海水青鳉雌激素受体基因的克隆、组织表达特性及环境雌激素EE2对其表达的影响

为了获得海水青鳉Oryzias melastigma雌激素受体的基因信息及其表达特性,采用RACE-PCR技术和实时荧光定量PCR方法,进行了雌激素受体基因的克隆、表达特性分析及其在17α-炔雌醇(EE2)暴露下的基因响应研究。结果表明:海水青鳉雌激素受体基因与其他脊椎动物雌激素受体基因同源性较高,特别是DNA结合结构域(DBD)在进化上高度保守,配体结合结构域(LBD)次之;OM-ERα/β1/β2在所检测的10种组织中均有表达,其中在青鳉肝脏、性腺、脾脏和肠中表达量较高;OM-ERα在肝脏中的表达和OM-ERβ1/β2在性腺中的表达,雌雄间存在显著性差异(P0.05);在EE2浓度为5、50、500ng/L的水体中暴露96 h后,海水青鳉仔鱼中的分子标志物卵黄蛋白原基因(vtg1)被显著诱导(P0.05),且呈浓度依赖关系;中浓度(50 ng/L)的EE2诱导仔鱼OM-ERβ1基因表达,OM-ERβ2对EE2暴露呈现低浓度诱导、高浓度抑制的趋势;攻毒试验结果表明,OM-ERα和vtg1之间存在一种正相关关系,暗示EE2可能主要通过ERα调控vtg1基因的表达;EE2攻毒下,β亚型存在一种倒U型的剂量-反应关系。研究表明:克隆获得的海水青鳉3个雌激素受体亚型基因OM-ERα/β1/β2,为后续开展海水模式鱼类雌激素受体相关研究提供了基础信息;OM-ERα/β1/β2的组织表达特性及EE2对仔鱼OM-ERα/β1/β2表达的不同调控,显示出海水青鳉3种ER亚型基因存在着不同的生理功能,且其对环境污染物的应答模式不同。     

雌激素对双齿围沙蚕性比、生长和卵母细胞发育的影响

将性未分化的双齿围沙蚕Perinereis aibuhitensis暴露在双酚A和17β-雌二醇两种雌激素下,研究了雌激素对双齿围沙蚕雌雄比例、个体生长、死亡率及卵母细胞发育的影响。结果表明,两种雌激素各浓度下的试验组沙蚕均为雌性。与对照组相比,双酚A浓度为50、100μg/L时,对沙蚕有极显著的促生长作用（P〈0.01）;浓度为10、150μg/L时,对沙蚕的促生长作用显著（P〈0.05）;浓度为200μg/L时,对沙蚕的促生长作用不明显;沙蚕的死亡率随双酚A浓度的提高而增加。与对照组相比,当17-β雌二醇浓度为1、5、15 mg/L时,对沙蚕有极显著的促生长作用（P〈0.01）;浓度为30 mg/L时,对沙蚕的促生长作用显著（P〈0.05）;浓度为45 mg/L时,对沙蚕的促生长作用不明显;随着浓度的提高,沙蚕的死亡率明显加大。双酚A浓度为10~150μg/L、17β-雌二醇浓度为1~30 mg/L时,对沙蚕卵母细胞的生长有明显的促进作用（P〈0.01）;而双酚A浓度为200μg/L（P〈0.05）和17β-雌二醇浓度为45 mg/L（P〈0.01）时对卵母细胞的生长有抑制作用。     

稀有鮈鲫芳香化酶基因的表达及内分泌干扰物（EDCs）暴露对其表达的影响

克隆稀有鮈鲫芳香化酶基因(cyp19a和cyp19b)片段,半定量方法检测其组织表达特异性,实时定量PCR检测2基因在孵化后18~50 d幼鱼的发育阶段表达情况,对成鱼进行3 d的乙炔基雌二醇(EE2,1 nmol/L)和壬基酚(NP,1μmol/L)药物暴露试验,实时定量PCR检测它们对2个基因表达的影响。结果显示,克隆获得759 bp的cyp19a和407 bp的cyp19b片段,cyp19a主要在卵巢中表达,cyp19b主要在脑中表达。在幼鱼发育阶段,cyp19a的表达没有显著差异,cyp19b在38 d后出现明显的下降;成体稀有鮈鲫cyp19a受到EE2极显著抑制(0.23倍,P<0.01),但NP抑制效果不显著(0.59倍),cyp19b在EE2和NP暴露后都有上调的趋势(1.83、1.02倍)。说明cyp19基因可以作为EDCs的作用靶分子,有助于对高等脊椎动物包括人类进行预测和风险评估。     

