差异表达研究方法及其在作物耐旱基因筛选中的应用

抑制性消减杂交（ssn）、cDNA微阵列技术,差异显示PCR（DD-PCR）、代表性差异分析（RDA）、表达序列标签（ESTs）、基因表达连续性分析（SAGE）、cDNA扩增片段长度多态性（cDNA-AFLP）几种技术是目前基因差异表达的主要研究方法。本文分析了各种方法的优缺点,综述了干旱胁迫下玉米、水稻、小麦基因差异表达的研究进展后认为,对干旱胁迫与正常浇水对照的基因差异表达研究,进而分离抗旱基因,是进行作物抗耐旱转基因、创造抗耐旱种质资源,进而选育抗耐旱作物新品种的基础,在基因差异表达研究中,以采用cDNA—AFLP技术为宜。     

一种简易的cDNA-AFLP分析方法

cDNA-AFLP结合了RFLP和RT-PCR的优点,在无需了解序列信息的同时,集中显示基因组表达序列的多态性差异,灵敏性高,重复性好。但实验室开展常规的cDNA-AFLP研究需要昂贵的设备和大量的投入。本试验改用小面积变性聚丙烯胺凝胶电泳检测扩增产物,银染显带法来完成cDNA-AFLP的全套技术体系,便cDNA-AFLP分析方法更为简便、经济并减少污染。     

白菜叶缘裂刻近等基因系的cDNA-AFLP分析及SCAR标记的转化#br#

【目的】寻找与白菜叶缘裂刻发育相关的表达基因,了解叶缘裂刻调控的分子机理。 【方法】应用cDNA-AFLP技术从 mRNA 表达水平研究白菜叶全缘和裂刻近等基因系间基因表达的差异。【结果】共获得 57 条差异片段,合并归属于 55 条非重复序列,其中在叶全缘株系中增强或特异表达的有 25 条,叶裂刻株系中增强或特异表达的有 30 条。54 条差异片段可以在 NCBI 数据库中找到同源序列(包括 EST)、其中42 条为已知基因,1条没有找到同源序列。按照其参与的生物学途径归类,已知基因片段参与了代谢、转录、细胞囊泡运输、蛋白质合成和降解、蛋白质储藏与运输、信号传导、光合系统、基因转座等相关过程。用 AFLP 转化的 SCAR 标记在分离群体上验证结果表明,SEL7B16-SCAR 检测片段的表达模式与 cDNA-AFLP 结果一致。【结论】构建了白菜叶缘裂刻发育调控基因表达谱,识别了与已知NAC036、DP-2、MYB77、TCP24 参与调控裂刻发生基因密切相关的片段。基于cDNA-AFLP特异序列,开发了1条与裂刻紧密连锁的 SCAR 标记,命名为SEL7B16-SCAR,可用于裂叶纯合和杂合的分子辅助选择。     

白菜叶缘裂刻近等基因系的cDNA-AFLP分析及SCAR标记的转化

【目的】寻找与白菜叶缘裂刻发育相关的表达基因,了解叶缘裂刻调控的分子机理。【方法】应用cDNA-AFLP技术从mRNA表达水平研究白菜叶全缘和裂刻近等基因系间基因表达的差异。【结果】共获得57条差异片段,合并归属于55条非重复序列,其中在叶全缘株系中增强或特异表达的有25条,叶裂刻株系中增强或特异表达的有30条。54条差异片段可以在NCBI数据库中找到同源序列(包括EST)、其中42条为已知基因,1条没有找到同源序列。按照其参与的生物学途径归类,已知基因片段参与了代谢、转录、细胞囊泡运输、蛋白质合成和降解、蛋白质储藏与运输、信号传导、光合系统、基因转座等相关过程。用AFLP转化的SCAR标记在分离群体上验证结果表明,SEL7B16-SCAR检测片段的表达模式与cDNA-AFLP结果一致。【结论】构建了白菜叶缘裂刻发育调控基因表达谱,识别了与已知NAC036、DP-2、MYB77、TCP24参与调控裂刻发生基因密切相关的片段。基于cDNA-AFLP特异序列,开发了1条与裂刻紧密连锁的SCAR标记,命名为SEL7B16-SCAR,可用于裂叶纯合和杂合的分子辅助选择。     

cDNA-AFLP技术及在差异表达基因克隆上的应用

cDNA-AFLP技术是在AFLP技术基础上发展起来的主要用于研究基因差异的技术,具有高效可靠的优点,受到研究者的青睐,被广泛应用于包括植物在内的各类生物的基因表达的研究中。简要阐述了cDNA-AFLP技术的原理,重点讨论了操作过程中可能出现的问题和技术关键,并就该技术与其他差异表达技术进行了比较,以说明其在克隆差异表达基因上的优势,还简要列举了一些在抗病育种等领域的应用实例。     

