凤尾菇漆酶性质及应用的研究

液体发酵培养凤尾菇Pleurotus eryngii(凤杰一号),并对该菌株进行漆酶酶学性质和染料脱色的研究。粗酶液经盐析、透析、浓缩初步纯化后,漆酶活力达4.27 U.mL-1。该酶催化ABTS氧化反应的最适pH为4.5,温度为65℃,在60℃以下、pH 4.5~6.0该酶的稳定性最好,以ABTS为底物的km为0.335 mmo.lL-1,Vmax为0.795μmol.L-1.min-1,反应时间4~5 min为佳。该酶在不同底物的作用下,ABTS的氧化能力最强,愈创木酚、氢醌、儿茶酚次之,阿魏酸无氧化能力。叠氮化钠是该漆酶高效抑制剂,浓度为0.5 mmol.L-1使漆酶活性完全抑制。该酶对三苯甲烷染料(孔雀绿、结晶紫)均有降解脱色性能,脱色率分别达到72.3%和50%。但该酶对孔雀绿的脱色能力比结晶紫要好,同时在体系中加入ABTS可提高脱色能力。     

灰树花产漆酶条件优化及对染料脱色的研究

采用LNAS(低氮天冬酰胺-琥珀酸)培养基对灰树花(Grifola frondosa)进行培养,检测不同时间培养液对不同底物的漆酶酶活,作为漆酶的产生及活性测定的主要依据。结果表明,在含Cu2+的培养液中不加底物漆酶最大酶活为235.4 U/L,含Cu2+的培养液添加底物木屑后漆酶最大酶活为458.8 U/L。提取经优化筛选后的培养基培养出的漆酶粗酶液,对4种具有不同化学结构的染料进行脱色试验,结果表明,三苯基甲烷类孔雀绿在6 h时脱色率为86.6%,蒽醌类茜素红在24 h时脱色率为47.6%,偶氮类甲基橙在24 h时脱色率为44%,杂环类中性红在24 h时脱色率为24.2%。由此显示出灰树花漆酶对孔雀绿染料脱色具有较大的应用潜力,进而对废水处理具有更好的应用前景。     

重组血红密孔菌漆酶的纯化、酶学性质及染料脱色研究

为了研究血红密孔菌漆酶重组表达后的酶学性质和染料脱色效果,利用超滤、阴离子交换层析和凝胶层析从毕赤酵母发酵液中纯化出重组漆酶。结果表明:重组漆酶分子质量为62.8 kD,氧化底物2,2′--连氮--二（3--乙基苯并噻唑--6--磺酸）（ABTS）、丁香醛连氮和2,6--二甲氧基苯酚的最适pH分别为2.2、4.2和4.0,动力学常数Km分别为20.73、48.48和1 252.39 μmol/L;该漆酶在有机溶剂中的活性稳定性:甲醇乙醇丙酮二甲基亚砜;在铜离子和铝离子中酶活比较稳定,汞离子对酶活有较强的抑制作用;纯化的重组漆酶在无介体时可有效脱色RB亮蓝,但对靛红和结晶紫的脱色较为缓慢;当添加介体ABTS或紫脲酸时,可在短时间内实现对靛红和结晶紫的脱色,显示出该重组漆酶在染料废水处理中具有较好的应用前景。      

Paraconiothyrium variabile GHJ-4产漆酶发酵培养基优化及酶学性质研究

为了提高木质素降解子囊菌Paraconiothyrium variabile GHJ-4产漆酶的能力,采用响应面分析法优化其产酶培养基。最优的发酵培养基组成为:麸皮30 g·L~(-1),可溶性淀粉58.08 g·L~(-1),牛肉浸膏3.39 g·L~(-1),NaNO_3 1 g·L~(-1),KH_2PO_4 3 g·L~(-1),CuSO_4 0.554 g·L~(-1)。采用该优化培养基,GHJ-4菌株的漆酶酶活达到410.04 U·m L~(-1),比优化前提高9.5倍。以愈创木酚为底物,该菌株纯化漆酶的最适反应温度为50°C,最适反应pH为5.0,米氏常数Km为62.07μmol·L~(-1),最大反应速度Vmax为68.97 mmol·(L·min)-1;该漆酶在55°C以下、pH3.5~6.5的范围内较为稳定,Cu~(2+)、Mg~(2+)、Zn~(2+)对漆酶酶活有明显促进作用,而Hg~(2+)、Fe3+、Ag+对漆酶酶活有显著抑制作用。结果表明,Paraconiothyrium variabile GHJ-4是一株高效的漆酶产生菌株,具有潜在的工业化应用前景。     

漆酶/ABTS介质系统对蒽醌染料的脱色效果

为提高蒽醌类染料废水的脱色率,以红芝(Ganoderma lucidum)发酵所得漆酶粗酶液与ABTS组成漆酶/ABTS介质系统对蒽醌染料活性艳蓝KN-R进行了脱色试验,分别考察不同pH、温度、ABTS加入量、酶加入量、金属离子等条件对活性艳蓝KN-R脱色的影响.结果表明:最优脱色条件为pH4.0,温度30℃,ABTS...     

