铜胁迫对两种不同来源长萼鸡眼草生长及氮代谢的影响

采用苗期水培的方法,研究铜胁迫和营养缺失及二者的复合作用对矿区和非矿区长萼鸡眼草生长及氮代谢的影响差异.结果表明,植物吸收的cu绝大部分分配在植物的根部.Cu胁迫使植物组织中硝态氮(NO-3)含量和硝酸还原酶(NR)活性降低,使植物叶中铵态氮(NH 4)含量和谷氨酰胺合成酶(Gs)活性升高,植物生物量减少.Cu胁迫下矿区植物叶中Cu含量、根中Gs活性比非矿区的低.矿区植物叶生物量、组织中NR活性比非矿区的高.营养缺失使植物组织中NH 4量、NO-3含量、NR活性、GS活性显著降低.根生物量显著增加,且矿区植物叶中Gs活性的变化比非矿区的少.Cu胁迫营养缺失复合作用使植物组织中Cu含量、叶中GS活性显著升高,使根生物量、根中NR活性显著降低,且矿区植物叶中Cu含量增加的比非矿区的少.低营养胁迫可促进长萼鸡眼草对外源Cu的吸收,同时也刺激了植物根的生长,Cu胁迫和营养缺失环境下非矿区植物氮代谢的紊乱程度要比矿区的高,来源于矿区的植物对贫瘠和高Cu环境表现出更强的适应性.Cu及营养缺失对植物氮代谢的影响是非常复杂的,与植物组织中可利用氮和碳的改变有关,也与植物组织中酶活性的直接改变有关.     

连续2代铜胁迫处理对海州香薷种子形态大小、萌发及幼苗生长的影响

以经过实验室连续2代重金属铜胁迫处理的海州香薷种群和对照种群的种子为供试材料,探讨铜胁迫对海州香薷种子形态、萌发以及幼苗生长的影响。结果表明:连续2代铜胁迫处理的海州香薷种群的种子表面积、周长、长度和宽度均显著低于对照种群;在多数铜浓度下,铜胁迫处理种群的种子活力指数明显低于对照种群;在铜浓度为5、100μmol/L时,铜胁迫处理种群后代的胚轴长度显著低于对照种群;在铜浓度为5、500μmol/L时,铜胁迫处理的海州香薷种群幼苗的胚根长度显著高于对照种群;在铜浓度为5、20、100、250μmol/L时,铜胁迫处理种群后代的胚轴鲜质量要显著低于对照种群;在铜浓度为100、500μmol/L时,铜胁迫处理种群后代的胚根鲜质量显著低于对照种群。     

五节芒（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ ｆｌｏｒｉｄｕｌｕｓ）不同种群对镉积累与转运的差异研究

采用盆栽试验的方法,对比研究了来源于大宝山矿区和惠州博罗非矿区的两个五节芒种群在不同Cd含量土壤中的生长反应、Cd富集能力及对土壤Cd形态的影响。结果表明,来源不同的两个五节芒(Miscanthus floridulus)种群植株对土壤中不同浓度的Cd的生长反应不同,低浓度Cd处理,非矿区种群的地上部生物量即受到显著影响,而矿区种群受到的影响不显著。Cd处理浓度提高时,非矿区种群的地上部生物量为对照的30.17%～42.07%,矿区种群地上部生物量为对照的57.80%～67.04%。非矿区种群根部生物量随处理浓度的增加而降低,为对照的57.75%-64.08%,而矿区种群显著升高,为对照的117.43%～135.56%。五节芒矿区种群地上部和根部的Cd含量随着土壤Cd处理浓度的升高而迅速升高,其升高速度明显快于非矿区种群。五节芒矿区种群根部积累的Cd总量远大于非矿区种群,且随着土壤中Cd添加量的增加而显著增加(P<0.05)。随着Cd胁迫程度的加重,五节芒两种群转移系数和耐性指数都有不同程度的下降,矿区种群的转移系数和耐性指数明显高于非矿区种群。Pearson相关性分析发现,五节芒根部生物量与地上部生物量极显...     

