抗镉植物内生真菌的筛选及其促生能力研究

筛选具有抗镉促生能力的内生真菌,为植物-微生物联合修复农田镉污染提供优势菌株。分离秦岭铅锌尾矿区内优势植物杠柳(Periploca sepium Bunge)的内生真菌,利用加镉培养基筛选抗镉能力较高的内生真菌,分析其形态学和内转录间隔区基因序列(Internal transcribed sequence, ITS)特征,鉴定其所属菌属,研究其Cd~(2+)去除率及吲哚-3-乙酸(IAA)活性、铁载体活性、胞外过氧化氢酶(CAT)活性和溶磷解钾活性等促生潜力,验证内生真菌对小麦幼苗抗镉能力的提升作用。结果表明:筛选到5株可耐受30 000 mg/L Cd~(2+)的内生真菌,经鉴定,菌株GR1为Talaromyces sp.,菌株GR4为Colletotrichum sp.,菌株GR9为Purpureocillium sp.,而菌株GR7和菌株GR10均为Fusarium sp.。Cd~(2+)含量为1 000 mg/L时,菌株GR7的Cd~(2+)去除率最高。4株菌株有IAA活性,其中菌株GR4的IAA活性最高(99.417 mg/L)。菌株GR7的铁载体活性最高(84.64%)。菌株GR9的胞外CAT活性最高(10.01 U/mL)。菌株GR1发酵液中的有效磷含量最高(201.67 mg/L)。菌株GR4发酵液中的有效钾含量最高(105.11 mg/L)。5株抗镉内生真菌均能显著提高小麦幼苗的耐镉能力,与空白相比,添加GR1发酵液的小麦幼苗株高增加了80.22%,根长增加了61.26%,鲜质量增加了27.66%,干质量增加了60.87%,叶绿素含量增加了28.42%,可溶性糖含量增加了7.83%,可溶性蛋白含量增加了13.28%,整体促进效果较为显著(P0.05)。5株抗镉内生真菌均有抗镉促生潜力,可为农作物-微生物联合修复农田镉污染提供优势菌株,提高农田镉污染修复效率。     

螃蟹脚可培养内生细菌多样性及其促生活性研究

【目的】揭示螃蟹脚可培养内生细菌的多样性及其产IAA、铁载体及解磷、解钾能力,筛选具促生活性菌株,为后续植物内生细菌资源的开发与利用提供一定的基础数据和理论依据。【方法】以寄生植物螃蟹脚为研究材料,采用4种分离方法和5种不同培养基分离其内生细菌,通过16S rRNA基因序列对内生细菌进行鉴定,并构建系统发育进化树确定内生细菌的分类地位;从分离获得的螃蟹脚内生细菌中筛选具有ACC脱氨酶活性菌株,并对含ACC脱氨酶内生菌株的产IAA、铁载体及解磷、解钾能力进行测定。【结果】从螃蟹脚中共分离纯化获得60株内生细菌,通过16SrRNA测序及比对分析,去重复后共获得52株螃蟹脚内生细菌,分属于15科22属,其中以悬浮法（Z法）和纤维素—脯氨酸培养基（4号）的分离效果最佳,分别获得16和17个菌属,且以短小杆菌属（Curtobacterium）为优势菌属,占23.08%。促生能力测定结果表明,12株具ACC脱氨酶活性的内生细菌中7株菌（占58.33%）具有产IAA能力,其中菌株SWFU34产IAA能力最强,为4.95mg/mL;10株菌（占83.33%）具有产铁载体能力;8株菌（占66.67%）具解磷和解钾能力,其中有4株菌株（占33.33%）同时具有产IAA、铁载体及解磷、解钾能力。【结论】螃蟹脚蕴藏着丰富的微生物资源及具促生活性的菌株,其中短小杆菌属为优势菌属,假单胞菌属菌株SWFU34的促生活性最突出,具有农业应用的潜力。     