盐度对青鳉鱼肠内Na+-K+-ATPase基因表达的影响

用实时定量RT-PCR(Q-RT-PCR)检测不同盐度对青鳉鱼肠内Na -K -ATPaseα和Na -K -ATPaseβ基因表达的影响。结果表明,青鳉鱼肠内Na -K -ATPaseα基因表达量在5 g/L1、5 g/L和25 g/L的盐水中不变,Na -K -ATPaseβ基因表达在15 g/L2、5 g/L的盐水中被显著抑制(P<0.05)。盐度升高抑制青鳉鱼肠内Na -K -ATPaseβ基因表达。     

高效氯氰菊酯对草鱼鳃和脾脏溶菌酶活性的影响

研究了暴露在高效氯氰菊酯中的草鱼(Ctenopharyngodon idella)鳃和脾脏溶菌酶(LSZ)的活性变化。高效氯氰菊酯设5个剂量组,分别为0μg/L、0.5μg/L、1.0μg/L、3.0μg/L和5.0μg/L组,每组分别于1d、5d和12d取样,测定鳃和脾脏LSZ活性。结果显示,在暴露1d、5d时,鳃LSZ活性表现为:0.5μg/L组(82.701、117.334U/g)和1.0μg/L组(103.703、128.167U/g)组显著或极显著上升(P<0.05,P<0.01),3.0μg/L组(40.045、31.357U/g)和5.0μg/L组(23.421、15.433U/g)显著或极显著下降(P<0.05,P<0.01);暴露12d时,鳃LSZ活性表现为:0.5μg/L组(38.489U/g)、1.0μg/L组(30.247U/g)、3.0μg/L组(20.694U/g)和5.0μg/L组(9.668U/g)酶活均极显著下降(P<0.01)。暴露1d时,脾脏LSZ活性表现为:0.5μg/L(68.232U/g)、1.0μg/L(90.884U/g)、3.0μg/L(116.219U/g)和5.0μg/L(60.636U/g)组均极显著上升(P<0.01);暴露5d,脾脏LSZ活性表现为:0.5μg/L(86.718U/g)、1.0μg/L(108.394U/g)和3.0μg/L(98.194U/g)组极显著上升(P<0.01),5.0μg/L(21.395U/g)组极显著下降(P<0.01);暴露12d,0.5μg/L(100.422U/g)、1.0μg/L(80.605U/g)组极显著上升(P<0.01),3.0μg/L(30.853U/g)和5.0μg/L(12.046U/g)显著或极显著下降(P<0.05,P<0.01)。表明高效氯氰菊酯对草鱼鳃和脾脏具有明显的毒害作用。     

钒对日本青鳉胚胎发育及仔鱼的毒性影响

为揭示钒对日本青鳉的生态毒理学效应,以日本青鳉受精卵和仔鱼为研究对象,进行了钒对日本青鳉胚胎的毒性和仔鱼的急性毒性试验。结果表明:随着钒浓度的升高,胚胎孵化率呈先升高后降低的趋势,当钒浓度大于10.13mg/L时,日本青鳉胚胎孵化率降低,胚胎畸形率增加;各钒暴露液均对日本青鳉胚胎孵化周期有较明显的迟滞效应。钒对日本青鳉仔鱼的72h、96h半致死浓度分别为0.85mg/L、0.43mg/L,安全浓度为0.0427mg/L。结论:钒对日本青鳉胚胎有一定的致畸和致死作用,对仔鱼有高毒性作用。     

高效氯氰菊酯对草鱼血清和脾脏中碱性磷酸酶活性的影响

为研究高效氯氰菊酯对草鱼生理代谢的影响,将供试草鱼随机分为5组,分别暴露在质量浓度为0、0.5、1.0、3.0、5.0μg/L的高效氯氰菊酯中,于1、5、12 d时取样,测定血清和脾脏中碱性磷酸酶(AKP)活性。结果显示,与对照组相比,暴露1、5 d时,0.5μg/L高效氯氰菊酯组血清和脾脏AKP活性无显著变化;暴露12 d时,血清AKP活性极显著上升,脾脏AKP活性无显著变化。暴露1 d时,1.0μg/L高效氯氰菊酯组血清AKP活性无显著变化,脾脏AKP活性极显著下降;暴露5 d时,血清AKP活性极显著升高,脾脏AKP活性显著极下降;暴露12 d,血清AKP活性无显著变化,脾脏AKP活性显著极下降。暴露1、5、12 d时,3.0μg/L、5.0μg/L高效氯氰菊酯组血清、脾脏中AKP活性均显著或极显著下降。综上,高效氯氰菊酯对草鱼血清和脾脏具有明显的毒害作用。     