铜胁迫下硫对玉米叶片叶绿素及MDA含量的影响

以农大108号玉米为供试材料，通过室内盆栽方法，测定Cu(+Cu)和S（+S）处理及二者共同处理（+Cu+S）下玉米苗期和拔节期生物量、叶片SPAD值及丙二醛（MDA）含量变化。结果表明，不同处理在玉米苗期和拔节期的生物量分别表现为CK>+S> +Cu+S>+Cu及+S>CK>+Cu+S>+Cu，说明铜污染对玉米生长有明显的抑制作用，而增加硫营养可减轻铜对植株的毒害。玉米苗期不同处理间叶绿素含量差异显著。在拔节期，+Cu处理对SPAD值的影响显著增加，但补充硫营养后可明显减小铜对叶绿素的抑制作用。苗期铜对叶片MDA含量的影响显著，可导致MDA含量增大，说明铜胁迫可引起膜质过氧化程度加剧，其产物MDA的积累增加；+S与CK处理间变化不明显，但+Cu+S较+Cu处理的MDA的积累明显减少，说明硫营养体现出一定的抵御铜胁迫的作用。     

水稻金属硫蛋白ricMT基因的耐性分析

铜镉胁迫下水稻幼根中金属硫蛋白基因ricMT被显著诱导,通过构建ricMT基因的原核表达载体及大肠杆菌转化,进行ricMT基因的耐性分析.结果显示,经IPTG诱导后,转入ricMT的菌株比转入空载体的对照菌在铜、镉和H2O2胁迫下生长旺盛,说明ricMT的表达有利于增加大肠杆菌对重金属胁迫的耐性.     

矿区Cu耐性植物研究初探

对长江沿岸几个主要Cu矿区的植被及其Cu含量分布进行了调查分析,并且通过多批次室内培养试验研究了几种候选植物品种对Cu的富集效果。结果表明,虽然在矿区被调查植物中仍没有发现具有严格意义上的Cu超富集植物,但是由于鸭跖草(CommelinacommunisL.)和杠板归(Polygonumperfoliatum)对Cu均有较多吸收,其中杠板归在一定条件下其地上部累积Cu的含量能够超过1000mg·kg-1,较鸭跖草高,表现出非常强的吸收Cu的能力,所以具有很好的应用前景。盆栽试验发现,鸭跖草和杠板归对Cu均具有很好的耐性,溶液Cu浓度达400μmol·L-1时2种植物均仍能正常生长。另外,EDTA可以显著增加鸭跖草对土壤Cu的吸收,但对其生长有明显抑制。     

Cu、Pb、Zn及复合重金属对油菜种子萌发的抑制性研究

本文通过种子萌发试验,探讨了2种油菜种子对重金属耐性的大小.研究发现,2种油菜种子萌发率在不同重金属及其不同浓度下存在差异,重金属Zn和Pb低浓度时促进油菜种子的萌发,高浓度时抑制其种子的萌发.重金属Cu和复合重金属对2个不同油菜品种的萌发率都存在显著的抑制作用,其萌发率随浓度的增高而降低.来自矿区的油菜种子在低浓度时萌发率低于正常油菜种子,在较高的浓度中,其萌发率较高,表现较强的耐性.结果表明,油菜对Cu耐性较弱,而对Pb、Zn的耐性较强,污染地区铜尾矿的油菜种子对高浓度的重金属具有比正常油菜种子较好的耐性.     

硅对不同类型酸雨处理下水稻幼苗根系的影响

硅在减少植物环境压力对环境的危害方面具有重要作用。酸雨是一种严重的非生物胁迫因子,硅可以缓解酸雨对植物造成的压力。本实验研究了硅对模拟不同类型酸雨处理下水稻幼苗根部生物量,矿质元素硅,根系表型与根型指数和相关酶活性的影响。结果表明:2mM Si和硝酸型酸雨的单一或复合效应促进了水稻根系的生长,综合处理效应强于单一处理。单一硝酸处理具有促进作用,单一硫酸处理具有抑制作用,单一混合型处理无明显影响。加入2mM Si以后,对于硝酸和混合处理下水稻生长具有显著促进作用,对于硫酸处理下水稻生长具有缓解作用。     