5株产ACC脱氨酶细菌的筛选与鉴定

【目的】从西北地区旱地小麦根际土壤中筛选产1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)的细菌,为探讨该类细菌在作物上的应用提供理论依据。【方法】通过富集培养,以ACC为惟一氮源进行筛选,从旱地小麦根际土壤中分离产ACC脱氨酶的菌株,并测定其ACC脱氨酶活性。对筛选所获菌株的菌落形态进行观察,并结合生理生化指标和利用16SrDNA构建的系统发育树对分离的菌株进行鉴定。对筛选菌株的潜在促生能力(包括产3-吲哚乙酸(IAA)、铁载体的能力和溶解无机磷的能力)进行了分析。【结果】共分离出5株产ACC脱氨酶菌株,将其分别命名为BL、CL1、CL2、DL和DS;BL、CL1、CL2、DL和DS产生ACC脱氨酶的活性均较高,分别为0.028,0.065,0.068,0.077和0.018U/mg;结合菌落形态、生理生化特征和构建的系统发育树,鉴定BL和DL为阿氏肠杆菌(Enterobacter asburiae),CL1为肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae),CL2为路德维希肠杆菌(Enterobacter ludwigii),DS为非脱羧勒克氏菌(Leclercia adecarboxylata)。5株细菌均能产生一定量的IAA和铁载体,且都具有溶解无机磷的能力。【结论】从旱地小麦根际土壤中分离鉴定出5株产ACC脱氨酶活性较高的细菌,且分离的细菌都具有较高的促生潜力。     

草莓体内高ACC脱氨酶活性菌株的分离及鉴定

[目的]分离草莓体内具有较高ACC脱氨酶活性的菌种,丰富具有果蔬保鲜价值的植物内生菌资源。[方法]采用ADF培养基分离具有ACC脱氨酶活性的细菌,并且用生理生化和分子生物学方法进行鉴定,将具有ACC脱氨酶活性的菌株在草莓中定植。[结果]分离出具有ACC脱氨酶活性的内生细菌23株,其中CJL1菌株的ACC脱氨酶活性最高,比活力达0.142U/mg。CJL1菌株为成团泛菌,能够在草莓体内稳定地定植。[结论]成功地在草莓体内分离得到具有高ACC脱氨酶活性并能定植的成团泛菌。     

小麦内生固氮菌分离及其ACC脱氨酶测定

【目的】了解小麦内生固氮菌数量,筛选具有ACC（1-aminocyclopropane-1-carboxylate, 1-氨基环丙烷-1-羧酸）脱氨酶活性的小麦内生固氮菌,确定筛选菌株的系统发育地位与分类地位,为微生物肥料生产收集菌种资源。【方法】样品表面灭菌后采用无氮培养法筛选内生固氮菌,乙炔还原法测定菌株固氮酶活性;采用ACC唯一氮源法筛选ACC脱氨酶阳性菌,比色法定量测定ACC脱氨酶活性;PCR扩增得到菌株16S rDNA,通过序列测定和相似性分析研究菌株的系统发育;通过形态、生理生化特征和16S rDNA序列比对鉴定菌种。【结果】小麦体内固氮菌数量为（0.2-17.8）×105 cfu•g-1鲜重;分离到小麦内生固氮菌60株,固氮酶活性在1-36 nmol C2H4/h•mg蛋白,其中9株具有ACC脱氨酶活性,活性在0.87-9.32 µmol α-丁酮酸/h•mg蛋白;新分离菌株9136固氮酶活性为1.82 nmol C2H4/h•mg蛋白,ACC脱氨酶活性为9.32 µmol α-丁酮酸/h•mg蛋白,初步鉴定为假单胞菌Pseudomonas sp.。【结论】 田间自然生长的小麦体内有大量固氮菌,数量在105 cfu•g-1鲜重,其中部分菌株具有ACC脱氨酶活性,个别菌株具有较高的ACC脱氨酶活性,可能对作物抵御不良环境具有作用。     

