列同源性的大小顺序为MIS>DAN>YZL;而群体内核苷酸/氨基酸多样性指数(π/πaa)的大小顺序恰与此相反,表明鲢YZL群体MHCⅠ类α2结构域的变异较DAN和MIS群体大。(3)以氨基酸序列进行AMOVA分析的结果表明,3群体间、国内群体与国外移居群体间都存在显著的遗传分化(P<0.05)。(4)3群体抗原结合区(PBR)的非同义碱基/同义碱基替换值ω的大小顺序为YZL(1.652 5)>MIS(1.499 5)>DAN(1.337 0)>1,且在PBR区检测到5个正向选择位点,揭示3群体鲢MHCⅠ类分子均受到正向选择压力的作用,其中YZL群体的选择压力最大。     

牛生长激素基因外显子5序列变异及其分子进化特征

通过双向直接测序法测定中国5个牛种生长激素(GH)基因外显子5序列,并且在分析序列变异的基础上探讨GH基因外显子5序列的分子进化特征.序列分析表明,5个牛种GH基因外显子5的遗传变异水平较低,平均核苷酸变异率约为3.48%,而且绝大多数位点的核苷酸替换是同义突变,仅发现1个错义突变位点;从GH基因外显子5序列单倍型构建的分子进化树来看,水牛与普通牛、瘤牛、牦牛及大额牛的分化相对比较明显,其他4个牛种之间并无明显分化,还享有共同的祖先序列.研究结果也说明牛GH基因外显子5在进化过程中由于功能的约束表现相当保守,进化速率缓慢.     

郏县红牛POU1F1基因第6外显子HinfⅠ、AluⅠ和PstⅠ位点遗传变异及其与生长发育的关系

【目的】研究POU1F1基因第6外显子HinfⅠ、AluⅠ和PstⅠ酶切位点多态性对郏县红牛生长发育性状的遗传效应。【方法】以144头郏县红牛为研究材料,用PCR-RFLP方法检测POU1F1基因第6外显子HinfⅠ、AluⅠ和PstⅠ基因座多态性,并分析其基因型间遗传变异与生长发育的关系。【结果】451bp的POU1F1基因第6外显子片段被HinfⅠ酶切后表现多态;AA、AB和BB基因型频率分别为0.1875,0.3056和0.5069,A和B等位基因频率分别为0.3403和0.6597,处于Hardy-Weinberg不平衡状态;该位点纯合度为0.5510,杂合度为0.4490,有效等位基因数为1.8148,多态信息含量为0.3482,属中度多态,可作为该群体遗传资源评价的建议性指标。而POU1F1基因第6外显子AluⅠ和PstⅠ基因座均未检测到多态性,仅发现AA基因型,表明这些基因座比较保守。HinfⅠ多态性与郏县红牛生长发育性状的相关分析表明,不同基因型与郏县红牛体高、腰角宽、胸围、尻长、十字部高、管围、体质量等指标均无显著相关性(P>0.05);BB基因型个体体长显著高于AB和AA基因型个体(P<0.05),提示B等位基因可能对体长有显著影响。【结论】BB基因型可作为郏县红牛体长性状标记辅助选择的DNA标记。     

甘肃西门塔尔牛临泽类群MSTN基因外显子的多态性

采用PCR-SSCP及测序方法检测50头甘肃西门塔尔牛临泽类群个体MSTN基因3个外显子的遗传多态性及变异特征。结果表明,甘肃西门塔尔牛临泽类群MSTN基因的外显子1存在AA、AB 2种基因型,其基因型频率分别为0.98和0.02;外显子2存在AA、AB、BB 3种基因型,其基因型频率分别为0.4、0.2和0.4;外显子3只有1种基因型,即AA。序列分析表明,外显子1与2各存在1处同义突变;外显子3未检测到突变。统计结果表明,甘肃西门塔尔牛临泽类群MSTN基因外显子1呈低度多态,外显子2呈中度多态,外显子3无多态。     