AFLP技术及其在干果遗传育种研究中的应用

AFLP(扩增片段长度多态性)是检测DNA多态性的一种高效的分子标记技术,该技术的运用不需要预知基因组的序列特征,可适用于任何来源和各种复杂度的DNA,兼具RFLP技术的可靠性和RAPD技术的方便性.近年来,AFLP技术已在干果遗传育种研究中得到广泛应用.该文对AFLP技术的基本原理和反应程序进行了介绍,综述了其在干果种质资源研究、遗传图谱构建、基因标记、分子辅助选择、基因表达等方面的应用,并对AFLP技术存在的问题及其在干果遗传育种研究上的应用前景进行了探讨.     

野生绿豆种质资源TC1966抗豆象基因的AFLP标记研究

野生种抗豆象绿豆种质资源TC1966对多个豆象小种均具有很好的抗虫性。通过对抗虫亲本TC1966、感虫亲本绿1号及以中绿1号为轮回亲本经多代回交后获得的3个近等基因系材料进行抗虫鉴定．结果轮回亲本中绿1号的种子被害率〉90％．表现高感（HS）；抗性亲本TC1966及三个高代材料种子被害率〈10％，表现高抗（HR）．说明抗虫亲本TC1966中的抗虫基因呈显性遗传，且能够在后代材料中稳定遗传和表达。本文利用AFLP分子标记技术对该5份试验材料进行了多态性指纹图谱分析．结果从830对AFLP引物组合中筛选出在抗、感虫材料间表现多态性的引物组合100对。将部分多态性AFLP特异扩增条带从聚丙烯酰胺凝胶上回收，然后将二次扩增产物进行测序，并通过同源性序列比较的手段进行了相关生物信息学分析。本研究为今后进一步开展抗豆象基因的AFLP分子标记及其转化研究乃至抗豆象基因的克隆工作提供参考依据。     

DNA分子标记在月季中的应用

遗传标记的发展促进了植物遗传育种的研究,DNA分子标记是继形态标记、细胞学标记、生化标记之后发展起来的一种新的更为理想的遗传标记,它在月季遗传育种研究方面发挥了重要作用。DNA分子标记包括限制性片断长度多态性(RFLP)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、扩增片断长度多态性(AFLP)、简单重复序列(SSR)、单核苷酸多态性(SNP)等。对DNA分子标记的分类、原理、特点及其在月季亲缘关系分析、基因定位、品种鉴定和遗传图谱的构建等方面的研究进行概述。     

乙烯利调控甘蔗基因差异表达研究

【目的】建立并优化乙烯利调控甘蔗基因差异表达的cDNA-AFLP分析体系和银染体系,利用该技术对乙烯利处理的甘蔗进行基因差异表达研究,探讨乙烯利调控甘蔗生长的分子机理。【方法】以甘蔗品种ROC16为材料,在甘蔗生长40 d左右时,叶面喷施200 mg/L乙烯利溶液(对照为清水)0、3、6、12、24、48 h后,分别取甘蔗叶片提取总RNA,建立cDNA-AFLP分析体系和银染体系;利用193对引物组合对乙烯利处理和对照的甘蔗叶片RNA混合池的样品进行差异表达分析,对部分差异转录片段进行回收、克隆、反向Northern杂交验证、序列分析和功能分析等。【结果】经cDNA-AFLP体系反应扩增,乙烯利处理和对照每个样品的扩增条带数均在35～80之间,处理和对照之间条带多态性明显。在反向Northern杂交验证分析中,24个测试样品中有11个无差异,假阳性率高达46%;在乙烯利作用下,甘蔗的CHI、GST、ARP、LHC、核结合蛋白基因以及一批未知基因差异表达,其中CHI、GST、LHC和核结合蛋白基因是与促进植物的抗病抗逆、提高光合作用等密切相关的因子。【结论】cDNA-AFLP技术是研究乙烯利诱导甘蔗相关基因差异表达和调控的一种较有效方法,具有可行性。乙烯利可能是通过调控甘蔗体内GST、CHI、ARP和LHC等基因的表达,从而表现出促进甘蔗生长、提高光合作用、增强抗病抗逆性等生理效应。     