油菜亲和性根际菌株的筛选及其促生效果

【目的】从油菜根际土壤中筛选油菜亲和性根际菌株,以期获得油菜专用优良特异性根际促生菌。【方法】采用常规稀释平板法从油菜根际筛选油菜根际细菌,提取油菜凝集素进行复筛,获得油菜亲和性根际细菌,测定复筛菌株的产铁载体、吲哚乙酸(IAA)能力,以及1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)脱氨酶和溶磷活性,采用盆栽试验评价菌株对油菜的促生效果。【结果】经过复筛获得油菜亲和性根际细菌32株,其中30株菌株具有产铁载体能力,16株菌株的产铁载体能力达到5+水平;29株菌株具有溶磷活性,7株菌株产量达到100.00μg/mL;16株菌株能产IAA,菌株P17的产量最高,达到30.48mg/L;7株菌株具有ACC脱氨酶活性。盆栽试验表明,有25株菌株具有不同程度的促生作用,N10和K6促生作用显著,22株菌株的促生作用达到施全肥水平。【结论】采用凝集素作为筛选工具可以快速获得大量与油菜具有特异亲和性的PGPR菌株,菌株N10和K6作为油菜特异性PGPR具有很大的应用潜力。     

湿地植物节节木贼和条穗苔草根际溶镉微生物筛选及其促生特性研究

从重金属污染区湿地植物节节木贼和条穗苔草根际筛选获得6株耐镉细菌,其中有3株(MT18、MT19和MT20)能够分泌草酸、乙酸和柠檬酸等有机酸,降低溶液p H,具有良好的溶镉和溶磷能力。此3株菌也均能分泌铁载体和IAA,表现出促生潜力,其中MT20分泌铁载体和IAA的能力最强。经16s rDNA鉴定,MT20为肠杆菌属细菌。     

一株协助寄主植物缓解镉胁迫的芽孢杆菌筛选及其耐镉机制

为研究植物内生细菌在缓解寄主植物镉污染中的作用,通过离体条件下耐镉活性鉴定,筛选了5株根围细菌和内生细菌,其中内生细菌菌株1JN2在以辣椒和黄瓜作为寄主进行的盆栽试验中能够增强寄主植物对镉的耐受性,与空白对照(不接种菌株、硫酸镉溶液培养)相比,黄瓜和辣椒叶绿素含量分别增加10.85%、20.14%,根系活力分别增加363.32%、525.51%,组织中镉离子浓度分别降低23.34%、40.39%,在5株细菌中对镉胁迫植物综合保护效果最佳。该菌株经形态学和分子学鉴定为枯草芽孢杆菌。扫描电镜检查发现,1JN2在镉离子处理后24 h开始进行菌体自我复原,在48 h出现胞外多糖固化现象。     

1株具促生作用的氢氧化细菌的分离及鉴定

为了从沙打旺(Astragalus adsurgens Pall.)根际土壤分离具有促生潜力的氢氧化细菌,鉴定其种属并研究其促生机制,利用连续通氢装置分离筛选氢氧化细菌,Salkowski比色法测定产吲哚乙酸(IAA)能力,2,4-二硝基苯肼法测定1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)脱氨酶活性,通用CAS平板法检测铁载体产生,再结合16S r DNA序列分析和生理生化试验结果鉴定细菌种属。结果表明,筛选出1株具有较高促生潜力的氢氧化细菌SDW-16,该菌株具有分泌铁载体的能力,产IAA的量为21.62μg/m L,ACC脱氨酶活性为8 694.55 nmol/(mg·h)。结合生理生化和16S r DNA序列(Gen Bank登录号:KF835389)分析,鉴定其为荧光假单胞菌。菌株SDW-16具有多项促生特征且均高于或达到了其他报道中相关水平,说明菌株SDW-16有较高的促生潜力和研究价值,同时也初步阐明氢氧化细菌的促生机制。在荧光假单胞菌中发现氢氧化细菌尚属首次,丰富了人们对氢氧化细菌分类地位的认识。     