灭多威对日本青鳉和大型溞乙酰胆碱酯酶的效应研究

[目的]研究不同浓度的灭多威对大型溞和日本青鳉乙酰胆碱酯酶(AChE)活性的影响。[方法]通过测定灭多威对大型溞和日本青鳉的24 h LC50评价其毒性大小,并采用Ellman方法检测灭多威对生物体AChE活性的影响。[结果]灭多威对大型溞幼溞和日本青鳉的24 h LC50分别为9.83和185μg/L。随着灭多威暴露浓度的增加,对大型溞幼溞和日本青鳉AChE活性的抑制作用增强。在体内试验中,在灭多威连续暴露下乙酰胆碱酯酶的相对酶活总体呈下降趋势。在体外试验中,在一定的时间范围内灭多威对AChE活性的抑制率与暴露时间呈一定的线性关系,且随着暴露时间的延长而增大。[结论]体内和体外试验的结果表现出明显的差异性,因此在研究污染物对生物体酶活的影响时,应分别进行体内和体外试验。     

EGF和β-巯基乙醇对羔羊卵母细胞体外受精和体外发育的影响

[目的]为优化幼畜卵母细胞体外培养体系提供理论基础。[方法]研究在成熟液中添加EGF和β-巯基乙醇对绵羔羊卵母细胞受精和卵裂、囊胚情况的影响,并与成年绵羊卵母细胞进行比较。[结果]在成熟液中添加不同浓度的EGF对羔羊卵母细胞卵裂率和囊胚率无显著影响(P0.05)。添加不同浓度的β-巯基乙醇可以提高羔羊卵母细胞囊胚率,其中添加100μmol/Lβ-巯基乙醇有显著影响(P0.05),但对卵裂率影响不显著(P0.05)。羔羊卵母细胞卵裂率和囊胚率均显著低于成年羊(P0.05)。添加100μmol/L的β-巯基乙醇能显著提高羔羊卵母细胞正常受精率(P0.05),且与成年羊卵母细胞受精率差异不显著(P0.05)。未添加β-巯基乙醇多精入卵率显著高于成年羊(P0.05),而添加100μmol/L的β-巯基乙醇多精入卵率与成年羊差异不显著(P0.05)。成熟液中不添加β-巯基乙醇时未受精率(20.0%)高于成年羊组(12.3%)和β-巯基乙醇(13.5%),但差异不显著(P0.05)。[结论]添加100μmol/L的β-巯基乙醇能显著提高羔羊卵母细胞发育能力,提高正常受精的比例并减少多精子受精的发生,但羔羊卵母细胞发育能力仍显著低于成年羊。     

激素浓度对羔羊和成年母羊卵母细胞体外成熟培养的影响

以江苏省本地白山羊羔羊为主要研究对象,经羔羊屠宰场取卵后进行体外成熟培养,在成熟培养液里添加不同浓度的促卵泡激素(FSH)和促黄体生成素(LH),探讨FSH和LH对卵母细胞成熟率的影响。并对比羔羊与母羊的后期胚胎发育能力,以探究卵母细胞成熟的调控机制。在成熟液里添加浓度为2.5、5.0、7.5、10.0、12.5μg/m L的FSH+LH,成熟培养后,其结果显示成熟液中添加不同浓度FSH和LH对卵母细胞成熟率有显著影响。其中成熟液中添加5.0μg/m L FSH和LH浓度的羔羊卵母细胞成熟率明显高于其他4组;成熟液中添加10.0μg/m L FSH和LH浓度的成年母羊卵母细胞成熟率明显高于其他4组;且羔羊和成年母羊卵母细胞在相同浓度成熟液中培养的效果无明显差异(P0.05)。     

雷帕霉素对稀有鮈鲫卵子发生的影响

【目的】为鱼类生殖生理学和繁殖生物学研究提供参考。【方法】以稀有鮈鲫为试验动物,采用mTOR通路抑制剂雷帕霉素处理3月龄雌性个体至4月龄,正常饲养至5月龄,以同时注射等量不含雷帕霉素的稀释剂和二甲基亚砜(DMSO)为对照,测定不同阶段性腺指数(GSI)和卵巢发育情况,Real-time PCR检测卵子发生相关基因的表达情况。【结果】3、4、5月龄对照组和3月龄处理组卵巢具有Ⅳ时相卵母细胞,4月龄处理组只具有Ⅰ、Ⅱ时相卵母细胞,5月龄处理组卵巢中观察到Ⅲ时相卵母细胞;处理组GSI显著低于对照组;处理组中foxl2、fshr、cyp11a1、cyp19a1a和bmp15表达显著低于对照组,figlα在处理组中表达显著高于对照组。【结论】雷帕霉素处理导致稀有鮈鲫卵母细胞发育停滞在Ⅱ时相,推测mTOR通路可能通过调节类固醇发生和TGFβ信号通路促进卵母细胞的发育和成熟。     

