D-对羟基苯海因的细胞催化水解工艺优化

从菌中的酶含量和酶活力两方面对微生物酶催化水解的最佳条件进行了探究。结果显示,通过对试验菌种生长曲线的测定,发现该菌在22 h之内为对数期,22~36 h为稳定期,36 h后进入衰退期。在此基础上检测前期诱导培养的菌种内的酶含量为3.6%,然后对该菌破胞后的酶粗提物和不破胞的菌体(全细胞)进行了不同温度和p H值梯度下的水解情况对比,得到两者酶活力最高时的最佳温度和p H值,前者最佳温度为40℃,p H值为8,后者则最佳温度为40℃,p H值为6。最后通过对比得出,酶粗提物的水解效果比全细胞的更佳。     

乳糖诱导酸性木聚糖酶基因在大肠杆菌中的表达

[目的]以融合酸性木聚糖酶基因的大肠杆菌（E．coli）B121（DE3）为研究对象,研究以乳糖作为诱导剂时重组目的产物的表达规律。[方法]以重组木聚糖酶比酶活为评价指标,利用单因素试验和k（3。）正交试验考察摇瓶发酵条件下诱导剂浓度、诱导时机、诱导培养时间和诱导培养温度对木聚糖酶表达的影响。[结果]各因素影响程度依次为：诱导时机〉诱导温度〉诱导时间〉诱导剂浓度;最优表达条件为：诱导剂浓度5∥L、诱导时机0．5h、诱导培养时间4．5h、诱导培养温度32℃;在此工艺条件下,重组木聚糖酶比酶活可达49．69U／mg。[结论]乳糖作为诱导剂能够成功诱导酸性木聚糖酶在大肠杆菌中的表达。     

恶臭假单胞菌诱变与底物类似物抗性筛选

提高海因酶产生菌株的活力，能为β-内酰胺类抗生素的重要中间体D-对羟基苯甘氨酸的生产带来应用价值，对产海因酶的恶臭假单胞菌MZ-4S-0315进行紫外、微波诱变处理，在加有适量底物类似物5-FU的选择培养基上进行筛选．结果表明：经测定的140株菌株，其海因酶活力大部分比原菌株产酶能力有所提高；其中在微波（800w,2450Hz）40s诱变条件下筛选到一株产酶活力比原菌株提高2．44倍的菌株ZF-109．该方法比以往化学试剂结合的诱变操作简单，危害性小，特别是筛选速度有了极大提高．     

酶促水解蔗糖生产果葡糖浆新工艺

以黑赤曲霉（Asp.niger－W1）为出发菌，经紫外诱变、亚硝基胍处理获得—蔗糖酶高产菌（Asp．niger－W3）。经固态发酵培养获得高活力蔗糖酶。该酶在50－55℃有较高活力，在pH5．5－6．0范围内有较高稳定性。该菌种选育成功，可为果葡糖浆生产提供了一种简易制备方法。     

镰刀菌产纤维素酶液体发酵工艺研究

以镰刀菌为对象,对其产羧甲基纤维素酶（CMCase）的液体发酵工艺进行研究,结果表明：稻草秸秆粉末为最佳碳源,NaNO3为最佳氮源,且碳源∶氮源（C∶N）为6∶1时酶活力最大;不同的无机盐对产酶有一定的影响,AlCl3具有一定的促进作用,而CuSO4.5H2O和AgNO3则有明显的抑制作用;表面活性剂吐温-80在低浓度（0.04%）下对产酶有促进作用。同时考察了装液量、发酵液初始pH、接种量、菌龄、发酵温度及发酵时间对产酶的影响,确定适宜的培养条件为：75 mL/250 mL,初始pH7,接种量10%,菌龄42 h,发酵温度及发酵时间分别为30℃和96 h。通过正交试验确定的最佳发酵条件为：接种量9%,菌龄42 h,发酵时间108 h,发酵温度32℃。     

重组毕赤酵母摇瓶发酵产木聚糖酶条件优化

[目的]在摇瓶发酵条件下,研究甲醇诱导毕赤酵母工程菌K3产木聚糖酶表达规律。[方法]以重组木聚糖酶酶活为评价指标,采用单因素试验和L9（34）正交试验考察摇瓶发酵条件下pH值、接种时间、诱导剂浓度、诱导时间对酶活的影响。[结果]各因素影响程度依次为：pH值〉接种时间〉诱导时间〉甲醇浓度,最优表达条件为：pH值5.3,接种时间19h,甲醇诱导浓度1.25%,诱导时间192h,在此条件下菌株产酶酶活可达589.16IU/ml。[结论]该研究为木聚糖酶的工业化生产和应用提供依据。     