香根草和香茅草对铜、锌的耐性研究

通过香根草和香茅草的水溶液培养,研究不同浓度的铜和锌对香根草、香茅草的生理和生态的影响。结果表明：香根草对重金属铜和锌的耐性指数大于香茅草的耐性指数,香根草和香茅草对锌的耐受能力比对铜的耐受能力要强,富集的重金属主要部位是根部。     

电厂灰渣场微生物分布及其重金属耐性菌的筛选研究

为了探索重金属污染与土壤微生物学指标的内在联系,选取芜湖发电厂灰渣场的土壤,研究其微生物的分布,并对重金属耐性菌株进行筛选。结果表明：灰渣场周围土壤中的细菌和真菌数量较多,而放线菌数量较少,并且采样点距离排污口越近,微生物的数量越少。镜检发现重金属铜和铅耐性菌株均为单一的短杆状真菌,对铜和铅最大耐受浓度分别为70和200mg·L^-1;重金属镉耐性菌株筛选出的菌落并非单一菌落,最大耐受浓度为10mg·L^-1。     

八棱海棠耐盐碱性评价

为探明八棱海棠的耐盐碱性种质资源价值,以实生苗为试材,采用水培的方法评价了八棱海棠耐盐性和耐碱性.结果表明:1)0.4％ NaCI处理30 d时,八棱海棠的盐害指数为51.1,根据耐盐性评价标准判定为中等耐盐型树种;其实生个体间存在广泛的抗性分离现象,极强、强、中、弱和极弱耐盐型植株分别占群体总数的20.6％、23.9％、37.0％、12.0％和6.5％.2)pH9.5碱处理(Na2CO3)30 d时,八棱海棠的碱害指数为16.3,根据耐碱性评价标准判定为极强耐碱型树种;其实生个体间存在广泛的抗性分离现象,极强、强、中、弱和极弱耐碱型植株分别占群体总数的79.1％、15.3％、4.2％、1.4％和0％.八棱海棠中存在极强耐盐型和极强耐碱型植株,是优异的耐盐/碱型种质资源树种.     

马铃薯品种耐弱光性评价及其指标的筛选

【目的】近年来,弱光胁迫逐渐成为冬作、保护地和间套作栽培马铃薯生产的重要限制因素。通过筛选马铃薯耐弱光性鉴定指标,评价不同品种的弱光耐受性,为马铃薯耐弱光品种选育和冬作马铃薯产业发展及马铃薯间套作栽培提供科学依据。【方法】采用大田试验,以10个马铃薯品种为供试材料,齐苗后用遮阳率为70%的遮阴网进行全生育期遮阴处理,以自然光照为对照。初花期测定株高、节间长、叶面积等形态指标,叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素等色素含量指标和净光合速率、气孔导度、蒸腾速率等光合生理指标,收获后测产并计算单株块茎重。通过计算马铃薯各品种耐弱光系数、耐弱光指数和各指标胁迫指数,使各指标间具有可比性。以耐弱光系数和耐弱光指数闭区间扩展值对各马铃薯品种耐弱光性进行评价,将各指标胁迫指数分别与耐弱光系数和耐弱光指数进行相关性分析,筛选出具有显著相关的指标。【结果】与对照相比,遮阴处理后马铃薯在形态、生理和产量等方面均发生改变:株高增加,节间伸长,叶面积增大;叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量增加,叶绿素a/b值减小,类胡萝卜素含量总体呈增加趋势;净光合速率、瞬时水分利用效率、气孔导度显著下降,蒸腾速率显著增加,胞间CO2浓度呈增加趋势;单株块茎重显著减少,减产幅度达62.14%—90.74%。根据耐弱光系数和耐弱光指数评价马铃薯耐弱光性结果基本一致,但耐弱光指数不仅反映了马铃薯产量对遮阴胁迫的敏感性,同时也反映了不同基因型差异对产量的影响,较耐弱光系数评价方法严格。叶面积、单株块茎重、叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素和类胡萝卜素胁迫指数6个指标与耐弱光系数或耐弱光指数呈显著或极显著相关,可以作为马铃薯耐弱光性有效鉴定指标。【结论】中薯20高度耐弱光,woff中度耐弱光,费乌瑞它和会-2低度耐弱光,其余品种均不耐弱光。以耐弱光系数和耐弱光指数为主要鉴定指标,并结合与之显著相关的形态、生理和产量等指标对马铃薯耐弱光性进行综合评价较为客观、可靠,而且方便易行。     