文昌鸡MHC B-G基因第2外显子序列多态性分析

根据GeneBank上红色原鸡的MHC B-G序列设计特异性引物,利用PCR-SSCP和测序方法对文昌鸡18只个体的MHC B-G基因第2外显子序列332 bp区域进行序列多态性分析.通过PCR-SSCP分型得到16种基因型;测序检测到21个变异位点,其中20个位点导致16个氨基酸位点发生变异.结果表明:所有序列均未发生长度变化;文昌鸡群体内MHC B-G的多态性较丰富,主要体现在氨基酸多态性上,与其抗原多样性有密切关系.     

京海黄鸡MHC B-LR Ⅱ基因序列多态性研究

采用PCR-SSCP方法研究京海黄鸡MHC B-LBⅡ基因的序列多态性,在基因组中扩增包括MHC B-LBⅡ基因外显子2在内长度为305 bp的片段,通过SSCP分型得到16种基因型后,测序发现60个突变位点,并导致32个氨基酸残基发生改变.结果表明:外显子2的多态性更多的表现在氨基酸水平上,作为抗原结合区,其丰富的多态性与抗原多样性相一致.     

米易鸡ADSL基因第2和第9外显子多态性与肌苷酸含量的关联

为了检测米易鸡ADSL基因第2、第9外显子的单核苷酸多态性并分析该多态性与胸肌肌苷酸含量的关联性,以四川省优质地方鸡种米易鸡为研究对象,采用高效液相色谱测定米易鸡胸肌肌肉肌苷酸的含量,并运用测序技术测定了ADSL基因第2、第9外显子的单核苷酸多态性。结果表明:ADSL基因在外显子2(A3713G、C3797T),外显子9(C10191T)处出现3个SNP位点,变异引起相应的氨基酸均为同义变异,第2外显子A3713G位点的基因型为AA、GG、AG型;C3797T位点的基因型为CC、CT、TT型;第9外显子的C10191T位点的基因型为CC、CT型。经独立性检验,ADSL基因A3713G、C10191T位点变异处于Hardy-Weinberg平衡状态;应用最小二乘法对基因型与肌苷酸含量进行分析,说明ADSL第9外显子C10191T SNP位点与IMP含量存在显著相关性(P0.05),CT型个体的胸肌肌苷酸含量高于CC型个体,初步推测米易鸡中ADSL基因第9外显子C10151T SNP位点CT型为优势基因型。     

5个鸭群体遗传关系的微卫星标记分析*

 选用12个微卫星标记对5个鸭群体（金陵黑鸭、樱桃谷鸭、乌嘴鸭、莆田黑鸭和三穗鸭）的进行了了群体内杂合度、多态信息含量和群体间遗传距离进行检测和分析。结果表明，12个微卫星标记只有7个在5个群体中检测到多态性，5个群体的平均杂合度在0.530 8~0.634 7之间，其中金陵黑鸭的平均杂合度最高，乌嘴鸭的最低。基于Nei氏标准遗传距离构建的系统发生树结果表明，樱桃谷鸭独聚为一大类，金陵黑鸭与乌嘴鸭聚集为一类，莆田黑鸭和三穗鸭聚集为一类。上述5个群体7个微卫星座位的检测和分析结果为这些鸭群体的资源利用提供了参考依据。     

5个鸭群体遗传关系的微卫星标记分析

选用12个微卫星标记对5个鸭群体（金陵黑鸭、樱桃谷鸭、乌嘴鸭、莆田黑鸭和三穗鸭）的进行了了群体内杂合度、多态信息含量和群体间遗传距离进行检测和分析。结果表明，12个微卫星标记只有7个在5个群体中检测到多态性，5个群体的平均杂合度在0．5308-0．6347之间，其中金陵黑鸭的平均杂合度最高，乌嘴鸭的最低。基于Nei氏标准遗传距离构建的系统发生树结果表明，樱桃谷鸭独聚为一大类，金陵黑鸭与乌嘴鸭聚集为一类，莆田黑鸭和三穗鸭聚集为一类。上述5个群体7个微卫星座位的检测和分析结果为这些鸭群体的资源利用提供了参考依据。     

