卡拉霉素在转基因黄籽油菜中的应用

为筛选出黄籽油菜遗传转化中卡拉霉素或卡拉霉素(kanamycin,Kan or km)最佳质量浓度,首先将油菜子叶接种在不同质量浓度Kan(0~180mg/L)的分化培养基上,结果发现Kan质量浓度小于60 mg/L有利于绿苗分化.然后在不同质量浓度Kan的分化培养基上对农杆菌侵染的下胚轴进行筛选,结果表明初代培养Kan质量浓度以20~40mg/L为宜,同样质量浓度继代培养后可获得抗性愈伤和转基因阳性苗.最后利用Kan抗性对转基因黄籽油菜后代进行研究,苗期到薹花期生长的植株进行叶片涂抹法筛选,Kan最适质量浓度为4g/L,时间为4~10d;T1代抗性分析、GUS染色分析、T1代籽粒的PCR检测说明转基因在T1代、T2代可遗传并出现分离.β-葡萄糖苷酸酶基因(GUS)和聚合酶链式反应(PCR)验证叶片涂抹进行Kan抗性筛选的方法准确性高,可达100%.     

花粉管通道法转基因棉花后代筛选鉴定

通过对棕色棉BC05叶片进行Kan浓度梯度涂抹实验,确定了Kan涂抹筛选的最佳浓度为3.0 g/L,最佳观察时间为涂抹第5天。对Kan抗性植株进行PCR鉴定表明,Kan涂抹筛选可基本准确的鉴别出转基因材料与非转基因材料,但目标基因是否成功整合还必须进行PCR鉴定,田间卡那霉素筛选结合PCR分子鉴定是转基因棉花后代大规模群体筛选的有效方法。     

大白菜转基因选择剂卡那霉素的浓度筛选

卡那霉素(Kan)抗性基因的利用是筛选和鉴定转基因植株的有效方法。试验利用不同浓度的Kan作为转基因选择剂,对2个大白菜品系7#和9#的幼苗进行处理,以确定筛选的最佳浓度。结果显示,随着Kan浓度的升高,2个品系的幼苗均表现出子叶黄化率升高、下胚轴变短、鲜质量降低的趋势,且2个品系大白菜幼苗对Kan的敏感性略有不同,7#大白菜的最佳筛选质量浓度为150~175 mg/L,而9#则为200 mg/L。研究结果可为大白菜遗传转化及阳性后代的筛选鉴定奠定基础。     

卡那霉素筛选小麦转基因后代方法的优化

[目的]优化卡那霉素筛选小麦转基因后代的方法。[方法]以普通去离子水和0.5×Hoangland营养液为卡那霉素(Kan)的溶解介质,对Kan的浓度进行多梯度筛选,确定Kan的最低有效浓度,并针对不同小麦基因型材料进行验证。[结果]0.5×Hoangland营养液是Kan的理想溶解介质,既降低了Kan对小麦幼苗生长的抑制作用,又提高了Kan的筛选效果。30 mg/L是Kan作用于小麦NC221的最低有效浓度。不同小麦基因型对Kan的敏感性稍有不同,对大多数小麦基因型来说,Kan的最低有效浓度为30~45 mg/L,即在该浓度范围内进行处理可除去90%的未转基因植株。[结论]0.5×Hoangland营养液作溶解介质时,Kan用于筛选小麦转基因后代的最低有效浓度为30~45 mg/L。     

转基因水稻后代的遗传分析

对转基因植株T0代种子进行发芽试验以及对T1代植株叶片进行浸泡试验,以研究转基因植株后代的遗传及表达情况.结果表明,转基因植株T0代种子在含50mg·L-1潮霉素的培养基上正常发芽生长,而对照虽能发芽,但最终枯黄死亡;T1代植株叶片在100 mg·L-1潮霉素溶液中浸泡3 d后,部分叶片变黄,部分叶片仍为绿色,统计分析表明,转基因植株外源片段为单拷贝整合;对潮霉素浸泡后的植株的PCR分析表明,潮霉素浸泡对后代的遗传分析是行之有效的.     

卡那霉素叶片涂抹法田间筛选转基因苜蓿的研究

以田间生长的苜蓿为材料进行卡那霉素(Kan)涂抹叶片筛选转基因植株最佳浓度和适宜观察时间的研究,并对筛选的抗性植株进行了PCR检测验证.结果表明,Kan叶片涂抹田间筛选的最佳浓度为1000 mg/L,观察时间以12天为宜;经PCR检测验证,Kan筛选抗性苗的阳性检测率达到93.8%.研究建立了一种在田间对转基因苜蓿进行大量筛选的简便方法,对于转基因苜蓿材料的选育具有重要利用价值.     

