摘除眼柄与注射眼柄粗提物对凡纳滨对虾性腺发育相关基因表达的影响

利用荧光定量PCR技术,检测了眼柄粗提物对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)性腺发育相关基因(DMC1、VASA和VTG)表达的影响,探讨性腺抑制激素(GIH)在性腺发育过程中的调控机制,结果表明:DMC1和VASA只在凡纳滨对虾精巢和卵巢中表达;摘除眼柄后,精巢和卵巢中DMC1表达量均显著性降低(P0.05),而注射眼柄粗提物后精巢和卵巢中DMC1表达显著增高(P0.05);相反,摘除眼柄后,精巢和卵巢中VASA以及卵巢中VTG基因表达量显著增高,但注射眼柄粗提物后性腺中的VASA和卵巢中的VTG表达量显著降低。结果表明眼柄粗提物通过影响生殖相关基因的表达影响凡纳滨对虾的性腺发育。     

三角帆蚌17β-HSD11基因的表达特征及17β-雌二醇对其表达的影响

通过RACE技术、实时荧光定量(qRT-PCR)技术、原位杂交和17β-雌二醇注射来探究17β-HSD11基因在三角帆蚌性腺发育和性激素合成中的表达特性和作用。结果显示:17β-HSD11基因的cDNA全长为1 134 bp, 其中,5'' UTR 40 bp,开放阅读框(ORF)923 bp,3'' UTR 171 bp,编码307个氨基酸。17β-HSD11基因在肝胰腺、性腺中表达量较高,且卵巢极显著高于精巢。原位杂交结果显示雌性三角帆蚌卵母细胞、滤泡膜和卵膜上均存在杂交信号。注射不同质量浓度17β-雌二醇之后发现17β-HSD11基因在雌雄性腺中的相对表达量均被抑制,其中:低质量浓度注射后,17β-HSD11基因的表达量在卵巢中下降33.38%,在精巢中下降37.74%;而高质量浓度注射后,17β-HSD11基因的表达量在卵巢中下降57.78%,在精巢中下降61.31%。由此推测17β-HSD11可能与三角帆蚌性腺发育和雌激素合成相关。     

褪黑素对内蒙古绒山羊皮肤上皮细胞增殖及wnt10b和β-catenin基因表达的影响

为研究褪黑素对内蒙古绒山羊皮肤上皮细胞生长的作用模式,将褪黑素浓度设置为0、100、300、600和900pg/mL 5个试验组,利用CCK-8法检测各组皮肤上皮细胞增殖情况,实时荧光定量PCR检测Wnt10b和β-catenin基因的表达,ELISA检测Wnt10b及β-catenin蛋白的表达。结果表明:300pg/mL褪黑素对皮肤上皮细胞增殖效果最佳(P0.05),Wnt10b和β-catenin的mRNA和蛋白质表达量极显著高于其他组(P0.01)。综上,300pg/mL的褪黑素可显著促进皮肤上皮细胞增殖,且显著提高Wnt10b和β-catenin的表达。     

克氏原螯虾泛素结合酶E2r基因的克隆及表达分析

为了解泛素结合酶E2r基因在克氏原螯虾性腺发育中的作用,利用RACE技术得到了c DNA全序列,命名为Pc-UBE2r。该基因序列全长为3 671 bp,包含泛素结合酶的特有结构域,以及半胱氨酸残基活化位点。开放阅读框为729 bp,编码242个氨基酸,预测蛋白分子量约为27.6 ku。BLAST比对发现,克氏原螯虾UBE2r基因与节肢动物UBE2r基因具有较高的同源性。系统进化分析表明,Pc-UBE2r基因与日本囊对虾聚为一枝。qRT-PCR研究表明,Pc-UBE2r基因在性腺中的表达量显著高于其他组织(P0.05)。在卵巢中,PcUBE2r基因的表达量在未发育期最低,在卵黄发生前期表达量快速增长,随后表达量逐渐降低。在精巢中,Pc-UBE2r基因的表达量在精母细胞发生期达到最高水平。组织原位杂交结果显示,Pc-UBE2r基因在卵巢中均匀分布在未发育期的卵母细胞细胞质中,随后逐渐迁移到卵母细胞细胞核以及滤泡细胞周围。在精巢中,Pc-UBE2r基因主要分布在精母细胞的周围。组织总蛋白Western blot检测发现,UBE2r蛋白在精巢和卵巢中的表达量也显著高于其他组织(P0.05)。综上所述,我们推测Pc-UBE2r基因在克氏原螯虾配子发生和性腺发育方面发挥了重要作用,本研究将为虾蟹类性腺发育调控的分子机制奠定基础和提供依据。     