盐氮处理下盐地碱蓬种子成熟过程中的离子积累和种子萌发特性

研究了盐氮处理条件下盐地碱蓬种子成熟过程中的离子积累以及种子萌发特性,以理解盐地碱蓬在种子发育及萌发过程中对高盐低氮生境的适应性。结果表明,种子成熟过程中,不同浓度盐氮处理下(0.5和5 mmol/L NO₃^--N;1和500 mmol/L NaCl),与果皮和果枝相比, 胚中Na⁺、K⁺、Cl^- 和NO₃^-离子含量几乎没有变化。所有盐氮处理下Na⁺ 和Cl^-都是果皮和果枝中高于胚中,尤其是在高盐处理下。高盐处理下,K⁺ 和NO₃^-含量呈现相反的趋势。高氮时无论高盐还是低盐,果皮中NO₃^-离子含量高于胚中,而果枝中NO₃^-离子含量低于胚中。而低氮时果皮及果枝中NO₃^-离子含量均显著低于胚中。与高氮环境下收获的种子相比,低氮环境下收获的种子萌发率,萌发指数,活力指数都要明显高。上述结果说明,盐地碱蓬种子成熟过程中存在完善的离子调控机制,保护胚免受Na⁺ 和Cl^-等有害离子的伤害并且促进K⁺ 和NO₃^-等营养离子的积累。低NO₃^--N下收获的种子对外界的NO₃^-含量比较敏感,施以较高浓度的NO₃^-能够促进种子萌发,提高萌发指数和活力指数,可能与盐地碱蓬长期适应高盐低氮生境有关。     

油菜耐盐相关性状的全基因组关联分析及其候选基因预测

【目的】通过对甘蓝型油菜耐盐相关性状进行全基因组关联分析,寻找可能与油菜耐盐性相关的SNP位点,发掘与油菜耐盐性有关的候选基因。【方法】以1.2%NaCl溶液作为培养液,去离子水为对照,对307个不同品系的甘蓝型油菜进行发芽试验。播种后7 d测定幼苗根长、鲜重及发芽率,计算盐胁迫下各性状相对值,并作为评价耐盐的指标。结合油菜60K SNP芯片,利用SPAGeDi v1.4软件对该群体307份甘蓝型油菜进行亲缘关系分析,并计算亲缘关系值的矩阵。利用软件STRUCTURE v2.3.4对关联群体进行了群体结构分析。为有效排除假关联的影响,将群体结构和材料间的亲缘关系考虑进关联分析中,同时进行了PCA+K模型、Q+K模型以及K模型3种混合线性模型分析和比较,根据所有SNP的–lg(P)观察值和期望值,确定每个性状GWAS分析的最优模型。采用TASSEL 5.0软件,在最优模型下对307份材料耐盐各性状的相对值分别与SNP标记进行全基因组关联分析。利用油菜基因组数据库,在显著SNP位点侧翼序列200 kb范围内提取基因。根据拟南芥中已经明确功能的耐盐相关基因,筛选出目标基因组区段内与耐盐相关的油菜同源基因。【结果】全基因组关联分析共检测到164个与根长显著关联的SNP位点,23个与鲜重显著关联的SNP位点,38个与发芽率显著关联的SNP位点。其中与根长、鲜重、发芽率最显著关联的SNP位点分别位于染色体A08、A02和A06,贡献率分别为23.84%、18.59%和31.81%。在这些显著SNP位点侧翼序列200 kb范围内发掘出可能与油菜耐盐性有关的50个候选基因。这些候选基因主要包括转录因子MYB、WRKY、ABI1、b ZIP、ERF1、CZF1、XERICO等以及一些下游受转录因子调控的不同功能基因NHX1、PTR3、CAT1、HKT、CAX1、ACER、STH、STO等。在根长和发芽率2个不同耐盐性状的分析结果中均筛选出位于A03染色体上的耐盐基因BnaA03g14410D。另外,这些耐盐候选基因中包含两组串联重复基因,分别是位于A03染色体上的BnaA03g18900D和BnaA03g18910D,位于C09染色体上的BnaC09g19080D、BnaC09g19090D和BnaC09g19100D。除此之外,耐盐候选基因中还包含2个距离非常近(中间只间隔2个基因)的重复基因BnaC02g39600D和BnaC02g39630D。【结论】共检测到225个与耐盐性状显著关联的SNP位点,筛选出50个可能与油菜耐盐性有关的候选基因。     