番茄遗传转化与筛选鉴定的改进研究

将At-pri-miR828基因的过表达载体pC2300-pOT2-At-pri-miR828通过农杆菌侵染法转入番茄(Solanum lycopersicum L.)品种‘Ailsa Craig’为例,来对番茄的遗传转化过程中番茄种子消毒处理、无菌苗培养、转基因阳性植株的Kan筛选浓度、PCR检测等方法进行研究,旨在探索一套快速高效的番茄遗传转化及鉴定方法。研究发现:采用C_2H_5OH、Na_3PO_3及NaClO分别浸泡及无菌水反复冲洗的种子消毒方法,可使污染率减少到5%以下;种子震荡培养法可以提高发芽率并促进种苗的生长势一致;筛选转基因阳性植株的Kan最佳质量浓度为100mg·L~(-1);100mg·L~(-1)的Kan溶液浇灌蛭石和在MS培养基中添加Kan的方法都可以用来筛选转基因番茄。最终Kan筛选和PCR检测等鉴定方法显示番茄的遗传转化效率为32.5%。     

转Chi-Glu基因野罂粟植株卡那霉素筛选技术

为探索卡那霉素(Kan)抗性筛选在转基因野罂粟上的应用,以含有几丁质酶(Chi)和β-1,3-葡聚糖酶(Glu)的双价基因的T0代转基因野罂粟种子为试验材料,进行卡那霉素叶喷、叶片涂抹试验,筛选卡那霉素的最佳浓度;对T1代转基因植株进行卡那霉素筛选,并用PCR检验其阳性植株。结果表明:培养皿幼苗最佳叶喷浓度为50 mg/L;土培苗最佳叶喷和涂抹浓度为6.5g/L,连续叶喷或涂抹5d,每天1次。经卡那霉素筛选共获得12株转基因野罂粟植株,通过PCR检测,有4个株系已将Chi-Glu双价抗病基因整合进野罂粟的基因组中。     

PAP基因cDNA克隆及烟草转基因研究

以美洲商陆(Phytolacca americanaL.)为材料,利用RT-PCR方法克隆商陆抗病毒蛋白(PAP)的cDNA,并构建双元植物表达载体pBinARpap.用捕获该质粒的根癌农杆菌菌株LBA4404与烟草叶片外植体共培养,并在附加30 mg.L-1Kan的MS 0.1 mg.L-1IAA 1.5 mg.L-1BA的培养基上诱导植株分化,再生芽在附加30 mg.L-1Kan的MS培养基上生根,实现再生植株.Kan阳性植株经PCR-Sourthern检测筛选,得到PCR阳性植株,证明异源PAP基因在烟草基因组中的整合;经过RT-PCR检测,证明PAP基因在RNA转录水平上有表达;攻毒试验表明,转基因烟草植株对供试病毒TMV具有明显抗性.     

水稻新型核转化筛选标记基因的鉴定及应用

将人工合成的来自Escherichia coli的dsdA基因与来自Schizosaccharomyces pombe的dao1基因,通过农杆菌侵染方式转化到水稻中花11中。对转化植株进行分子生物学检测表明,目的基因整合到了水稻核基因组中,其中获得转化dsdA的单拷贝植株7个,转化dao1的单拷贝植株6个。通过对单拷贝转基因家系表达量检测及T0代种子萌发测验发现,dao1基因在2个(编号6,7)转基因家系中表达量显著,T0代种子在含D-Ala的培养基上,具有明显抗性。dsdA基因在所有的转基因家系中表达量相对偏低,在含D-Ser的培养基上,T0代种子有一定抗性。     

基于真空渗入法的转基因大白菜植株的获得

采用真空渗入法,将萝卜VPE1基因的干扰载体pRNAi-RsVPE1转入大白菜中,共收获2 414粒种子,在质量浓度为30mg/L的卡那霉素筛选下获得抗性株297株,其中9株经PCR检测呈阳性,转化率为0.37%。Real-time PCR检测结果表明,pRNAi-RsVPE1的转入导致转基因大白菜叶片中同源的BraVPE在RNA水平上的表达量下降,验证了转基因植株的可靠性,为进一步深入研究BraVPE基因功能奠定了基础。     

卡那霉素筛选转基因小麦种子关键技术研究

对影响小麦卡那霉素筛选效果的培养基质和药剂处理方式进行了比较研究.结果表明:在种子吸胀阶段进行充分有效的卡那霉素浸种处理是提高卡那霉素筛选效果的关键技术;种子不经卡那霉素溶液浸种吸胀而直接在蛭石基质上,或用水浸种吸胀后再在蛭石等培养基质上进行卡那霉素处理,会降低小麦卡那霉素抗性筛选的效果.小麦种子幼苗的卡那霉素筛选,可用100 mg/L卡那霉素浸种至露白后再放到装有蛭石的培养皿上浇水即可,不需要再浇卡那霉素溶液.     