克氏原螯虾泛素结合酶E2基因的克隆及其在卵巢中的表达分析

利用RACE技术获得了UB-E2基因c DNA全长,通过RT-PCR技术研究UB-E2基因在不同组织、发育时期的表达量和17α-羟孕酮激素刺激后UB-E2表达量及性腺发育情况。结果表明:该基因序列全长3 943bp,开放阅读框675 bp,编码224个氨基酸,相对分子量23. 93 ku,等电点8. 61,82～219位氨基酸序列为泛素结合酶家族特有的结构域。氨基酸序列比对发现,克氏原螯虾UB-E2基因与节肢动物UB-E2基因有较高的同源性;系统进化分析表明,UB-E2基因与凡纳滨对虾和斑节对虾聚为一支。荧光定量结果显示,UB-E2基因在克氏原螯虾卵巢组织中的表达量显著高于其他组织(P 0. 05);在卵巢发育初期表达量最低,随后逐渐升高,到产卵后期开始下降; 17α-羟孕酮刺激结果显示,试验组卵巢发育速度明显加快,同时UB-E2基因的表达量也显著上升,卵巢发育速度和UB-E2基因表现为受17α-羟孕酮刺激响应一致。推测UB-E2基因在克氏原螯虾的卵巢发育和配子发生中起着重要的作用,本研究为克氏原螯虾性腺发育分子调控机制提供一定的理论依据。     

罗氏沼虾Doublesex基因的cDNA克隆及性别二态性表达分析

克隆了罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)含DM结构域的Dsx基因(MroDsx)部分序列,DM结构域包含5个保守的半胱氨酸(Cysteine)和2个组氨酸(Histidine), 且与中国对虾(Fenneropenaeus chinensis) Dsx基因DM结构域具有73%的相似性。荧光定量PCR(Quantitative real time PCR,qPCR)结果显示:MroDsx基因仅在性腺中特异性表达,且在精巢中的表达量显著高于卵巢;在精巢发育早期(主要是精原细胞)高表达,随着精巢的发育MroDsx基因的表达量逐渐降低。原位杂交(In situ hybridization,ISH)结果进一步显示:MroDsx转录本在精原细胞表达量高,在精母细胞以及精细胞中较弱,在成熟的精子中不表达,与荧光定量的结果一致。基于对MroDsx转录本的表达分析,推测MroDsx可能参与罗氏沼虾精巢的发育过程。     

红鳍东方鲀gsdf基因的克隆及表达模式分析

为研究红鳍东方鲀Takifugu rubripes的性别决定因子(gonadal soma derived factor,GSDF),利用c DNA末端快速扩增技术(RACE)首次克隆了红鳍东方鲀gsdf基因(Trgsdf)的c DNA全长序列(Gen Bank登陆号:KR914667)。结果表明:Trgsdf c DNA序列全长为1734 bp,其中5'端非编码区144 bp,开放阅读框648 bp,3'端非编码区942 bp,共编码215个氨基酸;预测的氨基酸序列中存在1个长度为19个氨基酸的信号肽和相同长度的跨膜区,1个N-糖基化位点NST,1个TGF-β家族成员特有的保守结构域;BLAST同源性分析结果显示,红鳍东方鲀GSDF氨基酸序列与其他鱼类的相似性为26%~58%;系统发育分析结果显示,鱼类GSDF单独聚为一支,与TGF-β超家族内的其他成员分开,红鳍东方鲀与青鳉Oryzias latipes GSDF的亲缘关系最近,先聚为一支,后与三斑海猪鱼Halichoeres trimaculatus聚在一起,与矛尾鱼Latimeria menadoensis的GSDF亲缘关系最远;应用RT-PCR技术检测Trgsdf mRNA在雌性和雄性红鳍东方鲀成鱼不同组织中的表达,结果显示,Trgsdf mRNA在卵巢和精巢中高表达,在皮肤和肌肉组织中微量表达,在其他组织中无表达;采用相对实时荧光定量PCR方法比较了成鱼卵巢和精巢中Trgsdf mRNA的表达量,结果显示,Trgsdf mRNA在精巢中的表达量显著高于卵巢(P0.05),约为卵巢表达量的6倍。研究表明,gsdf基因可能在红鳍东方鲀的性腺尤其是精巢的分化和发育过程中起着重要的作用。     