体外定向诱导小鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞

[目的]分离和克隆小鼠骨髓间充质干细胞,并诱导分化为神经元样细胞。[方法]利用Percoll密度梯度离心的方法进行小鼠骨髓间充质干细胞分离及培养,分别采用β-巯基乙醇和BHA诱导分化为神经元样细胞。用神经元特异性烯醇化酶和神经纤维丝蛋白免疫细胞化学方法对已分化的神经元样细胞进行鉴定和分化率分析。[结果]经2种诱导剂诱导的小鼠骨髓间充质干细胞均出现神经元样细胞的分化,胞体呈神经元状,伸出较长轴突样和树突样突起且有分支。而且免疫细胞化学鉴定显示,诱导分化后的神经元样细胞神经元特异性烯醇化酶染色和神经纤维丝蛋白免疫细胞化学染色均呈阳性,β-巯基乙醇诱导分化细胞表达NSE的阳性率为（86.8±2.7）%;诱导分化细胞表达Neurofilament200 kD的阳性率为（75.2±2.3）%;BHA诱导分化细胞表达NSE的阳性率为（80.5±2.2）%;诱导分化细胞表达Neurofilament200 kD的阳性率为（73.2±1.6）%。[结论]小鼠骨髓间充质干细胞能够在诱导剂β-巯基乙醇和BNA的诱导下体外诱导分化为神经元样细胞。     

粗状假丝酵母产酶能力及发酵条件的优化

对一株产脂肪酶粗状假丝酵母(ACCC20231)产酶特性进行了研究.结果表明,在培养基初始pH值6.0、30℃下培养31 h该菌出现最高酶活.对其发酵培养基成分进行优化,确定最适培养基组成为麦芽粉2%,蛋白胨1%,(NH4)2SO4 0.1%,MgSO4 0.5%,以1%棉子油作为诱导剂,优化后该菌株产酶能力明显提高,达6.2 U·mL-1.     

诱导剂对乳白耙齿菌产MnP活性影响研究

为显著提高白腐菌(Irpex lacteus)产锰过氧化物酶(MnP)的活性。在液体培养条件下用分光光度计法检测12种诱导剂对乳白耙齿菌MnP活性的诱导效果。其中化学诱导剂包括愈创木酚、苯酚、香兰素、藜芦醇、苯甲酸、没食子酸、酪氨酸、二甲苯、苯胺蓝和ABTS,生物诱导剂包括麦麸和木屑。乳白耙齿菌在28℃下分别加入12种诱导剂进行培养,得到了不同时间的培养液,然后检测培养液中Mn P活性,从而得到乳白耙齿菌产MnP活性与诱导剂之间的关系。在初始培养基中加入0.2 mmol/L Mn~(2+)的培养条件下,诱导剂麦麸和ABTS对Mn P的诱导效果极为明显,二者在添加量分别为1.5%和0.2 mmol/L时,MnP活力分别为104.2 U/L和145.2 U/L,是初始产酶培养基酶活的8.6倍和11倍;而两种诱导剂组合,即同时添加1.5%麦麸与0.2 mmol/L ABTS,MnP活力为203.2 U/L,是初始培养条件MnP活性的21.9倍,实验表明诱导剂麦麸和ABTS能大幅度地提高白腐菌产MnP的活性。     

玉米秸秆低温高效降解复合菌系GF-20的菌种组成及降解稳定性

【目的】探索不同温度及pH条件对玉米秸秆低温高效降解复合菌系的玉米秸秆分解稳定性及菌群结构稳定性的影响,完善菌系培养方法,促进其应用开发利用。【方法】以低温高效降解复合菌系GF-20为研究对象,在10℃条件下连续继代培养45代、不同温度和pH条件下连续继代培养15代,分别获得多组不同代数（F）、不同温度（T）和pH（P）条件下的菌系。测定各复合菌系发酵液pH、玉米秸秆降解率及纤维素酶活,评价复合菌系的玉米秸秆分解稳定性;利用PCR-DGGE技术结合主成分分析法对菌群组成结构的稳定性进行研究。【结果】在10℃条件下经连续继代培养40代和在温度4-30℃、pH 6.0-9.0条件下继代培养获得的不同复合菌系发酵液pH均随发酵时间的延长趋近中性;玉米秸秆降解率在27.59%-32.53%,除F40显著高于F5外,其余无显著差异;纤维素酶活性呈高代菌系大于低代菌系,温度4-10℃和pH 6.0-9.0条件下,对复合菌系产酶有促进作用,纤维素酶活为1.34-1.84 IU·mL^-1;复合菌系的纤维素酶在较低的温度和较宽的pH范围内具有良好的温度和pH稳定性,酶促反应温度15-30℃和pH 4.0-9.0内仍保持80%以上的纤维素酶活力;复合菌系F5-F45、T4-T30和P6.0-P9.0的DGGE条带差异不显著,表明菌系的菌种组成稳定;而在偏酸（pH=4、5）和偏碱性（pH=10）条件下继代培养,复合菌系秸秆降解率和纤维素酶活均显著降低,菌种组成发生变化,进而影响性质与功能稳定性。PCR-DGGE共检测到18个条带,其中关键菌株分别为Bacillus licheniformis、Azonexus hydrophilusd、Azospira oryzae、Arobacter cloacae、Cellvibrio mixtus、Bacillus tequilensis、Clostridium populeti subsp. Mixtus和Clostridium xylanolyticum。【结论】复合菌系GF-20在温度4-30℃、pH 6.0-9.0条件下经过多代继代培养,仍然保持了较高的玉米秸秆分解活性和菌种组成稳定性,具有良好的应用前景。     

