柑橘叶片蛋白质高效提取与溃疡病PthA蛋白Western blot分析

利用三氯乙酸-丙酮法、Tris-HCl提取法、改良的PBS法对柑橘叶片进行蛋白质提取比较研究, 发现改良的PBS法提取蛋白质，不仅提取效率高, 质量好，浓度高，而且杂质干扰较少, 技术操作简单。通过研究确定了一套适用于柑橘叶片蛋白质的提取、定量、凝胶制备、电泳、转膜、封闭、抗体孵育以及显色的Western blot方法。 利用这一方法对转pthA-nls基因的糖橙、转pthA-nls基因的冰糖橙叶片蛋白质进行了研究，发现与抗柑橘溃疡病相关的蛋白PthA在48 kD成功表达。     

用于蛋白质组分析的两种马铃薯块茎蛋白质提取方法的比较

【目的】进行两种提取方法下马铃薯块茎蛋白质组结果差异分析,并确定最佳马铃薯块茎蛋白质提取方法.【方法】采用酚提取法和三氯乙酸/丙酮沉淀与乙酸铵/甲醇沉淀相结合的两步沉淀法提取马铃薯块茎蛋白质,进行2-DE分离,对差异表达蛋白质进行MALDI-TOF-MS质谱鉴定.【结果】两步沉淀法提取的马铃薯块茎蛋白质较酚提取法获得蛋白质纯度和浓度及蛋白质点数目均明显增加,双向电泳凝胶图谱分辨率较高.质谱鉴定结果表明,两步沉淀法中鉴定的差异表达蛋白质丰度均显著高于酚提取法,并鉴定到一些新出现的蛋白质包括假定的线粒体NAD依赖的苹果酸脱氢酶、酸性磷酸酶类似物和蛋白酶抑制剂II前体类型B.【结论】提取马铃薯块茎蛋白质时两步沉淀法优于酚提取法.     

改良一步法提取植物RNA、DNA和蛋白质的研究

[目的]利用改良的一步法提取植物RNA、DNA和蛋白质。[方法]采用CTAB试剂对Biozol抽提法进行改良,用一步法分别对玉米（Zea maysL.）、大豆（Glycine maxL.）、苜蓿（Medicago sativaL.）和黄瓜（Cucumis sativusL.）4种作物根的RNA、DNA和蛋白质进行共提取,并对其HO-1和CDPK1基因及HO-1蛋白进行鉴定。[结果]经紫外分光光度计测定和琼脂糖凝胶电泳分析证明获得的RNA和DNA样品纯度较高;HO-1基因和CDPK1基因的RT-PCR结果呈阳性;所提取的蛋白质也可用于Western blot分析;整个提取过程只需3h。[结论]该方法实用性较强,具有广泛的应用价值。     

SCMRP基因原核表达及多克隆抗体制备

SCMRP基因是根据大豆密码子偏向性,采用生物信息学方法对玉米胚乳蛋白基因(MRZP)进行改造并合成的新基因,是适合在大豆中高效表达的高含硫氨基酸基因,可用于豆科作物的品质改良。将新合成的SCMRP基因构建到含有6×His标签序列的原核表达载体pET-32b上,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株中,SDS-PAGE和Western blot分析表明:经IPTG诱导,转化的大肠杆菌BL21(DE3)菌株中能正常表达出约20ku的目标蛋白质,IPTG最佳诱导表达时间是6h,融合蛋白质以可溶组分形式存在。菌体总蛋白经金属鳌合层析纯化后免疫新西兰大耳兔,制备兔抗血清,经Western blot和琼脂板双向扩散试验表明,已纯化出SCMRP-6×His融合蛋白质,成功制备出SCMRP兔多克隆抗体,抗血清效价达到1:256。上述结果表明,新合成的SCMRP基因是能够在生物体中正常表达的完整基因,制备的SCMRP兔多克隆抗体可用于转SCMRP基因植物蛋白质表达分析。研究结果将为通过转基因技术改良豆科植物含硫氨基酸品质奠定重要基础。     

改良一步法提取植物RNA·DNA和蛋白质的研究

[目的]利用改良的一步法提取植物RNA、DNA和蛋白质。[方法]采用CTAB试剂对Biozol抽提法进行改良,用一步法分别对玉米（Zea mays L.）、大豆（Glycine max L.）、苜蓿（Medicago sativa L.）和黄瓜（Cucumis sativus L.）4种作物根的RNA、DNA和蛋白质进行共提取,并对其HO-1和CDPK1基因及HO-1蛋白质进行鉴定。[结果]经紫外分光光度计测定和琼脂糖凝胶电泳分析证明获得的RNA和DNA样品纯度较高;HO-1和CDPK1基因的RT-PCR结果呈阳性;所提取的蛋白质也可用于Western blot分析;整个提取过程只需3h。[结论]该方法实用性较强,具有广泛的应用价值。     

