转基因作物中常见Bt基因PCR检测方法的建立

建立基于常见外源基因的转基因成分检测方法是开展转基因生物监测与检测活动的技术支撑,Bt基因作为目前商业化应用最广泛的一类外源基因,已成为转基因产品筛选检测的重要靶标。依据转基因作物中常见的6种Bt基因(cry1F、cry1C、cry1Ie、cry34Ab、cry35Ab、vip3A)的核苷酸序列设计特异性PCR引物,并经过特异性、灵敏度等一系列测试,建立上述6种Bt基因的定性PCR检测方法。结果显示,应用这些方法均可从含有相应Bt基因的样品中正确检测出预期转基因成分,方法的灵敏度可达0.10%。上述方法具有特异性强、灵敏度高等特点,适用于转基因作物中常见Bt基因的筛选检测。     

抗虫棉及其杂交后代Bt基因的检测

根据Bt基因序列设计特异引物,对100株抗虫棉杂交后代进行PCR扩增,获得98个Bt基因条带,Bt条带出现频率为98%;对其他10个棉花品种基因组进行Bt基因扩增,抗虫棉中棉所45出现Bt基因特异条带,除非转基因亚洲棉中出现Bt条带外,其他非转基因棉品种均无Bt基因条带.     

CrylAb基因转化甘蔗及转基因抗虫植株的获得

构建玉米UBI启动子驱动Bt CrylAb基因的高效植物表达载体pUBTB．通过农杆菌介导法导人甘蔗愈伤组织,经过除草剂PPT三次连续筛选,共获得67株抗性植株,经PCR扩增检测,得到22株阳性植株,并对其进行RT—PCR检测,证明外源基因已经成功整合到其中的15株甘蔗基因组中,且得到了有效的表达。     

CrylAb基因转化甘蔗及转基因抗虫植株的获得

构建玉米UBI启动子驱动Bt CrylAb基因的高效植物表达载体pUBTB．通过农杆菌介导法导人甘蔗愈伤组织,经过除草剂PPT三次连续筛选,共获得67株抗性植株,经PCR扩增检测,得到22株阳性植株,并对其进行RT—PCR检测,证明外源基因已经成功整合到其中的15株甘蔗基因组中,且得到了有效的表达。     

抗虫杂交棉苏杂6号抗虫亲本的Bt基因类型鉴定与染色体定位

为研究抗虫杂交棉苏杂6号抗虫亲本YL02-1的Bt抗虫基因类型,抗虫性状遗传方式以及Bt基因在染色体上的插入位置,首先利用特异引物对抗虫亲本YL02-1的Bt基因来源进行PCR鉴定,结果显示,其扩增条带符合国产Bt抗虫基因引物设计的特征片段长度456 bp。而后以抗虫亲本YL02-1与非抗虫海岛棉种质系海7124杂交配组获得F_1,F_1自交获得F_2分离群体。对F_2分离群体的分析结果显示,Bt抗虫基因符合3∶1理论分离比例。进一步利用F2中含有Bt和不含Bt基因的棉株DNA构建近等基因混合池,以覆盖棉花26对染色体的234对核心引物检测混合池,共获得38对SSR多态性引物。将获得的多态性引物检测F_2分离群体基因型,发现分子标记NAU2579与目的基因连锁。已知分子标记NAU2579位于棉花第20染色体,对该分子标记上、下50 cM之内的其他分子标记进行多态性筛选,共获得17个与Bt基因连锁的分子标记,目的基因位于分子标记Gh564和NAU3813之间,其遗传距离分别为2.8 cM和12.2 cM。由此,将亲本YL02-1中的Bt抗虫基因定位于棉花第20染色体上。     

陆地棉低毒Bt基因对棉铃虫抗性的遗传效应分析

以Bt低毒表达的陆地棉种质系WG-20为试验材料,与若干Bt高毒表达的抗虫棉品系配制杂交组合,对其F1的Bt毒蛋白表达量、生物学抗虫性进行了分析。结果显示:Bt低毒表达性状对高毒表达性状表现为显性,生物学抗虫性也是低抗性状对抗级性状表现为显性,即低毒Bt基因对高毒Bt基因表现为显性抑制现象;Bt高毒表达材料之间杂交组合的F1则呈现Bt高毒表达,生物学抗性表达规律也是如此,即高毒Bt基因间不存在同源Bt基因表达的沉默现象。     

陆地棉低毒Bt基因对棉铃虫抗性的遗传效应分析

以Bt低毒表达的陆地棉种质系WG-20为试验材料,与若干Bt高毒表达的抗虫棉品系配制杂交组合,对其F1的Bt毒蛋白表达量、生物学抗虫性进行了分析。结果显示:Bt低毒表达性状对高毒表达性状表现为显性,生物学抗虫性也是低抗性状对抗级性状表现为显性,即低毒Bt基因对高毒Bt基因表现为显性抑制现象;Bt高毒表达材料之间杂交组合的F1则呈现Bt高毒表达,生物学抗性表达规律也是如此,即高毒Bt基因间不存在同源Bt基因表达的沉默现象。     