异源表达irrE转基因烟草的耐盐耐旱性

【目的】IrrE是从耐辐射异常球菌中发现的全局调控蛋白,主要通过修复强辐射等逆境条件下DNA损伤,提高耐辐射异常球菌对极端逆境环境的抗性。研究按植物密码子优化的irrE后导入烟草对转基因烟草耐逆能力的提高,为棉花等作物耐逆育种研究打下基础。【方法】按照植物密码子优化细菌irrE并合成基因;通过酶切连接法构建irrE植物表达载体;通过叶盘法转化烟草并PCR验证获得阳性转基因再生苗;通过实时荧光定量PCR(q RT-PCR)分析转基因株系中irrE的表达量;通过蛋白免疫印迹法(Western blot)检测IrrE编码蛋白;通过NaCl和甘露醇模拟盐处理和干旱处理分析纯和转基因株系的耐盐耐旱性,通过测定抗逆相关生理指标鉴定其对植物耐逆的贡献。【结果】按照植物密码子对irrE进行改造,共优化了241个密码子;构建了高效植物表达载体GBI-IE;利用除草剂草甘膦作为筛选剂获得转基因再生幼苗,并通过PCR验证共获得15个独立的转基因株系;通过q RT-PCR分析从中选取两个表达量最高的株系GO1和GO2进行后续的抗逆性分析;Western blot验证IrrE编码蛋白在GO1和GO2中能正确翻译。转基因烟草耐盐耐旱性分析:种子萌发试验表明,正常1/2 MS培养基上,转基因株系GO1和GO2发芽率和非转基因野生型对照之间没有明显的差异。然而250 mmol·L~(-1)NaCl培养基上GO1和GO2萌发率分别为78.8%和90.0%,野生型仅为10.3%,分别提高了68.5%和79.7%。类似地,300 mmol·L~(-1)甘露醇条件下,野生型的萌发率为39.7%,转基因株系GO1和GO2分别提高了42.9%和50.8%;正常萌发的种子移栽到250 mmol·L~(-1) NaCl和300 mmol·L~(-1)甘露醇条件12 d后,转基因株系根长、侧根数以及鲜重等生理指标显著高于野生型对照;温室中正常生长30 d的苗期烟草在250 mmol·L~(-1) NaCl处理下,转基因烟草SOD、CAT活性比野生型对照分别提高了48.80%和88.55%,而MDA含量比野生型对照降低了61.61%,胁迫响应基因Nt ABF2、Nt LEA5、Ntzfp、Nt CDPK2在GO1和GO2转基因株系中表达量均显著高于非转基因野生型。和盐处理结果类似,300 mmol·L~(-1)甘露醇的处理下,转基因烟草的耐旱生理生化指标均优于非转基因对照。【结论】烟草中异源表达耐辐射异常球菌irrE可以显著提高耐盐耐旱性;其多效性耐非生物胁迫能力的提高表明其可作为植物耐逆基因工程的优良基因源。     