捻转血矛线虫H11基因在巴斯德毕赤酵母中的表达

将捻转血矛线虫H11基因亚克隆到酵母表达载体pPICZαB后,用氯化锂法转化巴斯德毕赤酵母菌株X-33,通过含ZeocineTM抗生素的YPD平板筛选出72个重组子.重组酵母用甲醇诱导后,经RT-PCR、SDS-PAGE和Western blot检测,结果表明捻转血矛线虫H11在巴斯德毕赤酵母中实现了表达.     

橡胶树树皮总蛋白的提取方法比较

巴西橡胶树(Hevea brasiliensis Muell.)是重要热带经济作物,其主要经济价值来源于其树皮组织中的乳管细胞所合成的天然橡胶。研究橡胶树树皮及乳管中的蛋白质表达及功能是了解天然橡胶生物合成及调控的重要方法。然而由于橡胶树树皮中次生代谢物丰富,树皮木栓化严重,总蛋白提取难度较高,目前尚未见有成熟的橡胶树树皮总蛋白提取方法的相关报道。比较TCA/丙酮沉淀法、TCA/丙酮—双乙法和TCA/丙酮-TrisHCl法等3种橡胶树树皮总蛋白提取方法,比较其提取蛋白浓度、蛋白质提取操作步骤及试剂用量,探索出一种简单高效的橡胶树树皮蛋白质提取方法;并通过蛋白质浓度测定、聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)效果分析以及内参蛋白tubulin的Western blot分析验证提取效果。结果表明,TCA/丙酮-Tris-HCl法比传统的TCA/丙酮法提取效率更高,得到的蛋白量更多,且条带清晰,适用于SDS-PAGE,Western blot等后续蛋白分析实验。     

金心黄杨(Euonymus japonica L. cv. aureo-pictus)叶片总蛋白质提取及双向电泳技术

通过比较2种不同的植物叶片总蛋白质提取方法(三氯乙酸/丙酮法和酚法)和优化双向电泳各试验环节,建立金心黄杨叶片总蛋白质的提取方法,以及可以对其蛋白质组进行质谱分析的双向电泳条件。结果采用优化后的酚法进行金心黄杨叶片总蛋白质的提取,IEF蛋白上样量150μg,SDS-PAGE采用12.5%T凝胶,电泳结束后用考马斯亮蓝G-250染色,Melanie 7.0软件分析后得到约274个可分辨蛋白点。     

金心黄杨（Euanymus japonica L. cv. aureopictus ）叶片总蛋白质提取及双向电泳技术

通过比较2种不同的植物叶片总蛋白质提取方法（三氯乙酸／丙酮法和酚法）和优化双向电泳各试验环节,建立金心黄杨叶片总蛋白质的提取方法,以及可以对其蛋白质组进行质谱分析的双向电泳条件。结果采用优化后的酚法进行金心黄杨叶片总蛋白质的提取,IEF蛋白上样量150μg,SDS-PAGE采用12．5％T凝胶,电泳结束后用考马斯亮蓝G-250染色,Melanie 7．0软件分析后得到约274个可分辨蛋白点。     

鹅掌楸愈伤蛋白质组的样品比较

为建立适合鹅掌楸胚性愈伤大规模蛋白质组研究,比较分析4种蛋白质提取方案:Mg/NP-40-三氯乙酸(简称TCA)/丙酮、TCA/丙酮、裂解液-Clean-up、裂解液-TCA/丙酮,并进行蛋白质的聚丙烯酰腚凝胶电泳(简称SDS-PAGE)和双向电泳分析。SDS-PAGE图谱显示:裂解液-Clean-up、裂解液-TCA/丙酮法分离高分子量蛋白质条带相对于Mg/NP-40-TCA/丙酮、TCA/丙酮法少;Mg/NP-40-TCA/丙酮法和裂解液-Clean up法低分子量提取、分离效果较差。在SDS-PAGE基础上对Mg/NP-40-TCA/丙酮、TCA/丙酮法提取蛋白质样品进行双向电泳,结果表明:TCA/丙酮法得到的凝胶图蛋白质点分布均匀、背景清晰且纵横条纹较少,且TCA/丙酮法相对于Mg/NP-40-TCA/丙酮法来说在小分子量蛋白质、碱性蛋白质分离方面有优势。同时随机选取双向电泳分离的蛋白质进行质谱分析,结果显示,TCA/丙酮法较适合鹅掌楸胚性愈伤蛋白质组的大规模分析。     