不同施肥处理对盆栽辣椒土壤酶活性及土壤微生物含量的影响

【目的】 研究氨基酸液体有机肥替代部分化肥施用后土酶活性、微生物含量的变化。【方法】 采用盆栽试验,选择2个不同品种的辣椒各设置6组处理,分别为处理CK（不施用氨基酸液体有机肥,化肥100%）,T₁（氮肥减量30%+氨基酸液体有机肥）、T₂（氮肥减量35%+氨基酸液体有机肥）、T₃（氮肥减量40%+氨基酸液体有机肥）、T₄（氮肥减量45%+氨基酸液体有机肥）和T₅（氮肥减量50%+氨基酸液体有机肥）,研究不同梯度的氮肥减施并配施氨基酸液体有机肥后对土壤生物学性状及养分含量的影响,分析其相关性。【结果】 氨基酸液体有机肥替代不同比例的化肥后,2个品种的辣椒均显示土壤脲酶活性、过氧化氢酶活性、脱氢酶活性增强,酶活性显示出先升高后变平缓或减低的趋势,酶活性会随着有机肥替代量不是成正比的关系;提高土壤细菌、放线菌的含量,抑制真菌含量;氨基酸液体有机肥替代的处理较CK对于土壤pH这项指标均表现出增高,但增高不显著。【结论】 氮肥减施并配施氨基酸液体有机化可以为有机肥缓解土壤酸化、降低EC值,T₄的替代量为最佳替代量。     

一株嗜热纤维素酶生产菌的分离、鉴定及酶学研究

[目的]对一株嗜热纤维素酶生产菌进行分离、鉴定及酶学研究。[方法]从草堆下土壤中分离筛选得到一株纤维素酶生产菌,根据形态观察和16S rRNA序列分析对其进行鉴定,并对该菌的产酶条件和酶的稳定性进行研究。[结果]将分离得到的菌株命名为BSC6-1,并确定该菌可能属于芽孢杆菌(Bacillus sp.)的一个新亚种。该菌的最佳发酵培养基为1%CMC-Na,0.2%K2HPO4,0.05%MgSO4·7H2O,1%蛋白胨,0.002%CaCl2,0.000 4%FeSO4,pH 7.0。在接种量为7%的条件下,55℃培养5 d后,该菌产酶量达最高,羧甲基纤维素酶活(CMCA)与滤纸酶活(FPA)分别达10.25和8.90 U/ml。该纤维素酶的最佳酶促反应条件为55℃、pH 7.0。在温度低于70℃的条件下,该酶的相对酶活力保持在73%以上,证明该酶具有热稳定性;在pH 6.5~8.0范围内,该酶的相对酶活力保持在90%以上。[结论]该研究为BSC6-1菌株在纤维素资源方面的开发和利用提供了理论和技术基础。     