镉耐性固定细菌的筛选及其对不同品种小麦镉吸收的阻控效应

为筛选重金属耐性固定细菌并探索其阻控小麦对重金属的积累效应,从根际土壤筛选镉耐性固定细菌,研究细菌吸附特性以及细菌对两种小麦Cd含量、富集系数和转移系数的影响。结果表明:筛选到一株镉耐性固定细菌菌株YM4,经16S rDNA序列分析鉴定为假单胞菌(Pseudomonas sp.)。YM4能耐受225 mg·L~(-1)高浓度Cd2+,在含50 mg·L~(-1)Cd2+培养基中对Cd的去除率达到58.9%。YM4对Cd的去除以胞外吸附为主。红外光谱分析发现,细胞壁上参与吸附或结合Cd的官能基团主要有─OH、─NH、羧基和磷酸基团等。小麦盆栽试验中,YM4显著降低小麦地上部(茎叶、麦壳)Cd积累量(11.31%～46.05%和10.12%～42.22%),使籽粒Cd积累量明显下降(26.79%～62.24%,红麦;25.27%～28.99%,白麦)。YM4能显著降低两种小麦茎叶、籽粒和麦壳的Cd富集系数以及籽粒的Cd转移系数。研究表明,镉耐性固定细菌Pseudomonas sp. YM4能降低小麦籽粒Cd含量,阻控小麦对Cd的吸收积累,对中轻度Cd污染土壤的粮食安全生产具有潜在应用价值。     

耐铅植物内生菌的筛选及其促生机制研究

为研究植物内生菌提高植物修复重金属污染的效率及机制,本试验以生长于丽水市水阁村重金属污染地区的植物为材料,分离筛选耐铅优势菌株,对其促生特性及影响因素进行检测。试验结果表明,从供试植物中分离筛选出一株耐铅性强的内生细菌GZ01,经鉴定为链球菌属。该菌最高耐受Pb²⁺浓度为700 mg·L^-1,且具有分泌吲哚-3-乙酸(IAA)、产铁载体、溶解难溶性磷及合成1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)脱氨酶等功能。在初始接种量为3%、Pb²⁺浓度为500 mg·L^-1条件下培养5 d,该菌分泌IAA效果最佳;在初始接种量为10%,培养6 d时,该菌溶磷效果最好;在初始接种量为10%、Pb²⁺浓度为200 mg·L^-1的条件下培养6 d,该菌产铁载体效果最佳。回接试验表明,染菌组大豆的株高、鲜重等指标均比对照组高,其体内Pb²⁺含量低于对照组。说明菌株GZ01能通过分泌促生物质,促进宿主植物生长,降低重金属Pb²⁺对植物的毒害作用,可作为内生菌植物联合修复重金属污染的目标菌株。     

不同生长调节剂对东南景天镉积累的影响

为了提高镉(Cd)超积累植物东南景天的植物修复效率,对不同植物生长调节剂调控东南景天Cd积累的作用进行了研究。在水培条件下,采用脱落酸(ABA)、生长素(IAA)、细胞分裂素(6-BA)、乙烯利(ETH)四种生长调节剂对0.1 mmol·L-1Cd处理下的东南景天进行叶面喷施处理,对其生物量、Cd含量、Cd积累量、SOD和POD活性进行了分析。结果表明:ABA处理通过提高地上部生物量和Cd含量、促进Cd向上运输,从而增加东南景天地上部对Cd的积累;IAA处理通过提高生物量、缓解Cd对叶片的毒害,从而增加东南景天地上部对Cd的积累;6-BA处理通过提高东南景天地上部生物量和Cd含量、缓解Cd对叶片的毒害,从而增加东南景天地上部对Cd的积累;ETH处理则通过抑制生长和Cd向上转运进而降低东南景天地上部对Cd的积累。在重金属污染土壤植物修复中,适量施用ABA、IAA、6-BA可提高东南景天对镉污染土壤的修复效率。     

重金属耐性芽孢杆菌的筛选及其对辣椒吸收镉铅的阻控效应

为发掘耐受重金属的微生物资源和高效阻控重金属向蔬菜转移的修复生物材料,从生长于南京某矿区周边菜地的辣椒(Capsicum annuum)和圣女果(Lycopersicon esculentum)根际土壤中筛选耐重金属芽孢杆菌,研究其促生特性和阻控辣椒果实吸收Cd、Pb的作用。本研究筛选到7株耐Cd、Pb并具有分泌胞外多糖、吲哚乙酸和铁载体的芽孢杆菌,分别属于Bacillus megaterium、B.aryabhattai、B.velezensis和Lysinibacillus fusiformis。菌株在24 h时对溶液中Cd的去除率范围为30%~39%,对Pb的去除率在4.3%~25.6%。菌株L11、L15和L44能够显著促进辣椒生长,6株芽孢杆菌能显著降低辣椒果实中Cd和Pb含量。接种菌株B.megaterium L44使辣椒果实中Cd、Pb含量比不接菌对照分别降低39.1%和81.3%,Cd、Pb含量分别降低至0.07 mg·kg~(-1)和0.20 mg·kg~(-1)。研究表明B.megaterium L44是一株能够阻控辣椒果实积累铅镉的植物促生芽孢杆菌,具有阻控蔬菜吸收重金属、用于蔬菜农田安全生产的潜在应用价值。     