中华鲟野生群体及迁地群体的MHCⅠa基因遗传多样性变异研究

利用特异性引物MHCⅠf和MHCⅠr,分别从30尾野生中华鲟(Acipenser sinensis)、30尾中华鲟子一代和30尾中华鲟子二代的基因组DNA中扩增MHCⅠa基因的多肽结合位点(PBR)片段,扩增产物长度为127 bp。中华鲟野生群体30个样品265个有效克隆中共检测出50条特异序列(单倍型),中华鲟子一代群体30个样品的278个有效克隆中共检测出66条特异序列(单倍型),中华鲟子二代群体30个样品的257个克隆中检测出64条特异序列(单倍型)。单倍型Acsi-UAB*0101在3个群体中所占的百分比最高,分别为58.1%、38.8%和60.7%。单倍型分布及群体内遗传多样性参数分析表明,中华鲟子一代群体的MHC基因遗传多样性最丰富,野生中华鲟群体的MHCⅠa基因遗传多样性较低。中华鲟野生群体非同义替代与同义替代比率为1.33,分析表明正向选择可能是中华鲟MHCⅠa多态性的主要因素。该研究结果提供了中华鲟从野生群体到子二代群体MHCⅠa基因的部分遗传信息和遗传变异规律,为中华鲟全人工种群优化和繁殖管理提供理论依据。     

家兔ANGPTL4基因多态性及其与生长性状的关联性分析

【目的】探究家兔血管生成素样蛋白4(angiopoietin-like protein 4,ANGPTL4)基因第6外显子内的多态性及其与家兔部分生长性状的关联性。【方法】采用PCR产物测序法检测家兔ANGPTL4基因外显子内的单核苷酸多态性(SNPs)位点,并应用PCRRFLP酶切分型技术对3个家兔品种(天府黑兔、伊拉兔和新西兰兔)共495个群体样本进行酶切分型,分析SNPs与3个家兔品种部分生长性状的关联性。【结果】ANGPTL4基因第6外显子中共检测发现3个遗传变异位点(c.823 GA为非同义突变,c.867 TC和c.975 TC均为同义突变),且完全处于连锁状态(r2≥0.75),由此选择c.823 GA位点作为遗传效应分析位点。关联性分析得出3个家兔群体内AG基因型和GG基因型与3个品种部分生长性状具有较高的遗传效应。【结论】ANPGTL4基因可以是与家兔生长发育相关的候选基因,以此为培育肉兔新品种提供辅助分子遗传选择依据。     

小麦果聚糖合成酶基因6-SFT-A单核苷酸多态性分析及其定位

 【目的】小麦果聚糖合成酶基因6-SFT是果聚糖合成过程中的关键酶基因,研究6-SFT-A的多态性,分析其与小麦苗期抗旱性的关系,并进行遗传定位。【方法】以苗期抗旱性不同的30份六倍体小麦和4份小麦A基因组供体种乌拉尔图小麦为材料,通过直接测序分析6-SFT-A的单核苷酸多态性（SNP）及其与抗旱性的关系;开发基因分子标记,利用RIL群体（偃展1号×内乡188）对该基因进行遗传定位。【结果】在30份六倍体小麦材料中检测到14个核苷酸多态性位点,包括13个SNP和1个InDel,平均234 bp检测到一个多态性位点,仅在1 727和1 781 bp 2个位点检测到非同义突变;在4份乌拉尔图小麦中检测到28个SNP和4个InDel,其频率明显高于普通小麦。该基因的内含子1、2、3和外显子3为变异富集区,其它区域变异较小,外显子2变异最小,π值为0。34份材料分为3种单倍型,HaplⅠ主要包括中等抗旱材料和水敏感材料,Hapl Ⅲ中主要包括强抗旱材料和中等抗旱材料。利用RIL群体将该基因定位于染色体4A的标记Xcwm-27与Xwpt688之间,遗传距离分别为5.3和7.9 cM。【结论】单倍型分析表明,小麦果聚糖合成酶基因6-SFT-A单倍型与小麦苗期抗旱性有一定的相关性。     

