患“红肝病”鳗鲡疱疹病毒的分离和鉴定

利用鳗鲡疱疹病毒(HVA)DNA聚合酶基因引物对患病双色鳗鲡和美洲鳗鲡进行PCR检测(PCR检测结果仅有双色鳗鲡),获得约394bp的目的条带,测序表明扩增出的条带为AHV的DNA聚合酶基因片段,与GeneBank公布的HQ992949、GU233800、FJ940765等6个鳗鲡疱疹病毒基因同源性为100%,与GU205167、AF363783鳗鲡疱疹病毒基因同源性为99%。将患病双色鳗鲡、美洲鳗鲡肝脏和肾脏组织的除菌滤液,接种EPC细胞,细胞7d出现CPE,双色鳗鲡株传代至15代,美洲鳗鲡株传代至5代。     

鳗鲡圆环病毒PCR检测方法的建立及应用

鳗鲡圆环病毒(Eel circovirus,EeCV)是引起鳗鲡病毒性疾病的病原之一。根据GenBank已经发表的EeCV基因序列,设计一对特异性引物,对PCR反应条件优化,进行特异性、敏感性和重复性试验,建立了EeCV的PCR检测方法,并应用该方法对从福建省不同地区采集的160份疑似鳗鲡病毒性疾病病料进行了检测,其中65份表现为阳性,阳性率可达40.6%。结果表明,建立的PCR方法特异性强、敏感度高、重复性好,可以应用于EeCV引起的病害检测。     

鳗鲡疱疹病毒ORF95基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

鳗鲡疱疹病毒(Anguillae herpesvirus,AngHV)是淡水鳗鲡的主要病毒性疾病病原之一。根据鳗鲡疱疹病毒(AngHV-1)的基因组序列(GenBank:NC-013668)设计引物,扩增鳗鲡疱疹病毒福建株(AngHV-FJ)ORF95基因的开放阅读框序列,克隆至pMD19-T载体;经限制性内切酶酶切和测序鉴定,进一步将其克隆至原核表达载体pET-32a,构建了表达质粒32a-ORF95,将其转化表达菌株BL21(DE3),经IPTG诱导,实现了ORF95在大肠杆菌中的高效表达。在0.1mmol.L-1 IPTG、23℃诱导14h的条件下,可溶性ORF95蛋白的表达量较高,经镍柱纯化获得了高纯度的融合蛋白。     

4种鳗鲡同工酶的比较研究

以日本鳗鲡（Anguilla japonica）、澳洲鳗鲡（A．australis）、欧洲鳗鲡（A．anguilla）和美洲鳗鲡（A．rostrata）成体为试验材料,应用垂直聚丙烯酰胺凝胶电泳方法,对4种鳗鲡的眼球、肌肉、肝脏、心脏和。肾脏5种组织的8种同工酶（酯酶EST、乳酸脱氢酶LDH、苹果酸脱氢酶MDH、葡萄糖脱氢酶GCDH、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶G6PD、醇脱氢酶ADH、超氧化物歧化酶SOD和谷氨酸脱氢酶GDH）进行比较研究。结果表明：GDH在5种组织中均没有表达,7种同工酶（EST、LDH、MDH、GCDH、G6PD、ADH、SOD）在4种鳗鲡均表现出很强的组织特异性。4种鳗鲡的同工酶谱表型非常相似,在同一组织中同工酶的存在位点、表达形态、活性等方面是类似的,但也表现出一定的种间差异性。应用酶谱差异指数D对4种鳗鲡进行聚类分析,结果提示日本鳗鲡和澳洲鳗鲡有较近的亲缘关系、而欧洲鳗鲡和美洲鳗鲡有较近的亲缘关系,这与4种鳗鲡的形态特征和生物学特征相吻合。     

鳗鲡幼苗种类的DNA指纹鉴定

养殖鳗鲡种苗来源日趋多样,确定鳗苗种类是决定养殖成败的关键因素之一。应用鳗鲡属鱼类mtDNA COI基因的保守序列设计一对特异性引物,对21批次,共109个白苗期鳗鲡样品进行种类鉴定。结果显示,应用该引物可以在所采集到的鳗鲡样品中扩增出652bp特异性基因片段,将样品COI基因序列与BOLD数据库中鳗鲡COI基因标准序列进行比对,共鉴定得7个种类归属,分别为日本鳗鲡A.japonica、美洲鳗鲡A.rostrata、欧洲鳗鲡A.anguilla、花鳗鲡A.marmorata、莫桑比克鳗鲡A.mossambica、吕宋鳗鲡A.luzonensis和太平洋双色鳗A.bicolor pacifica。对COI基因序列进行聚类分析,得到7个有很高节点支持率的主要类群。结果证实mtDNA COI基因在鳗鲡种类鉴定上具有很好的实用性。此外,在种类的鉴定中发现其中1批次的样品定种错误,有1个批次的鳗鲡样品中存在有2个种类的混杂,提示在实际的苗种养殖及交易中,对鳗鲡的种类鉴定上仍存在一定的错误和混杂,有必要引入DNA分子标记技术进行更加方便和准确的鉴定。     