cDNA-AFLP技术及其在基因差异表达中的应用

cDNA-AFLP技术是一种在转录水平上研究基因差异表达的分子生物学实验技术,由于其具有起始材料量少、假阳性低、重现性、灵敏度高且不需预先知晓序列信息等优点,被广泛应用于各类生物差异表达基因的研究。就cDNA-AFLP技术的基本原理、发展历史和技术特点以及在微生物研究尤其是乳酸菌发酵研究中的潜在应用价值进行了综述。     

不结球白菜谷胱甘肽还原酶基因NhccGR1的克隆与表达分析

利用cDNA-AFLP技术,从芜菁花叶病毒(TuMV)侵染的不结球白菜(Brassica campestris ssp.chinensis Makino)幼叶中分离到1条编码谷胱甘肽还原酶的基因片段,通过电子克隆得到其cDNA全长为1 503 bp,编码501个氨基酸,命名为Nhc-cGR1。对该基因进行生物信息学分析,并利用实时定量PCR研究其在TuMV侵染和水杨酸(SA)、茉莉酸(JA)、乙烯(ET)诱导下的表达情况。结果表明:该基因作为病原相关基因参与了TuMV病害响应,并通过增加自身表达量来激活细胞内的信号转导途径,诱导各种防卫反应相关基因的表达;同时,SA和JA抑制该基因的表达,外施ET能诱导其正向表达。     

植物基因工程研究的现状(综述)

本文从目的基因的分离和结构分析、基因载体的开发利用、基因转化途径的发展以及外来基因在植物细胞中的表达等几个方面对植物基因工程的研究概况进行了综合介绍。指出,只有进一步深入研究植物基因的结构和表达,深入研究植物组织培养技术,植物基因工程才可能最终进入实际应用。     

抑制性消减杂交技术及其应用研究进展

抑制性消减杂交(SSH)技术是结合抑制性PCR和消减杂交技术发展起来的一种高效分离差异表达基因的方法,具有特异性高、假阳性率低、操作简便、速度快、效率高等优点。利用SSH技术进行不同状态下基因的表达变化分析、差异基因的克隆和鉴定对了解基因表达调控有着重要意义。为此,综述了SSH技术的原理及其在发育调控基因、疾病发生机制、药物研发、性状筛选及环境生物修复等方面的应用研究进展。     

Establishment of a Gene Expression System in Rice Chloroplast and Obtainment of PPT-Resistant Rice Plants

In contrast to the situation of random integration of foreign genes in nuclear transformation, the introduction of genes via chloroplast genetic engineering is characterized by site-specific pattern via homologous recombination. To establish an expression system for alien genes in rice chloroplast, the intergenic region of ndhF and trnL was selected as target for sitespecific integration of PPT-resistant bar gene in this study. Two DNA fragments suitable for homologous recombination were cloned from rice chloroplast genome DNA using PCR technique, and the chloroplast-specific expression vector pRB was constructed by fusing a modified 16S rRNA gene promoter to bar gene together with terminator ofpsbA gene 3 sequence. Chloroplast transformation was carried out by biolistic bombardment of sterile rice calli with the pRB construct. Subsequently, the regenerated plantlets and seeds of progeny arising from reciprocal cross to the wild-type lines were obtained. Molecular analysis suggested that the bar gene has been integrated into rice chloroplast genome. Genetic analysis revealed that bar gene could be transmitted and expressed normally in chloroplast genome. Thus, the bar gene conferred not only selection pressure for the transformation of rice chloroplast genome, but PPT-resistant trait for rice plants as well. It is suggested that an efficient gene expression system in the rice chloroplast has been established by chloroplast transformation technique.     