吉林地区马铁菊头蝠MHCⅡDRB基因第２外显子的克隆及序列分析

为了研究翼手目序列中马铁菊头蝠DRB基因第2外显子的遗传多态现象,试验检测了从一个种群得到的17个蝙蝠个体。结果从17个个体中克隆获得42条不同序列,长度为263 bp(仅4例为260 bp)。经序列分析发现,部分个体存有多种序列、不同个体间存有相同序列,提示马铁菊头蝠MHCⅡ DRB基因第2外显子可能存在着重复座位和基因共享。氨基酸的替换趋于集中在假定的抗原结合位点附近。利用MEGA软件构建的NJ树表明,马铁菊头蝠聚为一支,而与其他动物分离。结果表明:马铁菊头蝠MHCⅡ DRB基因第2外显子有较高的多态性,这与其他哺乳动物很相似。     

吉林地区马铁菊头蝠MHCⅡ-DRB基因第2外显子的克隆及序列分析

为了研究翼手目序列中马铁菊头蝠DRB基因第2外显子的遗传多态现象,试验检测了从一个种群得到的17个蝙蝠个体。结果从17个个体中克隆获得42条不同序列,长度为263 bp(仅4例为260 bp)。经序列分析发现,部分个体存有多种序列、不同个体间存有相同序列,提示马铁菊头蝠MHCⅡ-DRB基因第2外显子可能存在着重复座位和基因共享。氨基酸的替换趋于集中在假定的抗原结合位点附近。利用MEGA软件构建的NJ树表明,马铁菊头蝠聚为一支,而与其他动物分离。结果表明:马铁菊头蝠MHCⅡ-DRB基因第2外显子有较高的多态性,这与其他哺乳动物很相似。     

贵州小香羊生长激素基因的PCR-RFLP多态性分析

为给贵州小香羊品种遗传资源的合理开发利用及进一步选育提供科学依据,同时为更全面地了解其种质特性提供基础资料,利用PCR-RFLP技术对67只贵州小香羊生长激素基因外显子1到内含子2序列、外显子3到外显子5序列分别进行Hae Ⅲ和Fok Ⅰ内切酶酶切位点多态性检测.结果表明,所扩增的生长激素基因外显子1到内含子2序列存在Hae Ⅲ酶切位点多态性,并表现为2种基因型AA和AB,基因频率分别为0.73和0.27,等位基因A的频率(0.87)高于等位基因B(0.13);外显子3到外显予5序列中未检测到Fok Ⅰ酶切位点多态性.     

裕丹参不同变异类型ISSR鉴定

采用ISSR分子标记对裕丹参4种变异类型基因组DNA进行PCR扩增,利用SPSS11.5软件进行类型问亲缘关系分析,构建遗传树状图.结果表明,从50务ISSR引物中筛选出8条具有鉴别意义的多态性引物,在裕丹参4种变异类型中共得到65条带,47条为多态性条带,多态性位点72.3%,聚类分析将裕丹参4种类型分为2个类群,表明裕丹参4种变异类型遗传分化明显.ISSR标记可以作为裕丹参4种变异类型鉴定的有效分子标记.     