耐盐促生菌Agrobacterium sp.DF-2增强黄瓜幼苗耐盐性的研究

本研究从盐碱区域植物根际土壤中筛选到1株具有较高ACC脱氨酶活性[405.17 nmol/(g·h)]的耐盐促生菌Agrobacterium sp.DF-2。除ACC脱氨酶活性外,菌株还具有降解不溶磷活性,产生植物生长激素IAA,产胞外多糖等特性。此外,菌株可耐受最高8%Na Cl浓度胁迫,证明其可应用到盐碱土壤中。通过盆栽试验研究了在75 mmol/L Na Cl盐胁迫下接种DF-2对黄瓜幼苗的生长的影响以及作用机理。结果表明,与盐胁迫处理相比,接种DF-2处理幼苗株高、根长、生物量积累以及叶绿素含量分别显著增加15.08%、34.35%、13.10%和22.58%。同时,DF-2也增强宿主植物对K+的吸收,提高抗氧化酶活性和脯氨酸含量;降低对Na+的吸收和丙二醛含量。菌株DF-2主要通过高效的ACC脱氨酶活性,调控K+/Na+值,增强细胞清除活性氧能力和渗透调节能力等途径增强黄瓜幼苗的耐盐性。因此,耐盐促生菌Agrobacterium sp.DF-2具有作为生物肥料用于盐渍土的潜力。     

镉胁迫对欧洲千里光幼苗生理生化指标的影响

为探明超富集植物欧洲千里光幼苗对镉(Cd)胁迫在生理生化方面的响应,采用人工水培的方式,研究了不同Cd浓度胁迫下,欧洲千里光幼苗(Senecio vulgaris L.)在24~72h的生理生化指标(叶绿素、丙二醛、电解质渗透率、过氧化物酶活性)变化,结果表明:不同浓度的Cd2+(25~75mg·L-1)对幼苗的叶绿素含量、丙二醛(MDA)含量、过氧化物酶(POD)活性均具有显著影响(在75mg·L-1的Cd2+胁迫下,其含量分别达到对照的45.9%,680%和155%)。随着Cd2+浓度的升高,叶绿素含量逐渐下降,MDA含量、POD活性和电解质渗透率则一直随着Cd2+浓度的升高而增大。欧洲千里光对镉具有很强的耐性和积累性,在用于镉污染的土壤修复中具有潜在的应用价值。     

三株茶树根际耐铝细菌的促生性能及Al(Ⅲ)吸附效应

为探索茶树根际细菌的耐铝和有益生物学特性,从铁观音茶树根际土壤中筛选出3株耐铝细菌T3、T6、TJ3,通过检测菌株分泌植物促生物质的能力、平皿促生试验以及Al(Ⅲ)吸附试验,研究了菌株的植物促生特性和对铝离子的吸附效应。结果表明,本研究从铁观音茶树根际土壤中分离出3株耐铝细菌T3、T6、TJ3,3株茶树根际耐铝细菌显示出较好的植物促生性能,ACC脱氨酶活性在0.090~0.196μM/(mg·min),IAA分泌量最高达14.93 mg/L,3株菌均显示出固氮能力,菌株T3、T6具有较高的产铁载体能力和溶磷能力。菌株T6、TJ3对小麦种子胚根、胚轴的伸长具有明显的提高作用,菌株T6对小麦种子的发芽率亦显示出促进作用。Al(Ⅲ)吸附试验表明,菌株T6、TJ3比菌株T3具有更强的Al(Ⅲ)吸附能力,在p H 5.0,温度30℃时,吸附平衡时间约为60 min。16S r DNA分子鉴定显示菌株T3、T6、TJ3分别与Burkholderia anthina、Burkholderia cepacia、Pseudomonas fluorescens具有最大序列相似性。可见,筛选出的3株茶树根际细菌具有明显的植物促生作用和耐铝、吸铝效应,具有较好的应用开发前景。     