盐胁迫下甘蓝型油菜发芽期下胚轴和根长的全基因组关联分析

【目的】解析甘蓝型油菜发芽期根和下胚轴发育及耐盐性的调控位点,筛选油菜耐盐性相关的候选基因,可为油菜耐盐性改良提供依据。【方法】以317份具有代表性的甘蓝型油菜自交系为材料,在正常生长和盐胁迫条件下进行沙培鉴定,利用芸薹属60K SNP芯片和全基因组关联分析鉴定正常生长与盐胁迫下甘蓝型油菜发芽期根和下胚轴长度显著关联的SNP,并确定其连锁不平衡区间。通过区间内基因的功能注释及盐胁迫下油菜幼苗根和叶片转录组差异表达基因筛选连锁不平衡区间内的重要候选基因,并以实时荧光定量PCR分析候选基因的组织特异性和盐胁迫诱导表达模式,提高候选基因筛选的准确性。【结果】正常生长和盐胁迫下甘蓝型油菜发芽期下胚轴和根长在不同材料间变异较大,频次分布表明目标性状均为数量性状,受多基因调控。全基因组关联分析模型比较表明,MLM+P+K模型为最优模型。以此模型对目标性状进行全基因组关联分析,检测到45个显著关联SNP,其中40个与下胚轴长度显著关联,5个与根长显著关联,单个SNP解释的表型变异分别为9.12%—14.46%和7.67%—8.93%。重复检测的显著相关SNP中,值得注意的是C04染色体的rs8970,同时与4个性状显著关联,表型贡献率为7.67%—12.35%,是唯一在下胚轴长和根长间重复检测到的显著关联SNP。11个重要关联SNP中有6个位于10—442 kb的连锁不平衡区块中。转录组分析表明,11个连锁不平衡区间共包含447个基因,其中15个受盐胁迫诱导表达。转录组和基因功能注释综合分析表明,BnaSRO1、BnaPAGR2、BnaNPH3、BnaMYB124、BnaSAM-Mtase、BnaBIN2、BnaUMAMIT11、BnaEXPA7、BnaRPT3、BnaEF-hand和BnaF3H很可能为各自区间的候选基因。实时荧光定量PCR结果证实除BnaNPH3外,其他基因均在根或下胚轴中受盐胁迫诱导上调表达。组织特异性分析还发现BnaUMAMIT11、BnaPAGR2和BnaEXPA7主要在萌发的根和下胚轴中特异表达,BnaRPT3、BnaBIN2和BnaMYB124虽然呈组成型表达,但在萌发阶段的下胚轴中表达量最高,证实这些基因很可能参与油菜发芽期根和下胚轴生长发育及耐盐性的调节。【结论】全基因组关联分析共鉴定出45个控制油菜发芽期根和下胚轴发育及耐盐性的显著关联SNP。连锁不平衡、转录组和基因功能注释综合分析初步鉴定出11个重要候选基因。     

转LOS5玉米的大田抗旱性鉴定

【目的】培育转基因抗旱玉米新品种是解决玉米生产问题的重要途径。通过鉴定和分析拟南芥LOS5转入玉米后对玉米田间抗旱性的影响,筛选抗旱性突出的转LOS5的玉米株系用于抗旱育种。【方法】在150、225、300、375、450和600 mm(CK)梯度灌水胁迫处理条件下,大田鉴定8个转LOS5玉米株系及其受体郑58的抗旱性,测定产量和其他农艺性状的变化,明确LOS5在提高玉米抗旱性方面的主要田间表现形式,同时筛选抗旱性显著优于受体的转基因株系。【结果】随着累计灌水量600—150 mm逐渐降低,9个试验材料的产量和抗旱性均相应下降。8个转基因玉米株系的产量在225—450 mm灌水范围内均显著高于受体郑58,且在正常灌水600 mm的一半处理(300 mm)时差异最大化。300 mm灌水处理中,8个转基因株系的抗旱性指数为0.56—0.70,显著高于受体郑58(0.5),抗旱性提高12%—40%。抗旱性从强到弱的材料顺序是T8920B6、T8920B2、T8920B7、T8920B5、T8020B1、T8920B4、T8920B3、T8920B8和受体郑58。营养体生长和发育方面,在灌水150—225 mm处理中,8个转基因材料灌浆末期的叶色SPAD值38.4—42.4,均极显著高于受体郑58(28.7—37.5),但地上部生物重量、株高和穗位高没有显著差异;果穗发育方面,在灌水150—225 mm处理中,8个转基因株系的穗重为42.3—61.6 g,穗长为10.9—13.1 cm,均极显著高于受体(36.4—40.7 g和8.5—11.8 cm),但轴重和穗粗的差异不显著;籽粒发育方面,8个转基因株系的穗粒数为86.6—182.6,行粒数为8.4—15.6,也显著高于受体的穗粒数57.3—83.2和行粒数4.9—7.1,但穗行数和百粒重差异不显著。【结论】LOS5转入受体郑58后,对转基因玉米开花前营养生长的影响较小,但在开花之后维持受旱玉米的穗长、行粒数和灌浆后期叶色等方面发挥了积极作用,使受旱玉米的穗重、穗粒数和产量保持在相对较高的水平,从而提高了玉米的抗旱性;LOS5转基因玉米株系的抗旱性均高于受体郑58,但抗旱性提高程度有显著差异,对不同转化株系进行大田抗旱性鉴定和筛选是十分必要的;正常灌水量一半的胁迫强度能最大化玉米抗旱性的差异,有利于鉴定和筛选出有利用价值的转基因材料。     