大米和米制品Bt63转基因检测PCR方法的灵敏度研究

采用普通PCR法和荧光定量PCR法对Bt63转基因大米的检测灵敏度进行对比研究。根据大米内源蔗糖磷酸合成酶基因SPS和结构特异性基因Btc的基因序列,选用特异性的引物和探针进行研究,经验证试验表明具有专一性,能用于品系鉴定。在灵敏度试验中,阳性转基因大米按照不同质量百分比进行梯度稀释,提取DNA进行PCR扩增。结果表明,普通PCR检测的灵敏度在0.1%左右,而荧光定量PCR检测的灵敏度为0.01%,是普通PCR检测的10倍以上。应用两种方法对实际样品进行检测,都得到了较明显的内源SPS基因的扩增,而Btc基因都是阴性。荧光定量PCR方法避免了电泳检测的步骤,具有更高的安全性和简便性,因此日常检测中,利用荧光定量PCR技术检测Bt63转基因大米及其产品是一种快速、灵敏和准确的检测手段。     

转基因玉米种子的PCR检测

以PCR技术为基础,建立了检测玉米种子中转基因成分的方法。对提取的基因组DNA进行PCR以扩增玉米内源基因zSSIIb,设计了常见的CaMV 35 S启动子、NOS终止子、Bar终止子、Bt,进行了初步的定性筛选,并用Bt176对阳性结果进行验证,结果表明:这是一套转基因玉米定性PCR检测方法,具有较高的准确性、可靠性,可以用于转基因玉米种子及其产品的筛查、抽检。     

转基因玉米种子的PCR检测

以PCR技术为基础,建立了检测玉米种子中转基因成分的方法。对提取的基因组DNA进行PCR以扩增玉米内源基因zSSIIb,设计了常见的CaMV 35 S启动子、NOS终止子、Bar终止子、Bt,进行了初步的定性筛选,并用Bt176对阳性结果进行验证,结果表明:这是一套转基因玉米定性PCR检测方法,具有较高的准确性、可靠性,可以用于转基因玉米种子及其产品的筛查、抽检。     

Selection of Homozygous Cotton Lines Transformed with Two Insect-Resistant Genes

A plant expression vector containing a chimeric Bt29K gene coding for the activated Cry1Ac protein and the arrowhead proteinase inhibitior gene API-B were introduced into the cotton cultivar Jihe321 mediated by Agrobactertium tumefaciens. Based on the results of kanamycin resistant testing, PCR detection for both foreign genes and insect bioassay using Heliethis armigera, nine transgenic homozygous cotton lines with insect-resistance of more than 90% and better agronomic traits were bred through six generations from the original transgenic plants. Results from insect bioassay and sequence analysis of the PCR products of plants from some homozygous lines indicated that the chimeric Bt29K gene was stably inherited in these transgenic cotton lines. The main agronomic characters of these homozygous cotton lines, such as boll productivity and fibre strength, were better than that of the original cotton cv. Jihe321.     

转两类抗虫基因棉花优良纯合品系的选育

 用含合成的Cry1Ac杀虫蛋白嵌合基因 (Bt2 9K)及慈菇蛋白酶抑制剂B(API B)基因表达框的双抗虫基因植物表达载体 ,通过根癌农杆菌介导转化棉花生产品种冀合 32 1,获得了一批抗卡那霉素的转化再生植株。在对转化再生植株进行PCR、卡那霉素抗性和抗虫性测定的基础上 ,经 6代筛选培育出棉铃虫抗性 90 %以上且农艺性状优良的 9个转双抗虫基因棉纯合品系。各纯合株系子代植株的抗虫性及部分序列检测结果进一步表明上述Cry1Ac嵌合蛋白基因是能稳定遗传的。这些品系具有很好的农艺性状 ,其结铃性和纤维比强度明显高于转化受体冀合 32 1,这些纯合系可直接用于生产或作为双抗虫棉种质利用。     

玉米基因枪转化Bt基因的研究

以玉米自交系A188为试材,将含有Bar基因和Bt基因的质粒pBW3导入玉米幼胚内,获得了转基因抗性苗。抗性植株点杂交及Southern杂交结果显示,该基因已整合到抗性玉米植株体内,外源基因在玉米基因组内有4个拷贝。     