中药复方多糖对不同MHC B-LβⅡ基因型鸡淋巴细胞TLR 4介导的TRIF依赖性途径的影响

探讨中药复方多糖在不同MHC B-LβⅡ基因型鸡淋巴细胞中对TLR4信号转导通路下游TRIF依赖性途径主要元件的影响。采用PCR-SSCP方法将500羽京红1号蛋鸡按不同MHC B-LβⅡ基因型分组,采集不同MHC B-LβⅡ基因型鸡的外周血淋巴细胞,分别加入终质量浓度为100、75、50、0μg/mL(高、中、低、对照组)中药复方多糖共培养16、24、32、48h,收集细胞,采用Real-time PCR方法检测TRIF、IRF3、IFN-β基因mRNA的表达。结果显示:(1)与对照组相比,中药复方多糖能显著增强不同MHC B-LβⅡ基因型鸡TRIF、IRF3、IFN-βmRNA的表达量(P0.05)。(2)中、低剂量中药复方多糖组AA基因型鸡TRIF、IRF3基因mRNA的表达量各个时间段均高于高剂量组,IFN-β在24、32、48h高于高剂量组,高剂量中药复方多糖组BB基因型TRIF、IRF3基因的表达量各个时间段高于其他剂量组,IFN-β在24、32、48h高于其他剂量组,低剂量中药复方多糖组中BC基因型TRIF、IRF3基因的表达量各个时间段高于其他剂量组,IFN-β在24、32、48h高于其他剂量组。表明中药复方多糖可能与淋巴细胞表面TLR4结合,可以通过下游TRIF依赖性信号转导通路,调控细胞免疫,并且对促进其信号通路主要元件mRNA的表达的最适cCHMPS剂量有一定的影响。     

斑马鱼CYP11a1基因在不同性腺发育时期的表达

采用实时荧光定量PCR技术,分析了斑马鱼Danio rerio的CYP11a1基因在成鱼4个组织和性腺发育3个时期的表达情况。结果表明:CYP11a1基因在卵巢、精巢、肌肉和脑组织中均有表达且存在差异,在脑中表达量最低(P0.05),在卵巢、精巢、肌肉中的表达量分别为脑中表达量的204.7倍、38.9倍、17.0倍;CYP11a1基因在3个卵巢发育时期的表达量表现为先降低后升高的趋势,其在卵巢成熟期的表达量最低(P0.05),在卵巢成熟前期、卵巢成熟后期的表达量分别为卵巢成熟期表达量的1.7倍、1.5倍;CYP11a1基因在3个精巢发育时期的表达量表现为先升高后降低的趋势,在精巢成熟期表达量最高(P0.05),分别为精巢成熟前期、精巢成熟后期表达量的6.5倍、13.4倍。研究表明,尽管CYP11a1基因在卵巢和精巢发育过程中的表达规律不同,但CYP11a1基因在一定程度上与斑马鱼的性腺发育相关,其可能在促进斑马鱼精子成熟中发挥一定作用。     