活性电泳切胶法分离白腐菌(Trametes sp.B1)2种漆酶同工酶及其性质研究

对白腐菌(Trametes sp.)菌株B1的固体发酵粗酶液进行活性电泳后发现含有5种漆酶同工酶。硫酸铵沉淀、离子交换柱层析和Sephadex G100柱层析的收集液中包含有2种带电荷和分子量接近的漆酶同工酶,进一步利用活性电泳切胶法纯化出这2种同工酶,用SDS-PAGE证明为单一漆酶,它们的分子量分别为64 ku(Lac1)和62 ku(Lac2),并对其理化性质进行了研究。Lac1漆酶反应的最适p H值为2.2,最适温度为50℃,氧化ABTS的Km值为1.952 mmol/L;Lac2漆酶反应的最适p H值为2.2,最适温度为40℃,氧化ABTS的Km值为0.255 mmol/L。     

构巢曲霉锰过氧化物酶转化子菌株对6种染料的脱色

为了获得构巢曲霉(Aspergillus nidulans)锰过氧化物酶转化子菌株TN02A7-Lg-mnp2对不同染料的脱色效果。用分光光度法对酶活性检测的丙二酸钠缓冲溶液的pH进行了优化筛选,用单因素和正交试验对产酶条件进行了优化;检测了优化后的酶液对达旦黄、孔雀石绿、中性红、刚果红、曲利本蓝和结晶紫的脱色效果。菌株酶液对偶氮类的达旦黄、三苯基甲烷类的孔雀绿和杂环类的中性红都有显著的脱色效果,在1 h时脱色率分别为达94.41%、91.43%和90.00%,在16 h时脱色率分别为98.36%、100%和96.47%。酶液对双偶氮的刚果红和曲利本蓝也有不错的脱色效果,在16 h的脱色率分别为96.76%和89.39%。对三苯基甲烷类的结晶紫的脱色效果相对较弱,在16 h的脱色率为67.31%。最终结果表明,菌株TN02A7-Lg-mnp2的酶液对多种染料都有很强的脱色能力,在染料废水处理方面具有极强的应用前景。     

芽孢杆菌L4菌株角蛋白酶的酶学性质研究

采用室内实验方法,对芽胞杆菌L_4菌株产生的角蛋白酶进行了系列的酶学性质研究.结果表明,以角蛋白溶液为底物时该酶的最适酶促反应温度为40℃,最适酶促反应pH为7.0,其Km值为1.88 mmol·L~(-1),Vmax为2.72×10~(-2)mmol·L~(-1)·s~(-1).利用不同的蛋白酶抑制剂进行酶活性抑制实验,发现该酶受邻啡罗啉和EDTA的抑制,推测该酶可能是一种含Zn~(2+)的金属蛋白酶.微量元素对该酶活力的影响显著,Ca~(2+)和Mg~(2+)对酶活力有促进作用,高浓度的Fe~(2+)和Cu~(2+)明显抑制角蛋白活力.     