甲基睾酮对雌斑马鱼内分泌干扰效应的研究

甲基睾酮(MT)广泛存在于造纸废水中,为了研究其对水生动物内分泌的干扰效应,选用斑马鱼为模式生物,开展甲基睾酮对斑马鱼的慢性毒性暴露实验。将雌性斑马鱼分别暴露在含10、50、100和150μg/L的甲基睾酮水环境中48 d,另设空白对照和0.01%甲醇对照,观察斑马鱼的个体生长指标及组织结构的变化。结果表明:当MT浓度为150μg/L时,斑马鱼全部死亡;而在0~100μg/L的MT暴露处理中,随着MT浓度的增加,斑马鱼的体重逐渐减轻,体长逐渐缩短,臀鳍逐渐变大,体色转向偏黄,出现了雄性化的特征;而且肝脏和性腺重量均明显减轻,卵巢出现明显的退化特征,肝细胞逐渐肿大,细胞核偏移中央,且伴随细胞中空等现象;其中,50和100μg/L MT处理的斑马鱼鳃丝变得高低不一,有的开始断裂甚至结构无法辨认。     

高效氯氰菊酯暴露下草鱼器官碱性磷酸酶活性的变化

研究了暴露在不同浓度高效氯氰菊酯下草鱼(Ctenopharyngodon idellas)鳃、肝胰脏和肾脏组织中碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,AKP)的活性变化。试验中高效氯氰菊酯浓度设5组(0、0.5、1.0、3.0和5.0μg/L),每组分别于1、5和12 d时取样,测定鳃、肝胰脏和肾脏组织中AKP的活性。结果表明,0.5μg/L高效氯氰菊酯暴露1 d时,鳃中AKP活性显著下降(P0.05),肝胰脏和肾脏中的AKP活性无显著变化(P0.05);暴露5 d时,鳃和肾脏中AKP活性显著或极显著降低(P0.05,P0.01),肝胰脏中AKP活性无显著变化(P0.05);暴露12 d时,鳃和肾脏中AKP活性极显著下降(P0.01),肝胰脏中AKP活性无显著变化(P0.05)。1.0μg/L高效氯氰菊酯暴露1 d,肝胰脏和肾脏中AKP活性无显著变化(P0.05),鳃中AKP活性显著或极显著下降(P0.05,P0.01);暴露5 d时,肾脏中AKP活性显著或极显著下降(P0.05,P0.01),肝胰脏中AKP活性无显著变化(P0.05);暴露12 d,鳃、肝胰脏和肾脏中AKP活性显著下降(P0.01)。3.0μg/L和5.0μg/L高效氯氰菊酯显露1、5和12 d,所测定组织中AKP活性均显著或极显著下降(P0.05,P0.01)。     

促性腺激素对猪卵母细胞体外成熟的影响

在成熟液中同时添加不同浓度(0.25～2.0μg/mL)FSH和不同浓度(0.25～2.0μg/mL)LH,探讨这2种促性腺激素结合使用对猪卵母细胞体外成熟的影响。结果显示,当FSH的添加浓度为0.25～2.0μg/mL及LH的添加浓度为0.25～2.0μg/mL时,猪卵母细胞的核成熟率极显著高于没有添加FSH和LH的对照组(P<0.01),而FSH和LH不同浓度组合之间对猪卵母细胞核成熟影响差异不显著(P>0.05)。结果表明,成熟液中同时添加0.25μg/mLFSH和0.25μg/mLLH便能极显著地促进猪卵母细胞的核成熟率,国产FSH和LH用于猪卵母细胞体外成熟研究是可行的。     

3种杀菌剂对日本青鳉的急性毒性研究

[目的]探讨多菌灵及三唑类杀菌剂对水生生物的毒性.[方法]以不同鱼龄的日本青鳉(Oryzias latipes)为研究对象,采用半静态暴露法,测定了多菌灵、三唑醇、三唑酮3种杀菌剂对日本青鳉的急性毒性.[结果]多茵灵、三唑醇、三唑酮3种杀菌剂对日本青鳉成鱼、幼鱼、仔鱼的LC50(96 h)值分别为:0.749 8、0.4646、0.0512 mg/L;20.5415、14.4866、1.4735 mg/L;12.4707、11.0202、0.3536mg/L.单一杀菌剂对日本青鳉不同鱼龄毒性高低依次为:仔鱼＞幼鱼＞成鱼;3种杀菌剂之间毒性高低依次为:多菌灵＞三唑酮＞三唑醇.[结论]为相关部门制定3种杀菌剂的使用标准提供了理论依据.     