日本血吸虫β-catenin基因的克隆及在不同发育阶段的表达水平

【目的】分析β-连环蛋白(β-catenin)在不同发育阶段日本血吸虫体内的表达特征,为研究Wnt/β-catenin信号通路对虫体发育的调控奠定基础。【方法】以7 d童虫cDNA为模板,通过RACE技术获得日本血吸虫β-catenin基因全长cDNA序列。采用实时定量PCR分析该基因mRNA在不同发育阶段日本血吸虫体内表达水平的变化。以含有多个抗原表位的β-catenin部分cDNA序列为模板,构建原核pET28a-β-catenin-310重组质粒,表达β-catenin蛋白。以纯化的原核表达产物为抗原,免疫BALB/c小鼠制备抗血清,以此抗血清为一抗,通过Westernblotting分析β-catenin蛋白在不同发育阶段日本血吸虫体内表达量的变化。【结果】β-catenincDNA(GenBank登陆号GU570442)序列全长2 354 bp,含完整的开放阅读框,编码671个氨基酸。β-catenin基因mRNA表达水平在虫卵中最高,23 d雌虫次之,在13 d童虫和23 d雄虫中也较高,约是23 d雌虫的一半,在其他发育阶段mRNA的表达水平相对较低。构建的重组质粒以包涵体形式表达β-catenin重组蛋白,该蛋白有很好的免疫原性。在日本血吸虫不同发育阶段β-catenin蛋白表达量的变化趋势与β-cateninmRNA表达水平的变化基本一致。【结论】不同发育阶段日本血吸虫β-catenin基因mRNA表达水平与β-catenin蛋白表达水平变化趋势基本一致;结合日本血吸虫发育特征,推测Wnt/β-catenin信号通路可能对虫体的器官分化、虫卵的形成及卵胚发育等过程起着重要的调控作用。     

黄体期和卵泡期小尾寒羊KiSS-1与RFRP-3组织表达研究

为分析KiSS-1和RFRP-3基因在小尾寒羊不同繁殖时期(黄体期和卵泡期)下丘脑、垂体、性腺轴各组织中的表达差异,阐明这2个基因在绵羊发情转换中的表达模式,以常年发情的小尾寒羊为研究对象,采用实时荧光定量PCR技术,对比分析了KiSS-1和RFRP-3基因在黄体期和卵泡期的小尾寒羊下丘脑—垂体—性腺轴各组织中的表达差异。结果表明:1)KiSS-1和RFRP-3基因在下丘脑、垂体、卵巢等10种组织中均有表达;2)黄体期和卵泡期下丘脑中KiSS-1基因表达量均显著高于其他组织(P0.05),卵泡期下丘脑和松果体中KiSS-1基因表达量均显著高于黄体期(P0.05);3)黄体期和卵泡期下丘脑和卵巢中RFRP-3基因的表达量均显著高于其他组织(P0.05),且卵巢中RFRP-3基因在黄体期的表达量显著高于卵泡期(P0.05)。综上,研究发现KiSS-1和RFRP-3基因在绵羊发情调控中均发挥重要作用,KiSS-1促进发情而RFRP-3抑制发情。     

苹果蠹蛾β-actin基因cDNA的克隆、序列分析及mRNA表达稳定性检测

【目的】克隆苹果蠹蛾(Cydia pomonella(L.))的β-actin基因cDNA全长,确定其作为内参基因的可能性。【方法】运用RT-PCR和RACE技术分段扩增苹果蠹蛾β-actin基因5′和3′非编码区及保守区,拼接后根据所获序列设计引物,完整克隆苹果蠹蛾β-actin基因。利用生物信息学软件对苹果蠹蛾β-actin基因编码的蛋白质进行分析预测;通过实时定量PCR和半定量PCR方法,检测不同发育阶段以及杀虫剂处理后苹果蠹蛾β-actin mRNA的表达情况。【结果】苹果蠹蛾β-actin基因cDNA全长1 466bp(GenBank登录号为KC832921),包括5′非编码区67bp、3′非编码区268bp和开放阅读框1 131bp,编码一个由376个氨基酸残基组成的蛋白质。推导的蛋白质相对分子质量为41.793 7ku,等电点为5.29,含有3个actin蛋白家族的典型识别特征以及6种类型的特定功能位点,氨基酸序列与其他昆虫β-actin一致性高达99%。实时定量PCR和半定量PCR结果表明,β-actin基因在苹果蠹蛾发育不同时期以及杀虫剂处理后表达量无显著差异(P0.05)。【结论】苹果蠹蛾β-actin基因可作为可靠的内参基因应用于基因mRNA的表达定量研究。     