捻转血矛线虫Hc-daf-22基因的原核表达及重组蛋白酶活性测定

【目的】捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)是反刍动物主要的胃肠道线虫之一,该病在中国呈全国性流行。为研究捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)脂肪酸代谢相关蛋白DAF-22的生化特性,对其基因进行了克隆、原核表达,并对重组蛋白进行了体外酶活性测定。以期了解捻转血矛线虫Hc-DAF-22蛋白在过氧化物酶体脂肪酸β氧化中的作用。【方法】根据NCBI公布的H.contortus ZJ株daf-22 cDNA序列(Gen Bank:HQ738470.1)设计特异性引物,克隆Hc-daf-22基因并构建重组质粒pET-22b-Hc-daf-22,经测序鉴定正确后将其转化E.coli BL21,经终浓度为0.1 m mol·L~(-1) IPTG(isopropyl-β-d-thiogalactoside)诱导表达4h,离心菌液,50 mmol·L~(-1)浓度的PBS溶液重悬菌体溶液,冰浴超声破碎后上清沉淀分别进行SDS-PAGE分析。超声破碎后产物以镍柱亲和色谱法分离纯化重组蛋白Hc-DAF-22,并用SDS-PAGE检测蛋白纯化情况及以抗His血清作为一抗Western Blot鉴定。纯化后蛋白用超滤管浓缩除去盐分,并按照蛋白浓度测定试剂盒进行蛋白浓度测定。利用天然状态下的乙酰乙酰CoA(AcAc-CoA)分子会发生酮-烯醇互变形成烯醇化合物特性,酶活试验以乙酰乙酰辅酶a为底物建立标准曲线。硫解酶体外测活体系为(50 mmol·L~(-1) Tris-Cl pH 8.1,20 mmol·L~(-1) MgCl_2,60μmol·L~(-1)CoA,10μmol·L~(-1) AcAc-CoA,加入约0.1μg蛋白),通过记录反应过程中由于底物(AcAc-CoA)的减少而引起303 nm波长下的吸收值的变化,从而计算出硫解反应的初始反应速率,最终确定复性后的Hc-DAF-22的硫解酶活性。在相同条件下,取AcAc-CoA底物浓度为10μmol·L~(-1)的反应体系(50 mmol·L~(-1) Tris-Cl pH 8.1,20 mmol·L~(-1)MgCl_2,60μmol·L~(-1) CoA,10μmol·L~(-1) AcAc-CoA,加入约0.1μg蛋白于室温起始反应),分别调节反应体系的温度及pH梯度,确定Hc-DAF-22最佳酶活反应温度及pH条件。【结果】成功克隆Hc-daf-22基因,测序结果与NCBI已公布的H.contortus ZJ株Hc-daf-22基因序列比对基因相似度为99.9%,并实现重组子pET-22b-Hc-daf-22在E.coli BL21体内进行表达,表达产物经SDS-PAGE和Western Blot检测显示,pET-22b-Hc-daf-22基因在大肠杆菌中成功表达,呈部分可溶性,融合蛋白的分子量约为59 k D,测得蛋白浓度为1.70μg·μL~(-1);针对该表达产物的酶活分析结果表明,原核表达的Hc-DAF-22具有一定的硫解酶活性,其最适反应pH为8.0,最佳反应温度为37℃,酶学常数Km值和Vmax值分别为33.765μmol·L~(-1)和1 784 nmol·L~(-1)·min~(-1)。【结论】捻转血矛线虫DAF-22是过氧化物酶体脂肪酸β氧化的关键酶之一,本试验通过体外酶活试验成功测定Hc-DAF-22蛋白的酶活性,证明Hc-DAF-22具有一定硫解酶活性,但与秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)同源蛋白相比硫解酶活性较低。     

基因工程菌漆酶降解2-氯苯酚的研究

利用基因工程菌甲醇毕赤酵母(PMAD16/pMET(A-Lcc1)培养产生的重组漆酶,研究了重组漆酶对降解2-氯苯酚的影响。结果表明:重组漆酶对2-氯苯酚降解的最佳pH值为6.0,温度为50℃,当溶液中漆酶活力为1.2 U/mL时,在最适脱色条件下作用6 h,粗漆酶和纯化漆酶对2-氯苯酚(250 mg/L)的降解率分别为91.3%和88.2%,重组漆酶可有效地降解2-氯苯酚。     

脱色菌群的富集及其对活性艳红X-3B的脱色效果

通过定向驯化法,从实验室活性污泥处理系统中,富集驯化出对活性艳红X-3B具有良好脱色性能的菌群H1~H5,针对其染料脱色性能进行了一系列研究。结果表明,脱色菌群有一定的耐盐能力,在盐度为15%,染料浓度100 mg·L~(-1)时,24 h后脱色菌群H5的脱色率为86%;脱色菌群H1~H5在低染料浓度下能够快速脱色(600 mg·L~(-1)),在800~1 500 mg·L~(-1)的浓度范围内,经过48 h的培养后,脱色率都能达到95%以上;同时染料浓度为500 mg·L~(-1)时,脱色菌群H5脱色的适宜p H5~11,温度25~37℃,培养时间24 h,脱色率达到90%以上;脱色菌群H5对直接大红4BS和分散艳蓝KN-R有着良好的脱色性能,培养24 h,脱色率达到90%以上。利用扫描电镜观察,发现脱色菌群H5以杆菌为主。基于Illumina Miseq测序平台研究了脱色菌群H5的微生物菌群,发现其中优势菌属为Alcaligenes sp.和Pseudomonas sp.,所占比例分别为55.78%和11.14%。     