农杆菌介导甜高粱转Bt cry1Ah的研究

 【目的】建立一套高效、稳定的甜高粱农杆菌遗传转化体系,并在甜高粱中验证来源于苏云金芽胞杆菌新型杀虫基因cry1Ah表达产物的杀虫活性。【方法】以甜高粱幼穗愈伤组织为转化受体,通过农杆菌介导法将密码子优化过的Bt cry1Ah导入2个甜高粱品种“BABUSH”和“MN-3025”中。对获得的再生植株进行PCR检测、RT-PCR分析及除草剂抗性、目的蛋白表达水平和抗虫性鉴定分析。【结果】对336块幼穗愈伤组织块进行了农杆菌侵染,经双丙氨膦（Bialaphos）梯度筛选后共获得66株再生植株,PCR鉴定在8个转化事件中有22株为阳性植株,平均转化率为2.38%。RT-PCR检测结果表明,cry1Ah在T0甜高粱转基因植株中能够正常转录。Western blotting分析和ELISA定量测定显示,有5株可检测到Bt蛋白,但Bt蛋白含量差异较大,最高可达165.69 ng•g-1叶片鲜重（FW）,最低的仅为1.93 ng•g-1叶片鲜重（FW）,平均为87.50 ng•g-1 FW。饲虫试验表明,有2株转基因甜高粱植株对亚洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）表现为抗性。【结论】利用建立的以甜高粱幼穗为外植体的农杆菌遗传转化体系,可获得具有玉米螟抗性的转基因甜高粱植株,其后代遗传稳定性还有待于进一步的研究。     

外源基因在转基因抗虫油菜中的遗传行为

为了选育出稳定的转基因抗虫油菜新品种，采用卡那霉素抗性分析和PCR检测技术对转基因抗虫油菜中Bt杀虫蛋白基因的遗传行进行了研究，连续三代的研究结果表明，Bt杀虫蛋白基因以单拷贝、杂合地整合到转基因植株（T01，T02，T03，T05，T06，T07，T08）的基因组中，并稳定地遗传给后代，纯合转基因株系杂交分析表明，在不同T0转基因植株中Bt杀虫蛋白基因整合位点是不同的，T01和T05或T03和T08的Bt杀虫蛋白若整位点是同源染色体的不同座位，而其他转基因植株的Bt杀虫蛋白若整位点是在非同源染色体上。     

Bt-BADH-GA20ox-rolB多基因在转化烟草中的表达分析

为探讨Bt-BADH-GA20ox-rolB多基因转化烟草中外源基因的表达情况及对转化植株的影响,对转多基因烟草及对照植株进行了生理生化试验,包括内源激素含量测定、耐盐性试验、Bt毒蛋白测定、移栽后植株生长的观测。结果表明：转基因植株生根能力强,根、茎、叶各部位内源激素（IAA、GA3）与对照差异明显;在低浓度NaCl...     

Bt转基因抗虫粳稻品种选育中若干问题研究

以Bt转基因水稻"克螟稻"为供体,与农艺性状优良的粳稻品种杂交,对杂交后代抗虫品种选育中GUS组织染色辅助选择、农艺性状选择对Bt基因纯合影响、混合选择与外源基因传递、及自然抗虫鉴定选择效果等方面作了研究,结果发现采用系谱法并结合GUS组织染色辅助选择的Bt转基因粳稻育种效果为最佳.经8代系谱选择,育成了3 个集高产和抗虫于一体的优良粳稻新品系.     

农杆菌介导法获得籼稻温敏核雄性不育系转Bt基因植株

通过农杆菌介导法将Bt融合型基因cry1Ab/cry1Ac导入籼稻温敏核雄性不育系03B198S和03B199S的愈伤组织,经过多轮潮霉素筛选,获得了一批独立转化体,同时,从每一个独立转化体至少再生出5株绿苗。经PCR、RT-PCR检测证实该Bt融合型基因已整合到部分受体基因组中,并表现出不同程度的表达。这些阳性转基因植株在异地异季低温条件下割蔸栽植,部分恢复可育,且表现出很强的抗螟虫性能。     

转基因改良水稻的抗螟虫性研究

以质粒 pCUSBK -HPT作抗虫基因供体 ,优良籼型恢复系蜀恢 5 2 7为受体 ,采用基因枪转化法 ,获得了转抗虫基因sbk的植株。室内和田间试验发现转基因植株抗虫性得到提高。分子证据表明外源基因在受体植株中的遗传是稳定的。外源基因的转入没有改变受体的优良农艺性状     

应用近等基因系研究Bt基因对水稻性状表现的影响

以密阳46(MY46)为轮回亲本,采取连续回交,结合GUS标记基因辅助选择技术,育成了Bt基因近等基因系抗螟虫密阳46(RIMY46).经考察,RIMY46及其所配杂种Ⅱ32A/RIMY46的GUS反应和PCR检测均为阳性,且高抗螟虫.在早期营养生长阶段,RIMY46苗高比MY46低,分蘖数比MY46少,表明纯合态Bt基因对纯系植株的前期生长进程有一定延缓作用,这种影响随着植株长大而减小,最终除导致抽穗延迟和整精米率降低外,对其余8个农艺性状和9个稻米品质性状的影响则均不显著.比较Bt近等基因系所配杂种Ⅱ32A/RIMY46和Ⅱ32A/MY46有关性状的表现差异,结果则发现杂合态Bt基因对杂种F1性状表达均无明显的负作用.