镉急性染毒对中华稻蝗精卵巢小分子热休克蛋白基因表达的影响

小分子热休克蛋白(s HSPs)能够被环境胁迫诱导,采用不同浓度氯化镉(Cd Cl2)溶液对中华稻蝗5龄若虫进行急性染毒,利用Real-time PCR技术对5个小分子热休克蛋白基因Oc HSP19.1、Oc HSP19.8、Oc HSP20.4、Oc HSP20.7和Oc HSP21.1在精巢和卵巢的表达进行了分析。结果表明:在精巢内,Oc HSP19.1和Oc HSP19.8基因经0.16μg·μL-1Cd2+处理,其在不同处理时间的表达水平与对照组相比均显著升高;经0.32μg·μL-1Cd2+处理,其在2 h表达水平最高,之后显著降低;经0.48μg·μL-1Cd2+处理,Oc HSP19.1基因在2 h和6 h的表达量均高于对照组,在12 h的表达量低于对照组,Oc HSP19.8基因在2 h的表达量高于对照组,在6 h的表达量低于对照组,之后二者表达量都显著升高,在36 h表达量最高,分别为对照组的6.3倍和5.4倍。在卵巢内,Oc HSP19.1和Oc HSP21.1基因经0.16μg·μL-1和0.48μg·μL-1Cd2+处理,其在不同处理时间的表达水平与对照组相比无显著差异;经0.32μg·μL-1Cd2+处理,Oc HSP19.1基因在6 h和12 h的表达水平高于对照组,但在24 h低于对照组,Oc HSP21.1基因在2、6、12 h和24 h的表达水平与对照组相比均显著降低,但二者都在36 h表达量最高,分别为对照组的4.8倍和4.6倍;经0.16μg·μL-1和0.48μg·μL-1Cd2+处理,Oc HSP20.7基因在2 h表达水平高于对照组,经0.32μg·μL-1Cd2+处理,该基因的表达水平随着时间的延长出现先升高后降低的趋势。Oc HSP21.1基因在精巢内和Oc HSP20.4基因在卵巢内的表达水平与对照组相比无显著差异。研究结果显示,Cd急性诱导中华稻蝗5个Ocs HSPs基因在精巢和卵巢的表达模式不同,其表达量与Cd浓度和作用时间相关。     

中药复方多糖对不同MHC B-LβⅡ基因型鸡淋巴细胞IL-2、IL-4、IL-12 mRNA表达量的影响

【目的】中药复方多糖对不同MHC B-LβⅡ基因型鸡淋巴细胞IL-2、IL-4、IL-12 mRNA表达量的影响。【方法】采用PCR-SSCP方法将500羽京红1号蛋鸡按不同MHC B-LβⅡ基因型分组,采集不同MHC B-LβⅡ基因型鸡外周血淋巴细胞,分别加入终浓度为100、75、50、0μg/mL中药复方多糖共培养24 h,收集细胞,采用Real-time PCR方法检测不同MHC B-LβⅡ基因型鸡IL-2、IL-4、IL-12基因mRNA的表达量。【结果】(1)与对照组相比,不同剂量中药复方多糖均能显著增强不同MHC B-LβⅡ基因型鸡IL-2、IL-4、IL-12基因mRNA的表达量(P0.05)。(2)中药复方多糖剂量为50μg/mL时,AA、BC基因型鸡IL-2、IL-4、IL-12基因mRNA的表达量最高,中药复方多糖剂量为100μg/mL时,BB基因型鸡IL-2、IL-4、IL-12基因mRNA的表达量最高。【结论】中药复方多糖能不同程度的促进各MHC B-LβⅡ基因型鸡IL-2、IL-4、IL-12 mRNA的表达,且不同MHC B-LβⅡ基因型鸡淋巴细胞最适中药复方多糖免疫调节剂量不同。     