高产漆酶菌株Bacillus sp.CLb的筛选及其对染料脱色效果的研究

[目的]为了筛选出一株高产漆酶的菌株。[方法]利用含铜的富集培养基从土壤中筛选出漆酶活性较高的菌株,结合形态学、生理生化特性及16S rDNA序列分析对菌株的分类地位进行鉴定,研究菌株的生长特性及菌株的芽孢漆酶对常用染料的脱色效果。[结果]该菌株属于芽孢杆菌属,命名为Bacillus sp.CLb。菌株CLb最适生长温度为37℃,最适生长pH为7.0,菌株能在含1 mmol/L Cu2+的培养基中生长,具有很强的耐铜性。以丁香醛连氮为底物,测定其芽孢漆酶活性,漆酶活性高达46.1 U/g干重。菌株CLb芽孢漆酶的最适pH为7.0。在介体乙酰丁香酮存在的脱色体系中,菌株CLb芽孢漆酶在4 h内对活性黑以及在2 h内对靛红的脱色率均达到93.0%,在6 h内对活性亮蓝和结晶紫脱色率分别为79.0%和92.5%。[结论]菌株CLb芽孢漆酶在介体乙酰丁香酮存在的体系中对常用染料具有很高的脱色率。     

山麻鸭睾丸和肝脏中N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的分离提取及其性质的比较

山麻鸭的睾丸和肝脏经硫酸铵分级沉淀分离、DEAE-32离子交换柱层析,获得的肝脏N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAGase,EC3.2.1.52)比活力为85.30 U.mg-1,纯化倍数为10.48.睾丸NAGase再进一步通过Sephacryl S-300凝胶过滤纯化,获得的NAGase比活力为5537.00 U.mg-1,纯化倍数为59.20.睾丸NAGase经聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳,出现单一蛋白带,测定等电点pI为5.05.以对硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(pNP-NAG)为底物研究酶催化底物水解的反应动力学.结果表明:山麻鸭睾丸和肝脏NAGase的最适pH分别为5.70和5.60,酶在pH为3.00-8.43时较稳定,而pH>8.43时很快失活;酶的最适温度分别为45和60℃,当温度为80℃时酶完全失活.睾丸NAGase在40℃下处理30 min,酶活力保持稳定;而肝脏NAGase在30℃下处理30 min,酶活力保持稳定,酶催化pNP-NAG水解反应遵循米氏方程,睾丸和肝脏NAGase水解pNP-NAG的Km分别为0.17和0.21 mmol.L-1,Vm分别为8.82和7.25μmol.L-1.min-1,活化能分别为57.57和79.47 kJ.mol-1.     

云芝漆酶对靛蓝废水脱色降解研究

[目的]探讨云芝漆酶对靛蓝废水的脱色净化作用。[方法]首先研究不同温度、pH、靛蓝浓度、HBT添加量、漆酶用量对漆酶/HBT脱色作用的影响,然后分析漆酶和酸性纤维素的酶协同水洗。[结果]当以1-羟基苯并三唑(简称HBT)为介体时,云芝漆酶/HBT对靛蓝作用的动力学参数Km和Vmax分别为0.318 mmol/L和0.035 5 mmol/(L.min)。在温度50℃,pH 4.5,靛蓝浓度100 mg/L,介体HBT用量0.1%,漆酶用量100 IU/L条件下,作用40 min时,靛蓝脱色率高达96.5%。牛仔布生物整理中采用漆酶与酸性纤维素酶协同作用,当漆酶用量为15 000 IU/kg牛仔布时,牛仔布的返沾程度减少85%,同时水洗废水中靛蓝含量减少83.8%。[结论]漆酶在牛仔服的生物整理及染整废水的脱色净化处理中具有良好的应用前景。     

河田鸡与艾维茵肉鸡睾丸N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的特性比较

河田鸡和艾维茵肉鸡的睾丸,经硫酸铵分级沉淀、DEAE-32离子交换柱层析,获得比活力为54.84 U.mg-1,纯化倍数为8.86的河田鸡睾丸N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAGase)制剂.艾维茵肉鸡睾丸NAGase经Sephacry S-300凝胶过滤层析柱进一步纯化,获得比活力为171.50 U.mg-1,纯化倍数为19.8倍的NAGase制剂.以对硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(pNP-NAG)为底物,研究酶催化底物水解的反应动力学.结果表明:河田鸡和艾维茵肉鸡睾丸NAGase的最适pH分别为5.6、5.7,最适温度分别为55、50℃;NAGase分别在pH为3.0-9.2、4.0-9.2及温度为10-60、10-30℃下能保持稳定;NAGase酶促反应动力学均符合米氏双曲线方程,测得米氏常数(Km)分别为0.223、0.319 mmol.L-1,最大反应速度(Vm)分别为9.438、6.238μmol.L-1.m in-1;NAGase催化pNP-NAG反应的活化能分别为85.74、73.47 kJ.mol-1.     