棉花精氨琥珀酸合成酶基因GhASS1的克隆及表达分析

【目的】克隆棉花精氨琥珀酸合成酶基因GhASS1的cDNA序列,并利用原核表达系统高效表达融合蛋白,检测融合蛋白的精氨琥珀酸合成酶活性及其表达对工程菌生长、耐盐能力及与游离L-瓜氨酸（L-Cit）和L-精氨酸（L-Arg）含量的影响,为解析该基因的功能及作用机制奠定基础。【方法】以拟南芥推断的精氨琥珀酸合成酶cDNA序列作为探针,利用电子克隆和RT-PCR技术,从棉花幼叶中获得cDNA片段,T/A克隆测序后得其序列信息,利用生物信息学软件分析其DNA结构、蛋白质结构、功能域和同源性,并构建系统进化树。利用qRT-PCR检测其在盐胁迫下的表达模式;将GhASS1的开放阅读框连接到原核表达载体pCold-TF上,构建融合表达载体pCold-GhASS1,转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)plysS中进行IPTG诱导表达,利用SDS-PAGE法测定表达产物分子量,焦磷酸荧光法测定酶活性和比活力,HPLC法测定工程菌中L-Cit和L-Arg的含量,对比不同温度和不同NaCl浓度下工程菌与对照菌的生长速度及其体内L-Cit、L-Arg含量及L-Arg/L-Cit。【结果】棉花GhASS1存在于D基因组的第1染色体上,由10个外显子和9个内含子构成,其cDNA全长序列共1 584 bp,其中5′非翻译区22 bp,开放阅读框1 485 bp,3′端非翻译区77 bp,编码产物由494个氨基酸组成,推断分子量为54 kD,等电点6.74;序列比对分析表明GhASS1与大肠杆菌、酵母和拟南芥中同源蛋白序列一致性分别为21.81%、41.1%和78.5%,且具有典型的精氨琥珀酸合成酶结构模序;系统进化分析显示GhASS1与番茄、马铃薯和烟草中同源蛋白亲缘关系最近,而与云杉、卷柏中同源蛋白亲缘关系最远;盐胁迫可上调叶片中GhASS1的表达,1 d时达到峰值,随后逐渐下降,推测GhASS1参与棉花对盐胁迫的早期响应。表达载体pCold-GhASS1在工程菌中表达的融合蛋白分子量约108 kD,与预期相符,在体外具有精氨琥珀酸合成酶活性;与对照菌相比,pCold-GhASS1工程菌中游离L-Cit含量下降,L-Arg含量上升,且在生长周期中较快进入对数生长期;在含高浓度NaCl的培养基中pCold-GhASS1工程菌表现出更强的生长活力和较高的L-Arg/L-Cit值,显示了其具有较强的L-Cit向L-Arg的代谢流。【结论】从棉花中克隆了植物精氨琥珀酸合成酶基因cDNA序列GhASS1,推测其在植物体内可参与植物的生长和耐盐能力的调控。     