鳗鲡疱疹病毒FJ株ORF51基因的克隆及生物信息学分析

为了解本课题组分离的鳗鲡疱疹病毒福建株（AngHV-FJ） ORF51的结构特征,扩繁了 AngHV-FJ ,提取其基因组DNA ,经PCR扩增,获得ORF51基因,将其克隆至pMD19-T载体中,进行DNA测序,用生物信息学方法分析AngHV-FJ ORF51基因及其编码蛋白的结构和功能。结果显示,扩增到长约720 bp的ORF51基因序列,其与GeneBank上鳗鲡疱疹病毒欧洲株（AngHV-1） ORF51基因的序列完全一致。该基因编码239个氨基酸;预测ORF51基因编码蛋白的分子量为26107.1 Da ,等电点为7.66,是疏水性蛋白且偏碱性;有4个跨膜域;抗原表位预测显示抗原性较好;结构预测显示,存在1个N-糖基化位点、1个O-糖基化位点、10个磷酸化位点;亚细胞定位预测显示其主要存在于内质网。本研究为解析ORF51的功能及开展AngHV的基因工程疫苗研究奠定了基础。     

bFGF和IGF-1细胞生长因子对欧洲鳗鲡胸鳍传代细胞生长的影响

为建立一种欧洲鳗鲡病毒性疾病分离、鉴定的细胞模型,深入了解鳗鲡病毒性疾病流行与传播的情况,本试验在欧洲鳗鲡胸鳍传代细胞体外培养的最适条件下,通过添加碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和胰岛素样生长因子1(IGF-1)等可能的传代细胞促长因子,并在限定的时间内收集细胞、进行细胞计数、绘制胸鳍细胞的生长曲线,分析其对欧洲鳗鲡胸鳍细胞生长速率的影响。试验结果提示:在10%FBS L-15全价培养基的条件下,bFGF对欧洲胸鳍细胞的生长有明显的促进作用,最佳效应浓度为10μ.L-1;IGF-1(5～50μg.L-1)不利于欧洲鳗鲡胸鳍细胞的生长。     

欧洲鳗鲡与日本鳗鲡的染色体组型比较

采用ＰＨＡ体内注射法,以肾组织为材料,结合扫描电镜研究,对区洲鳗鲡、日本鳗鲡的染色体组进行了比较,结果是：欧洲鳗鲡２ｎ＝３８,中部着丝点染色体为６对,近中部着丝点染色体为３对,端部着丝点染以体为１０对,染色体总臂数（ＮＦ）为５６,ｔ３染爸体上有随体。日本鳗鲡２ｎ＝３８,中部着丝点染色体数为５对,近中部着丝点染色体为５对,端产着丝点染色体为９对,染色体总臂数（ＮＦ）为５８。对欧洲鳗鲡、日本鳗鲡的染色     

澳洲鳗鲡的核型及银染

采用秋水仙素-低渗-空气干燥法、Howell(1980)的方法(银染),以肾细胞作为材料,对澳洲鳗鲡 (Anguilla australis)的核型及银染进行了研究,结果显示:澳洲鳗鲡2n=38,核型公式为2n=16m 4sm 18t,NF =58,其染色体经快速银染后表明,澳洲鳗鲡的sm2其中一条染色体短臂末端出现银染位点。     

创伤弧菌ISCOMs疫苗对欧洲鳗鲡细胞免疫的影响

应用创伤弧菌ISCOMs疫苗对欧洲鳗鲡进行腹腔注射免疫,免疫后35 d进行攻毒试验,结果表明,经免疫的欧洲鳗鲡相对存活率达75%,证实创伤弧菌ISCOMs疫苗具有较好的免疫保护性。对创伤弧菌ISCOM疫苗免疫后的欧洲鳗鲡细胞免疫水平的淋巴细胞进行转化试验,检测结果分析表明,试验组与对照组的淋转指数差异不显著,推测该疫苗诱导的免疫保护方式可能与细胞免疫保护无密切相关性。