柑橘黄龙病入侵与疫情扩散模型研究

 为了提示柑橘黄龙病入侵发病扩散规律,评估防控成效,有效控制疫情,2002—2007年在柑橘黄龙病初发生区采用设立自然条件、治虫防病和综合防控三处理类型,监测柑橘黄龙病发生扩散动态,结合面上疫情普查资料,创建柑橘黄龙病自然条件下、治虫防病条件下以及综合防控条件下的疫情扩散模型,分别为：P₁=12.9690N₁-18.10（n=6,r=0.9945**）或P₁=0.2293N12+11.135N₁-14.89（n=6,r=0.9948**）,P₂=7.8857N₂-10.2667（n=6,r=0.9675**）或P2=1.4107N²₂-1.9893N2+2.90（n=7,r=0.9996**）和P3=-0.1398x N₃²+1.1248N3-1.141(n=6,r=0.8396*),结果表明柑橘黄龙病在自然条件下从发病到毁园需要9a时间,单一治虫防病措施难以达到持续控制效果,只有采取综合防控措施,才能达到可持续控制,保障柑橘优势产业持续健康发展。     

胡柚上柑橘衰退病毒的分子检测

胡柚是我国东部地区重要的柑桔栽培品种.近年来,一种以叶片黄化为主要症状的新病害在胡柚种植区暴发流行.通过血清学和分子生物学检测,研究首次从黄化的胡柚叶片中检测到柑橘衰退病毒.系统进化分析表明,分离的CTV CS-7分离物与P09.18、NZRB-TH30等分离物具有较近的进化关系,而与T30等强毒株系有较大的遗传距离,...     

感染柑橘速衰病毒的墨西哥酸橙病株中病程相关蛋白的检测(英文)

应用改进的十二烷基硫酸钠 -聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS- PAGE)方法从感染柑橘速衰病毒 (CTV)强株系和弱株系的墨西哥酸橙病株中检测到一种相对分子质量约为 130 0 0的特异蛋白 ,而在健株中未能检测到 ,该蛋白电泳谱带没有差异 .应用 Western印迹技术进一步分析表明 ,这种蛋白不与 CTV特异的多克隆抗体10 52和 3DF1单克隆抗体反应 .这暗示着该蛋白是墨西哥酸橙在 CTV侵染胁迫条件下编码产生的一种病程相关蛋白 .研究结果也表明 ,应用 SDS- PAGE方法检测这一特异蛋白 ,可作为诊断墨西哥酸橙植株感染 CTV的一种有效的分子生物学辅助检测方法     

中国野生柑橘上衰退病毒分离株分子特征分析

 【目的】了解中国野生柑橘上携带柑橘衰退病毒（CTV）分离株的CP/HinfⅠRFLP组群构成和分子特征。【方法】运用RT-PCR对采自中国云南、广西、四川、湖南、江西等省11个野生柑橘上CTV分离株的病毒衣壳蛋白基因(CPG)进行扩增，利用RFLP和SSCP对CPG进行分析，并将测定的CPG序列进行同源性比较和聚类分析。【结果】发现野生柑橘上11个CTV分离株以单一组群感染为主；这些CTV分离株CPG的核苷酸序列和相应的氨基酸序列同源性分别为92.5％～99.5％和95.0％～100％；与GenBank收录的9个全基因组CTV分离株的相应基因序列进行聚类分析，其核苷酸序列和氨基酸序列同源性分别为92.1％～98.8％和94.6％～100％。【结论】序列同源性比较说明CTV CPG具有高度保守性，同时系统进化分析表明收集到的野生CTV分离株与国外分离株分属5大类群，具有较复杂的亲缘关系。     

柑橘新品种金峡桃叶橙区域试验

桃叶橙[Citrus sinensis(L.)Osbeck cv.Taoyecheng]原产秭归县屈原镇龙马溪村,品质优良,被誉为"峡橙三秀"之一。然而,随着1990年脐橙产业发展壮大以来,桃叶橙种植面积逐渐萎缩,同时由于栽培品种混杂,品质性状表现参差不齐,阻碍了桃叶橙产业的稳定发展。为了复兴桃叶橙产业,推广地方特色品种,优化柑橘品种结构,项目组自2009年以来一直开展桃叶橙的提纯选优工作,通过长期调查搜集、品质测定和分子鉴定,最终筛选出果大、少核、高糖低酸的金峡桃叶橙(C.sinensis cv.Jinxia Taoyecheng),并在秭归县和武汉市开展了区域试验,旨在为桃叶橙新品种选育及桃叶橙产业的复兴奠定基础。     