杜梨HMGR基因克隆及其转基因烟草种子耐盐性分析

为研究3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)在植物耐盐方面的作用机理,以杜梨(Pyrus betulaefolia Bunge)叶片为材料,通过同源克隆获得开放阅读框为1 815bp的cDNA全长序列,编码604个氨基酸的cDNA全长序列,结构预测显示该蛋白质的N端含有2个保守的跨膜结构域,C端具有催化区,包含HMG-CoA结合结构域和NADP(H)结合结构域。NCBI序列比对发现,其与苹果、沙梨HMGR的氨基酸序列同源性高达97%和93%;MEGA 5.0聚类分析发现该基因属于HMGR1亚类基因,因此,将该基因命名为PbHMGR。RTPCR分析表明,PbHMGR在杜梨韧皮部、木质部、芽、叶片和花中均有表达,在芽中表达量最高。洋葱表皮亚细胞定位发现PbHMGR蛋白在细胞质中呈现点状分布。利用农杆菌侵染叶盘法将PbHMGR转化烟草,转基因T0代种子在添加不同浓度NaCl的培养基上播种,统计萌发率并观察萌发状态,发现转基因烟草种子抗盐胁迫的能力显著高于对照。说明PbHMGR基因可以在一定程度上提高植物种子的耐盐性。     

大豆GmHAT5的克隆及其转基因百脉根的抗盐分析

【目的】从大豆盐胁迫基因表达谱中筛选并克隆得到同源异型域亮氨酸拉链蛋白(HD-Zip)家族基因GmHAT5,将其转化豆科模式植物百脉根并进一步探究其抗盐调控机制。【方法】使用多种生物信息学软件对GmHAT5的开放读码框(ORF)、编码蛋白的分子量、等电点、序列结构和蛋白定位等进行预测,同时将大豆GmHAT5蛋白与其他10个物种的同源蛋白进行比对分析,并对GmHAT5在大豆不同器官及盐胁迫下的表达特性进行分析。此外,构建GmHAT5的植物超表达载体,通过对发根农杆菌LBA1334的转化,得到"复合体"百脉根植株,并在盐胁迫条件下对其进行抗盐表型分析;通过对根癌农杆菌EHA105的转化,获得百脉根的稳定转化株系,并对其进行抗盐表型分析及相关生理指标检测。【结果】多种生物信息学软件分析表明,该片段包含1个1 038 bp的ORF,编码345个氨基酸。GmHAT5的理论分子量和等电点分别为39.17 k D和4.63。GmHAT5蛋白定位于细胞核,与其他HD-Zip家族蛋白一样,属于典型的核蛋白。序列分析表明,GmHAT5包含一个同源异型结构域和一个亮氨酸拉链结构域,属于第I类同源异型域亮氨酸拉链蛋白。同源蛋白比对表明其与野生大豆GsHAT5同源性最高。基因表达特性分析表明,GmHAT5在大豆植株的各个不同器官中均有表达,是一个受盐诱导上调表达的HD-Zip类转录因子。发状根转化的结果表明,使用200 mmol·L~(-1) NaCl处理植株7 d后,"复合体"植株生长状态良好,对照组植株叶片明显萎蔫、失绿;不同NaCl浓度处理离体转基因发状根14 d后,对照组较试验组发状根明显干枯、生长受到抑制。稳定转化结果显示,不同盐浓度处理14 d后,转GmHAT5百脉根与两组对照植株相比生长状态更好。相关生理指标检测结果显示,与两组对照相比,转基因百脉根植株中丙二醛含量和相对质膜透性明显降低(P0.05),而叶绿素含量和根系活力则显著升高(P0.05)。测定不同植株阳离子含量的结果表明,转基因百脉根株系与两组对照相比,Na~+在叶片和根中含量显著下降,K~+和Ca~(2+)在叶片和根中含量显著升高。【结论】从大豆中克隆得到一个编码HD-ZipⅠ类同源异型域亮氨酸拉链蛋白基因GmHAT5,该基因在大豆中受盐胁迫诱导表达量显著升高。超量表达GmHAT5显著增强百脉根的耐盐能力,发状根转化法可以作为一种快速有效筛选抗盐候选基因的手段。推测GmHAT5在大豆盐胁迫应激调控中扮演重要角色。