克氏原螯虾大颚器促性腺发育作用研究

[目的]研究克氏原螯虾（Procamharus clarkia）大颚器的组织学特点,探讨其大颚器在性腺发育过程的作用。[方法]采用大颚器和性腺组织的离体联合培养法,用卵黄发生期的克氏原螯虾大颚器刺激不同发育期的克氏原螯虾性腺。[结果]2处理组卵巢的最大卵径为（0．32±0．05）mm和（0．27±0．06）mm,2对照组卵巢的最大卵径为（0．24±0．05）mm和（0．20±0．05）mm;2处理组精巢的精母细胞直径为（13．09±0．75）μm和（12．93±0．98）μm,2对照组精巢的精母细胞直径为（10．29±1．00）μm和（10．02±0．68）μm。[结论]数据显示处理组的性腺细胞均比对照纽的性腺细胞显著增大（P〈0．05）,表明大颚器的功能性物质具有促进性腺细胞发育的作用,支持大颚器作为促性腺生长发育腺体的观点。     

Vasa基因在斑马鱼不同发育时期的mRNA 表达分析

Vasa基因在果蝇中首次报道后,作为不同物种早期原始生殖细胞(PGC)标记基因被普遍接受.但对其研究都集中于早期胚胎,对性腺分化及成熟时期的Vasa表达及功能少有研究.RT-PCR结果显示,Vasa基因在整个发育阶段的表达量先上升再下降.荧光定量PCR结果显示,在同一发育时期,精巢、卵巢表达量基本一致,卵巢略高于精巢.mRNA原位杂交显示,Vasa基因早期在斑马鱼生殖干细胞特异表达,随后在精巢表达于精原细胞和初级精母细胞,在卵巢表达于Ⅲ、Ⅳ、V时相卵母细胞.研究结果有助于鉴定斑马鱼生殖干细胞和进一步研究性分化和逆转的细胞机制.     

转基因鲤性腺结构及繁殖性能的研究

采用解剖及显微观察对大麻哈鱼生长激素基因鲤(以下简称转基因鲤)的性腺发育和繁殖性能进行了研究.结果表明:转基因鲤精巢组织结构属壶腹型,其壁由2层膜组成,外为腹膜,内为白膜,精小叶不规则排列,小叶由许多精小囊组成,精小囊是精子发生增殖、生长、成熟的地方,精子成熟后由精小囊进入小叶腔内.卵巢1对,位于腹腔两侧,外为腹膜,内为被膜,卵子成熟后由输卵管从泄殖孔排出体外.精卵生殖细胞发育程序相似,可分为6个时期.其中雌性个体成熟年龄为1周年;雄性个体成熟比雌性个体成熟早.成熟卵巢的成熟系数为0.49 ～0.84,成熟精巢的成熟系数为1.47 ～4.87.繁殖期性腺发育观察:7月时精巢中精原细胞和精母细胞所占比例较高,卵巢中初级卵母细胞所占比例较高;8月时精巢中精原细胞数量开始减少,精母细胞开始增加,并有少量精子细胞和精子出现,卵巢中卵母细胞数量有所增加,并出现一些小的液泡和卵黄物质;9月时精巢中大多都为精子细胞和精子,卵巢中大部分卵母细胞进入卵黄充塞期.通过对繁殖期3个月雌、雄个体性腺发育与普通鲤作t检验,雌、雄个体性腺发育程度有所不同但差异不显著(P＞0.05).该研究证明转基因鲤的性腺发育是正常的,雌、雄个体性个体都能达到性成熟.     