利用农杆菌浸种法建立白三叶草遗传转化体系的研究

以白三叶萌动种子作为转化受体,利用npt-Ⅱ筛选基因对影响农杆菌介导的遗传转化外部因素进行深入     

转Bt基因棉抗卡那霉素与抗虫性比较分析

以常规棉和转基因抗虫棉及其杂交、回交后代为材料,对卡那霉素抗性与测虫鉴定结果进行比较。结果表明,两者鉴定结果一致性达96%以上,卡那霉素可以用于转基因抗虫棉鉴定,但抗虫材料的最终鉴定仍需用测虫结果来表示抗虫性。     

外源基因在不结球白菜转基因植株后代中的表达

应用农杆菌介导法将含有豇豆胰蛋白酶抑制剂基因和新霉素磷酸转移酶基因的重组质粒导入不结球白菜地方品种———“中脚黑叶”和“矮脚黑叶”中 ,获得抗虫转基因植株。卡那霉素抗性和抗虫性在转基因植株自交后代T1代植株中发生分离 ;在T2 代中出现 3种不同类型的株系 :抗性纯合、杂合型和敏感性纯合株系。卡那霉素抗性和抗虫性在转基因植株自交后代中的表现基本符合孟德尔显性单基因的分离规律。从T2 、T3 、T4代中选择出抗虫性纯合株系 ,并获得一批对 1～ 2龄鳞翅目小菜蛾、斜纹夜蛾幼虫的校正死亡率达 6 0 %左右的单株     

转蚕丝芯蛋白基因获得高强纤维棉花植株

采用花粉管通道技术,将棉纤维细胞特异表达启动子(E6)驱动的蚕丝芯蛋白基因导入陆地棉品种"泗棉3号"。共注射600朵花,收获497粒种子。通过GUS报告基因组化检测筛选,获得5株GUS阳性棉株。又经卡那霉素涂叶法鉴定,其中4株具有良好的卡那霉素抗性。用依据E6启动子序列和蚕丝芯蛋白基因序列设计的两对引物,对这5株棉花进行PCR扩增,获得1株转蚕丝芯蛋白基因棉株。纤维品质测定结果表明,这株转蚕丝芯蛋白基因棉花T1代纤维比强度达到34.6cN/tex,比对照"泗棉3号"(比强度为28.6cN/tex)提高了21.0%,T2代纤维比强度比对照平均增高23.3%。     

CYP86MF反义基因转化获得青花菜雄性不育植株

 通过根癌农杆菌LBA4404（含质粒反义CYP86MF基因片段）介导转化青花菜（Brassica oleracea L.var. italica Plenck）下胚轴，经卡那霉素选择压下连续选择、扩繁和生根培养，获得了青花菜转基因植株。经PCR、Southern blot、Northern blot检测证明，CYP86MF基因已经整合至转基因植株染色体中。经花器官观察，转基因植株中有雄蕊发育不良、花粉不萌发的植株。转基因植株自交不能结实，用转基因植株花粉对正常植株进行人工授粉，不能正常结实，表明转基因植株花粉是不育的。用正常花粉对转基因不育植株进行人工授粉，转基因不育植株能正常结实，表明转基因不育植株的雌性器官发育正常，其不育性与CYP86MF基因在转基因植株中的表达有关。     

卡那霉素对盐芥生长的影响

[目的]研究不同浓度的卡那霉素对盐芥生长的影响。[方法]选用盐芥山东生态型的种子,种于含不同浓度卡那霉素的Ms0培养基上,观察盐芥对不同浓度卡那霉素的敏感程度。[结果]随着卡那霉素浓度的增加,盐芥的生长受到不同程度的抑制。[结论]卡那霉素可以作为一种筛选标记对转基因盐芥进行筛选。     

转基因黄瓜主要农艺性状观察及其种子抗性研究

通过对转基因黄瓜和非转基因黄瓜田间农艺性状的观察,转基因黄瓜的T1代植株与对照亲本在主要农艺性状上没有差异。不同转基因株系自交后的T1代种子对除草剂BASTA的抗性各不相同,但远远高于对照。经过除草剂处理后的抗性种芽的叶绿素含量显著高于非抗性种芽,而非抗性种芽的可溶性蛋白总量和可溶性糖总量则因受除草剂的毒害生长缓慢而高于抗性芽,这也反证了转基因抗除草剂种子的生长。     

陆地棉GhBI-1基因在拟南芥中的异位表达及耐盐性研究

前期工作中,我们从陆地棉基因组中分离了GhBI-1基因全长cDNA,构建了GhBI-1过量表达载体并转化拟南芥。本研究在此基础上,利用卡那初步筛选获得转基因拟南芥,通过PCR进一步验证,得到具有卡那抗性并且遗传稳定的T3代纯合株系。利用不同浓度NaCl处理野生型和转GhBI-1基因拟南芥,结果表明,转基因拟南芥在200 mmol/L NaCl胁迫后,萌发率和生长情况要好于野生型拟南芥,过量表达GhBI-1基因能够提高拟南芥耐受盐胁迫的能力。