大斑刚毛座腔菌高产漆酶条件的响应面优化及酶学特性

【目的】优化大斑刚毛座腔菌（Setosphaeria turcica）高产漆酶的最佳发酵条件,确定其酶学性质,为进一步开发应用奠定基础。【方法】以大斑刚毛座腔菌为出发菌株,首先采用单因素试验确定影响菌株产漆酶的碳源、氮源及铜离子的种类及范围,并在单因素试验的基础上,以漆酶酶活力为响应值,采用central composite design（CCD）响应面设计试验,利用Design Expert软件对响应值进行3因素3水平下的多元二次回归拟合分析,优化大斑刚毛座腔菌产漆酶的发酵培养基成分;初步分离大斑刚毛座腔菌发酵液中的漆酶,以ABTS为反应底物,设置不同温度及pH,测定漆酶的最适反应温度、pH及热稳定性、pH稳定性,进一步测定其反应动力学常数Km值、Vm值,确定其酶学特性。【结果】建立了以漆酶酶活力为响应值的多元二次回归模型,模型差异显著（P=0.0001）,可以用该模型来拟合试验;响应面分析结果表明,各因素对漆酶活力的影响大小依次为Cu²⁺>葡萄糖>尿素,而葡萄糖和尿素交互作用极显著;通过拟合求出模型极值点,对应的大斑刚毛座腔菌产漆酶的最佳培养条件为：葡萄糖50.05 g?L^-1,KH₂PO₄ 1 g?L^-1,尿素1.46 g?L^-1,MgSO₄ 0.5 g?L^-1,蛋白胨2 g?L^-1,玉米浆0.5 g?L^-1,CuSO₄ 0.07 g?L^-1,Tween80 3 mL?L^-1,28℃,150 r/min振荡培养7 d;在此条件下漆酶活力最高达（40.00±1.20）U?mL^-1。对大斑刚毛座腔菌漆酶发酵液初步分离,经SDS-PAGE检测其漆酶相对分子量约为80 kD;以ABTS为底物时,最适反应温度为50℃,最适pH为4.2,在温度较高且弱酸性条件下活性较高,并且具有良好的温度稳定性和pH稳定性,常温下pH为4.2保持14 h后酶活力基本不变,50℃保温14 h后漆酶活力仍保持在60%以上;进一步在常温、pH为4.2时测定其米氏常数Km值为0.036 mmol?·L^-1,最大反应速率Vm为28.63 mmol?L^-1?min^-1。【结论】利用大斑刚毛座腔菌液体发酵产漆酶并研究其酶学特性,表明作为玉米致病菌的大斑刚毛座腔菌产漆酶具有发酵周期短、活性高、稳定性好等特性,可进一步研究开发应用。     

液相色谱-氢化物发生原子荧光光谱测定鸡肉中 4种形态砷化合物

建立了鸡肉中三价砷(As(Ⅲ))、一甲基砷(MMA)、二甲基砷(DMA)和五价砷(As(Ⅴ))的4种砷形态的高效液相色谱-氢化物发生原子荧光光谱(HPLC-HG-AFS)分析方法。样品采用0.15 mol·L~(-1)稀硝酸+超声波进行提取,以5 mmol·L~(-1) Na_2HPO_4和45 mmol·L~(-1) KH_2PO_4缓冲液(pH5.92)为流动相,经PRP-X100阴离子交换色谱柱分离后,原子荧光光谱测定。结果表明,4种形态的砷在8 min内实现良好分离,标准曲线的线性关系良好(r≥0.999),方法检出限为1.0~3.0mg·L~(-1),6次平行测定的相对标准偏差(RSD)为2.0%~6.2%(100mg·L~(-1))。鸡肉样品的加标回收率为82.1%~101%。     

均匀设计优化猕猴桃SRAP体系

采用均匀设计对影响猕猴桃SRAP-PCR体系的5种因素(Mg2+、dNTPs、引物、Taq DNA聚合酶、模板DNA)进行5因素5水平和5因素3水平的两轮优化,建立猕猴桃SRAP-PCR的最佳体系(25μL):Mg2+2.50 mmol·L-1,dNTPs 0.25 mmol·L-1,引物0.2μmol·L-1,Taq DNA聚合酶1.25 U,模板DNA 150 ng.扩增程序为:94℃预变性5 min;94℃变性1 min,35℃复性1 min,72℃延伸1 min,5个循环;94℃变性1 min,53℃复性1 min,72℃延伸1 min,33个循环,72℃延伸10 min.