分析基因表达谱数据的新方法

Microarraytechniqueprovidesasystem-aticgenome-wideapproachtosolveawiderangeofproblemssuchasgenefunctions,generegulations,andthediseasediagnosesandtreatments.Akeystepintheanalysisofgeneexpressiondataistoidentifybiologicallyrelevantgroupsofgenesortissuesamplesthathavesimilarexpressionpatterns.However,systematicandstochasticfluctuationsareusu-allyinvolvedinmicroarrayexperiments[1],sotherawmeasurementshaveinherent‘noise’withinmicroarrayexperiments.Incurrent,logarithmicratiosareusuallyanalyzeddir…     

抑制性消减杂交技术及其在植物抗病性研究中的应用

在植物的不同生长、发育、繁殖阶段和不同类型细胞中,基因的表达各不相同。近几年发展起来的研究基因差异表达的方法很多,抑制消减杂交（Suppression Subtractive Hybridization）是其中一项基于转录水平,结合消减杂交与 PCR技术的分离差异表达基因的方法,其原理可概括为消减同源序列,富集差异序列。该技术报道于1996年,在一个循环过程中分离差异表达基因尤其是低丰度表达的基因,虽然存在一些缺点,但以其较高的灵敏性、容易操作、假阳性率低、重复性好等优点,在分离及其克隆差异表达基因研究方面得到了广泛的应用。近几年,此技术在植物抗病基因的诱导表达方面已得到了应用,目前大多数研究主要集中在文库构建及筛选等方面。文章对抑制性消减杂交（SSH）技术的原理、优缺点及其在植物抗病性研究机制中应用进展进行了综述。     

水稻叶绿体表达体系的建立及抗PPT叶绿体转化植株的获得

 【目的】建立外源基因在水稻叶绿体中的表达体系。【方法】通过分析已公布的水稻叶绿体基因组全序列及其基因分布特点，选择ndhF与trnL的基因间序列作为除草剂PPT抗性基因bar定点整合的位点。以水稻叶绿体基因组DNA为模板，采用PCR方法克隆了两个适于水稻叶绿体基因组遗传转化的同源片段，构建了含水稻叶绿体16S高效表达启动子、外源基因bar、psbA基因的3′序列（终止子）以及两个同源片段的水稻叶绿体特异表达载体pRB。【结果】采用基因枪法转化水稻品种中花10号幼穗诱导的愈伤组织，并再生植株，获得转化体后代种子。对转化植株进行的分子检测结果表明，外源基因bar 可能被整合到水稻叶绿体基因组中。后代种子的遗传学分析显示，外源基因bar可正常表达并遗传。【结论】利用所建立的水稻叶绿体外源基因表达体系，外源基因bar既可在水稻叶绿体基因组中正常表达，还可作为转化体筛选时的除草剂抗性选择标记。     

基因芯片技术对过铁胁迫条件下酵母硫转运的分析

利用基因芯片技术在转录水平上对过铁胁迫条件下酵母中硫转运体系进行了分析。结果表明,在铁过量的时候,酵母硫转运系统相关基因上调表达。认为酵母在过铁条件下会增加细胞中的硫转运,以便维持细胞的铁稳态,降低过量铁对细胞的毒害作用。     

Programmed gene rearrangements altering gene expression

Programmed gene rearrangements are used in nature to to alter gene copy number (gene amplification and deletion), to create diversity by reassorting gene segments (as in the formation of mammalian immunoglobulin genes), or to control the expression of a set of genes that code for the same function (such as surface antigens). Two major mechanisms for expression control are DNA inversion and DNA transposition. In DNA inversion a DNA segment flips around and is rejoined by site-specific recombination, disconnecting or connecting a gene to sequences required for its expression. In DNA transposition a gene moves into an expression site where it displaces its predecessor by gene conversion. Gene rearrangements altering gene expression have mainly been found in some unicellular organisms. They allow a fraction of the organisms to preadapt to sudden changes in environment, that is, to alter properties such as surface antigens in the absence of an inducing stimulus. The antigenic variation that helps the causative agents of African trypanosomiasis, gonorrhea, and relapsing fever to elude host defense is controlled in this way.     

mRNA差异显示技术的研究进展及其在植物研究中的应用

综述了mRNA差异显示技术的原理、技术路线、优缺点以及差异显示技术的改进过程,并对其在植物发育、植物抗性机理、植物杂种优势机理以及植物激素诱导的基因表达等植物研究领域中的应用作了简要的介绍.