朝鲜鹌鹑MHC class Ⅰ基因第2、3外显子多态性与NDV抗性的关联分析

【目的】研究朝鲜鹌鹑MHC classⅠ基因第1,2和3外显子的多态性,并与新城疫病毒抗性进行关联分析。【方法】采用胸肌注射的方法对14日龄朝鲜鹌鹑进行新城疫La Sota弱毒株攻毒,每周注射1次,连续攻毒3周后,心脏采血,采用β-微量法测定血清中新城疫抗体水平。PCR扩增朝鲜鹌鹑MHC classⅠ基因,测序后采用DNA Star、SPSS等分析软件研究朝鲜鹌鹑MHC classⅠ基因第1,2,3外显子的多态性,并分析不同基因型新城疫抗体水平的差异。【结果】朝鲜鹌鹑的新城疫抗体效价为26～210。PCR扩增获得了1 290bp的MHC classⅠ基因,其编码区序列为780bp,编码259个氨基酸。通过与已知序列日本鹌鹑RNA(AB005528)比对,得到长度分别为76,272和274bp的第1,2和3外显子。在第1外显子上未检测到突变为点,在第2和3外显子上共检测到11个突变位点(第2外显子上4个突变位点:257bp(A/C)、267bp(A/T)、366bp(A/G)和500bp(T/G);第3外显子上7个突变位点:795bp(T/C)、798bp(T/C)、810bp(T/G)、830bp(A/G)、873bp(A/T)、927bp(A/G)和932bp(C/G)),均为中度多态基因座,11个突变位点中,267bp(A/T)、830bp(A/G)、873bp(A/T)、932bp(C/G)突变导致编码氨基酸改变,500bp(T/G)、873bp(A/T)、932bp(C/G)突变位点基因型之间新城疫抗体水平存在显著差异(P0.05)。【结论】朝鲜鹌鹑MHC classⅠ基因第2、3外显子具有丰富的多态性,并且与新城疫病毒抗性相关。     

瓯江彩鲤酪氨酸酶(TYR)基因的选择压力分析

酪氨酸酶是生物体黑色素合成的关键限速酶,黑色斑纹是瓯江彩鲤(Cyprinus carpio var.color)体色的主要特点之一.以瓯江彩鲤的5种体色选育系F5为材料,探讨酪氨酸酶基因5个外显子及其在不同体色间的变异特性和承受选择压力的敏感性.结果发现:酪氨酸酶基因外显子1和外显子5的核苷酸变异率最高,选择性位点最多,易承受到选择压力;5个外显子的非同义替换率(dN)与同义替换率(ds)的比值(ω值)均小于1 (0.10～0.67),表明它们均受到净化选择压力;不同体色瓯江彩鲤的酪氨酸酶基因也均受到净化选择压力(ω=0.12 ～0.23).应用PAML软件中的M2a和M8两种模型检测显示:无黑斑体色瓯江彩鲤所受正向选择压力位点数高于有黑斑体色,但不存在显著差异(P＞0.05);酪氨酸酶基因中的部分氨基酸位点较易受正向选择压力.研究结果表明:瓯江彩鲤酪氨酸酶基因较保守,主要受净化选择作用,当前的人工选育未对酪氨酸酶基因造成显著的选择压力.     

藏绵羊基因OLA-DQA2第2外显子多态性分析

 【目的】针对藏绵羊腐蹄病所带来的死亡现象,选择与该病相关的基因OLA-DQA2为研究对象,分析群体中该基因的遗传多态性及变异特征,为进一步寻求抗病分子育种提供依据。【方法】采用PCR-SSCP检测216只表型正常和患病藏绵羊OLA-DQA2基因第2外显子的多态性,克隆、测序群体内变异产生的各等位基因序列,构建系统发育树以明确藏绵羊OLA-DQA2基因等位基因之间的遗传关系。【结果】藏绵羊DQA2基因第2外显子中表现了15个基因型。发现藏绵羊群体中OLA-DQA2基因第2外显子有8个新等位基因,分别命名为OLA-DQA2*H、*I、*J、*K、*L、*M、*N和*O,使绵羊基因库中该座位的等位基因数量从23个增加到31个。序列分析中发现71个核苷酸多态位点,这些多态位点主要由点突变形成,其中转换39个(占54.9%),颠换23个(占32.4%)。【结论】藏绵羊DQA2基因第2外显子具有丰富的遗传多态性,群体中可能蕴藏着更多的抗性遗传资源。