促性腺激素对猪卵母细胞体外成熟的影响

在成熟液中同时添加不同浓度(0.25～2.0μg/mL)FSH和不同浓度(0.25～2.0μg/mL)LH,探讨这2种促性腺激素结合使用对猪卵母细胞体外成熟的影响.结果显示,当FSH的添加浓度为0.25～2.0μg/mL及LH的添加浓度为0.25～2.0μg/mL时,猪卵母细胞的核成熟率极显著高于没有添加FSH和LH的对照组(P＜0.01),而FSH和LH不同浓度组合之间对猪卵母细胞核成熟影响差异不显著(P＞0.05).结果表明,成熟液中同时添加0.25μg/mL FSH和0.25μg/mL LH便能极显著地促进猪卵母细胞的核成熟率,国产FSH和LH用于猪卵母细胞体外成熟研究是可行的.     

高效氯氰菊酯对草鱼血清和脾脏酸性磷酸酶活性的影响

研究了暴露在不同浓度高效氯氰菊酯下草鱼(Ctenopharyngodon idellas)血清和脾脏中酸性磷酸酶(ACP)的活性变化.将高效氯氰菊酯浓度设5组,包括1个对照组(0μg/L)和4个处理组(0.5、1.0、3.0、5.0μg/L),每组分别于暴露1、5、12d时取样,测定血清和脾脏ACP的活性.结果显示,暴露1d时,血清ACP活性各处理组显著下降;脾脏ACP活性0.5μg/L组和1.0μg/L组显著升高,3.0μg/L组和5.0μg/L组显著下降.暴露5d时,血清ACP活性1.0μg/L组显著上升,3.0μg/L组和5.0μg/L组显著下降;脾脏ACP活性1.0、3.0和5.0μg/L组显著下降.暴露12d时,血清ACP活性1.0、3.0和5.0μg/L组显著下降;脾脏ACP活性各处理组均显著下降.ACP活性的变化反映了高效氯氰菊酯能够影响鱼体的代谢平衡,对鱼体具有毒害作用;同时,血清和脾脏的ACP活性对高效氯氰菊酯早期污染的敏感性可以作为监测水体中此类化学品污染的一个特异性标志物.     

泥鳅cyp19a1基因克隆及其在倍性间的表达差异

克隆并分析泥鳅cyp19a1a的全长cDNA和5′侧翼序列,用qRT-PCR技术比较cyp19a1a在二倍体、四倍体泥鳅组织间和倍性间的表达差异。结果发现,泥鳅cyp19a1a的cDNA全长1 905 bp,包括29 bp的5′TR、301 bp的3′UTR和1 575 bp的ORF序列,其氨基酸序列中存在I-螺旋区、芳香化酶特异保守区以及血红素结合区等重要功能域。用hiTAIL-PCR克隆获得2 040 bp的5′侧翼序列,在该序列上预测到典型元件TATA-box,以及C/EBPβ、SRY、ER、CREB、GR等转录因子结合位点。12月龄四倍体泥鳅的体长、体质量均显著高于二倍体,但性腺发育明显滞后于二倍体。cyp19a1a和cyp19a1b分别在二倍体、四倍体泥鳅的性腺和脑中的表达量最高。倍性间比较结果显示,cyp19a1a在四倍体各组织中的表达均高于二倍体(除精巢外);cyp19a1b在四倍体雌鳅脑中的表达量显著高于二倍体,但在四倍体雄鳅脑中的表达量显著低于二倍体。综合分析上述结果,四倍体中相对较高的cyp19a1a表达可能与其性腺所处发育时期有关,较晚的性成熟有利于泥鳅将更多能量用于个体生长。由于cyp19a1及其催化产生的雌激素还可以通过GH-IGF通路调节鱼类的生长,推测cyp19a1在泥鳅倍性间的差异表达可能与二倍体、四倍体间的生长生殖差异密切相关。     

植物雌激素槲皮素对非洲爪蟾生长和骨骼发育的影响

用两栖动物非洲爪蟾作模型动物,来揭示植物雌激素槲皮素对非洲爪蟾生长和骨骼发育的影响。非洲爪蟾从46/47期开始,分别暴露50μg/L,100μg/L,200μg/L槲皮素,直至变态后1个月。结果表明槲皮素处理一方面促进蝌蚪体重的增加,另一方面导致尾的畸形。200μg/L槲皮素还导致脊柱的畸形,表现为少一块脊椎骨。