猪NR4A1基因的克隆、序列分析及表达模式研究

【目的】克隆猪核受体4A1(Nuclear receptor subfamily 4,group A,member 1,NR4A1)DNA序列全长,并对CDS序列及其表达模式进行分析。【方法】以未成年长大母猪的卵巢为材料,采用电子克隆技术,对猪NR4A1DNA序列进行分离和测序,并对猪NR4A1基因序列进行生物信息学分析;利用性腺激素(人绒毛膜促性腺激素(Human chorionic gonadotropin,HCG)和孕马血清促性腺激素(Pregnant mare serum gonadotropin,PMSG))处理卵巢颗粒细胞,采用RT-PCR方法分析猪NR4A1基因的表达模式。【结果】获得猪NR4A1基因4 870bp的DNA序列,其中CDS全长序列为1 734bp,共编码572个氨基酸;猪NR4A1基因编码的氨基酸序列与人的对应氨基酸序列的相似性最高(97%),其次为小鼠(94%);Expasy软件预测结果表明,NR4A1蛋白的氨基酸序列非常保守,其中包含2个锌指特征(NR C4-type),一个是激素受体超家族,另一个是Zf-C4超家族;猪卵巢颗粒细胞在性腺激素处理后,可诱导猪NR4A1基因在卵泡发育和排卵时期瞬时表达。【结论】猪NR4A1基因的CDS区在物种间保守性较强,推测猪NR4A1基因调节卵泡的发育和排卵过程。     

邻苯二甲酸二甲酯暴露对凡纳滨对虾壳膜几丁质酶的影响

以凡纳滨对虾为试验对虾,通过不同浓度0、2、10、20μg/L邻苯二甲酸二甲酯(DMP)暴露不同时间(120、240 h)后,采用酶促反应动力学法及实时PCR检测分析对虾壳膜几丁质酶比活力及几丁质酶mRNA表达量差异。结果显示,DMP暴露对对虾壳膜几丁质酶比活力具有抑制作用,但不具有显著性。不同浓度DMP暴露不同时间后,对对虾壳膜几丁质酶系列基因的mRNA表达量均受到不同程度的影响,2μg/L DMP暴露120 h时,对虾壳膜Lv CHT3mRNA表达量显著上升;2μg/L DMP暴露240 h时,Lv CHT2 mRNA表达量显著下降;20μg/L DMP暴露240 h时,Lv CHT6 mRNA表达量也显著下降,说明DMP对对虾生长发育具有毒性。     

青海湖裸鲤TOB1和TOB2基因的克隆与表达分析

【目的】对青海湖裸鲤TOB1和TOB2基因进行克隆及表达分析,为揭示其在青海湖裸鲤生长和生理过程中的作用奠定基础。【方法】采用PCR和RACE技术克隆青海湖裸鲤中TOB1和TOB2基因的cDNA全长序列,对其特性进行了生物信息学分析。以β-actin为内参基因,采用实时荧光定量PCR法(qRT-PCR)检测TOB1和TOB2基因在3龄成鱼肾脏、肠、鳃、脑、心脏、肌肉等组织及发育12,72,120,168,216 h胚胎中的表达水平。【结果】青海湖裸鲤TOB1 cDNA全长为1 734 bp,5′非编码区为466 bp,3′非编码区为296 bp,开放阅读框长972 bp,编码323个氨基酸。TOB2 cDNA全长为2 785 bp,5′非编码区为51 bp,3′非编码区为1 582 bp,开放阅读框为1 152 bp,编码383个氨基酸。TOB1和TOB2在N端均具有明显的BTG家族结构域,且系统进化分析显示2个TOB蛋白与鲤科鱼类同源性较高,亲缘较近。qRT-PCR结果表明,TOB1和TOB2在3龄成鱼的肾脏、肠、鳃、脑、心脏、肌肉等组织中均有表达;TOB1在3龄成鱼的心脏组织中表达量最高,其次为脑和肌肉组织,在鳃组织中的表达量最低;TOB2在3龄成鱼的脑组织中表达量最高,其次为肌肉。TOB1及TOB2在不同发育时期胚胎中均有表达,且都在12 h胚胎中表达量最高。【结论】TOB1及TOB2在3龄成鱼各个组织及胚胎中均有表达,但表达量有较大差异,表明2个基因均具有时空表达特异性。