Phylogenetic Analysis of Citrus tristeza virus Isolates of Wild Type Citrus in China

The genetic variation and phylogenetic relationships of Citrus tristeza virus （CTV） isolates collected from Chinese wild type citrus were analyzed by comparing the sequences of nine genomic regions （p23, p20, p13, p18, p25, p27, POL, HEL and k17） with the CTV isolates of cultivated citrus from different countries. The results showed that the divergence pattern of genomic RNA of the CTV isolates from wild type citrus was similar to that of other isolates from cultivated citrus, the 3′ proximal region was relatively conserved, and the 5′ proximal region had greater variability. The nine genomic regions of CTV isolates analyzed were found to have been under purifying selection in the evolution process. Phylogenetic analysis showed that the eleven Chinese wild CTV isolates were located at different clades and did not relfect their geographical origins, suggesting genetic diversity among the Chinese wild CTV populations. These results will aid in the understanding of molecular evolution of the Chinese CTV populations.     

柑桔锈螨种群密度简易估计法

本文根据Gerrard阈限密度法,对57组调查资料进行分析,建立了锈螨的经济预测模型: m=1.7479[-1n(1-P)]~(1.3994)式中m为虫口密度,P为有虫叶率。     

柑橘溃疡病相关基因CsPGIP的克隆与表达

【目的】克隆CsPGIP并分析其表达特性,转化柑橘得到超表达转基因株系,并进行柑橘溃疡病抗性评价,为柑橘溃疡病分子育种提供理论依据。【方法】从晚锦橙和四季橘中克隆柑橘CsPGIP,使用MEGA6进行多序列比对并构建系统发育树;采用在线软件BaCelLo和SignalP 4.0进行亚细胞定位和信号肽预测并用GFP瞬时表达确定CsPGIP在细胞内的定位;利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）比较接种溃疡病菌前后高感品种和高抗品种中柑橘CsPGIP的表达特性,分析溃疡病菌侵染与CsPGIP表达的相关性;农杆菌介导遗传转化晚锦橙,采用GUS染色初筛、PCR鉴定和qRT-PCR相结合的方法鉴定超表达转基因株系;观察转基因和野生型株系表型变化,分析其株高、叶片表型;离体针刺法对超表达转基因株系和野生型株系进行柑橘溃疡病抗性评价,统计病斑面积和病情指数,分析CsPGIP表达对柑橘抗、感溃疡病的影响。【结果】晚锦橙和四季橘CsPGIP均编码328个氨基酸,与已报道的柑橘中的PGIP同源性高达99.39%,都包含2个PGIP基因典型的LRR结构域（LRR_1和LRR_2）;构建系统进化树发现甜橙中的CsPGIP与葡萄中的PGIP（GSVIVT01033370001）遗传距离最近,相似度达到62.97%,推测CsPGIP与葡萄中的PGIP具有类似的抗病效果。亚细胞定位和信号肽预测结果表明CsPGIP属于分泌蛋白,GFP洋葱瞬时表达证明柑橘CsPGIP定位在细胞膜和细胞壁,与预测结果一致。高感品种晚锦橙和高抗品种四季橘接种溃疡病菌后CsPGIP的表达特性不同,在高感品种中表达显著下调,而高抗品种中表达显著上调且维持在较高水平,推测CsPGIP与柑橘溃疡病的抗性相关。构建CsPGIP超表达载体并转化晚锦橙,通过PCR鉴定和qRT-PCR确定其中9个（OE1、OE3、OE4、OE5、OE6、OE9、OE10、OE12和OE14）为CsPGIP超表达阳性株系。通过对转基因株系的表型观察发现OE3、OE14株系表型与野生型株系相比差异明显,植株表现为较矮小,其中OE14出现叶片卷曲、增厚的表型变化。对CsPGIP超表达转基因株系（8个株系）进行离体抗溃疡病评价,结果显示超表达转基因株系可以使柑橘溃疡病病斑面积降至野生型的24.11%—83.88%,其中OE1株系的病斑面积最小;从病情指数来看,除OE3株系外,其余株系的病情指数均比野生型显著下降（为野生型的23.12%—75.49%）,其中OE1下降最显著,综上结果可知超表达CsPGIP可以有效抑制柑橘溃疡病菌的生长。【结论】CsPGIP是柑橘响应溃疡病菌侵染的重要基因,可抑制或减轻柑橘溃疡病的发病程度,在柑橘抗溃疡病机理研究方面具有较大的应用价值,也可作为柑橘抗溃疡病分子育种的一个候选基因。     

柑橘类果汁的脱苦

介绍了柑橘类果汁的几种主要脱苦方法,并对今后柑橘类果汁的脱苦方法进行了展望。