耐镉阿氏芽孢杆菌缓解水稻受镉胁迫的研究

为了探究阿氏芽孢杆菌T61缓解水稻受镉胁迫的效应,运用96孔板法、电感耦合等离子体质谱法、比色法测定菌株T61的镉耐受性、镉去除率和植物促生性;利用绿色荧光蛋白标记的T61,观察菌株在水稻上的定殖;利用蘸根法施加T61菌剂,观察其降低水稻籽粒镉积累的效应。结果表明：菌株T61对Cd²⁺的最大耐受浓度达到500 μmol·L^-1;在含镉液体培养基中培养24 h后,菌株T61对Cd²⁺的去除率超过50%。菌株T61可以合成植物促生性物质吲哚乙酸（6.2 μg·mL^-1）和铁载体（46.6 μmol·L^-1）,并具有溶磷能力（37.1 μg·mL^-1）。菌株T61可以在水稻根和茎上定殖。大田条件下,T61菌剂可以降低营养期水稻茎叶丙二醛含量和抗氧化酶活性,并使水稻728B和NX1B籽粒中的镉含量分别降低13.5%和11.2%。研究表明,阿氏芽孢杆菌T61是一株具有植物促生性的耐镉细菌,可以缓解某些水稻品种遭受的镉胁迫,在镉污染稻田的微生物修复方面具有一定的应用前景。     

镉超富集苋菜品种（Amaranthus mangostanus L.）的筛选

 【目的】苋菜在中国的分布很广,品种资源丰富。通过筛选耐镉苋菜品种,发掘镉污染土壤植物修复资源。【方法】采用溶液培养方法,从来自不同生态区域的23个苋菜品种（Amaranthus mangostanus L.）中筛选出具有镉超富集能力的品种;采用赤红壤、黄棕壤、菜园土进行盆栽试验,研究苋菜在土壤Cd浓度分别为5、10、25 mg?kg-1时,对镉污染土壤的修复潜力。【结果】在溶液Cd浓度3 mg?L-1条件下培养,苋菜品种天星米地上部镉含量高达260 mg?kg-1。在土壤Cd浓度 25 mg?kg-1条件下,苋菜天星米地上部镉浓度高达212 mg?kg-1,富集系数达到8.5,地上部净化率达3.8%,各镉处理水平总生物量以及地上部生物量均未显著降低。【结论】苋菜天星米基本具备了镉超富集植物的特征,可用于镉污染土壤的生物修复。     

球形红细菌对镉胁迫下小麦幼苗镉积累的影响

为了研究光合细菌球形红细菌菌悬液对镉胁迫下小麦幼苗镉积累的影响。运用三因素交叉分组随机设计,通过水培试验,研究了球形红细菌菌悬液对小麦幼苗生长过程中培养液Cd2+浓度的影响,以及球形红细菌菌悬液与Cd2+复合处理对小麦幼苗茎叶和根系镉积累量的影响。培养液中Cd2+浓度随培养时间的延长而降低,在小麦幼苗生长初期降低幅度较大;茎叶和根系镉积累量既随培养液Cd2+浓度增加而增加,也随培养时间的延长而增加,在第7~10天镉积累量的增长幅度最大,且根系镉积累量>茎叶镉积累量;施用球形红细菌菌悬液后培养液Cd2+浓度以及小麦幼苗茎叶和根系中镉积累量比对照分别降低了1.9%~49.9%、12.3%~58.1%和8.3%~53.9%。该研究为光合细菌的进一步开发利用提供了理论基础。     

耐镉蜡状芽孢杆菌SY的筛选鉴定及其培养条件优化

从沈阳张士灌区镉污染土壤中筛选出一株对镉吸附性强的耐镉细菌SY,经形态学观察、生理生化测定和16SrDNA序列分析,确定SY为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)。在Cd2+初始浓度为20mg/L条件下,通过改变培养温度、培养时间、pH值、渗透压(NaCl的含量)等条件研究细菌SY吸附镉的最优生长条件。结果表明,最优条件为培养温度40℃,培养时间27h,pH值7,NaCl含量0.5%。