理化因素对白芸豆凝集素生物学活性影响

[目的]研究物理与化学因子对白芸豆凝集素生物学活性的影响,为白芸豆凝集素开发利用奠定理论基础和提供技术参考.[方法]白芸豆（Phaseolus vulgarisL）种子经硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose离子交换和Sephadex G-100凝胶柱层析得到凝集素（PVL）;然后以不同温度和pH梯度、不同金属离子、不同变性剂处理样品,通过倍比稀释法测定凝集素的生物学活性.[结果]白芸豆凝集素能使兔血红细胞发生凝集,在20～70℃红细胞凝集活性不受影响,当温度达到80℃时凝集素样品仅有25％凝血活性,85℃加热30 min凝血活性全部消失.用EDTA溶液处理后,白芸豆凝集素失去凝血活性,金属离子Mg2＋和K＋能恢复凝血活性,Mn2＋能完全恢复凝血活性,Ba2＋、Cu2＋、Fe3＋、Ca2＋不能使凝血活性恢复.白芸豆凝集素在缓冲液pH低于4.0时凝血活性逐步降低,在pH 3.0时,活性仅有45％;在缓冲液pH高于7.2时活性逐步降低,pH 9.0时凝血活性仅有44％.3种变性剂变性试验中,脲能使凝集素凝血活性降低70％,盐酸胍能降低30％,SDS能降低18％.[结论]白芸豆凝集素具很强的热稳定性和广谱酸碱度适应能力;凝血活性依赖Mn2＋等金属离子,且仅能被变性剂6 mol/L脲部分抑制.在实际应用中,可根据适宜条件控制其物理和化学因素,防止凝集素变性失活.     

强还原土壤灭菌处理对人参连作土壤细菌群落结构及土壤酶活的影响

强还原土壤灭菌（reductive soil disinfestation,RSD）和土壤熏蒸（soil fumigation,SF）是缓解人参连作障碍的常用方法。为研究2种方法对土壤细菌群落和土壤酶活性的影响,采用高通量测序技术和化学分析方法对强还原土壤灭菌加氯化苦熏蒸（RSD+SF）、强还原土壤灭菌加复合菌（RSD+F）、氯化苦熏蒸加复合菌（SF+F）3种方式改良的土壤细菌群落和土壤酶活性进行分析。结果表明,RSD+F组细菌群落多样性与丰富度均最高,SF+F组均最低,3组拥有相同细菌菌属431个。RSD+SF组中,丰富度最高的细菌为Gemmatimonas,其丰富度为9.17%;RSD+F组中丰富度最高的细菌为norank_f_noranko_Gaiellales,其丰富度为8.72%;RSD+F组中丰富度最高的细菌为Bacillus,其丰富度为9.16%;Bacillus为3种方式改良土壤前10种优势菌群中共有的优势菌群。土壤酶活性与土壤细菌群落结构存在显著性关系,随着生长时间的增加,不同方式改良后的连作人参土壤酶活性均具有显著性差异（P<0.05）。由此可知,3种土壤改良方式均能在不同程度地增加有益细菌属的丰富度并提高土壤酶活性,其中RSD+SF组和RSD+F组的有益细菌属数量及土壤酶活性均高于SF+F组。     

pH对日本沼虾耗氧率及鳃组织CAT、SOD活力的影响

在水温24.0±0.2℃条件下,采用静水停食法开展了pH对日本沼虾存活、耗氧率及鳃组织CAT、SOD活力的影响实验。结果表明：（1）日本沼虾对碱性环境的耐受性略强于酸性环境,其pH耐受范围为5.5～8.5,该范围内日本沼虾组内耗氧率均呈夜均显著高于昼均（P〈0.05）,组间昼均和夜均耗氧率均无显著差异（P〉0.05）,且鳃组织SOD、CAT活力均呈先降后升走势;（2）日本沼虾pH适宜范围为6.5～8.5,该范围内日本沼虾鳃组织SOD低谷期均比pH 5.5实验组后延24 h,各观测时段CAT活力均显著低于pH 5.5实验组（P〈0.05）;（3）日本沼虾pH最适宜区间为6.5～8.5的中央区域,本研究所设实验梯度中pH 7.5实验组日本沼虾鳃组织SOD、CAT活力最为稳定。     

低温胁迫对ICE1转基因水稻苗期抗氧化系统的影响

试验以水稻垦鉴稻10号及其转ICE1（Inducer of CBF expression 1）基因水稻T2-9株系为实验材料,低温（0℃）处理水稻幼苗0-10 d,测定抗氧化酶（SOD、CAT、POD、GR和APX）活性。试验结果表明,常温下,转基因植株抗氧化酶活性与对照没有显著差异;经低温胁迫后,转基因水稻和非转基因水稻的抗氧化酶活性在变化幅度方面有明显的差异。冷处理12h后,除POD外非转基因水稻的抗氧化酶活性开始下降,而转基因水稻酶活性仍继续升高;SOD、CAT、APX和GR活性分别在冷处理2、4、4、6 d达到最大值。与非转基因水稻相比,低温胁迫过程中转基因水稻POD活性没有明显变化。非转基因水稻POD活性水平则明显升高,在冷处理2天时达到最大值,是同处理时期转基因水稻POD活性的2.1倍。     

奶牛胎衣不下与血浆GPX、CAT活性的相关研究

为了阐明奶牛分娩前抗氧化系统变化规律与胎衣不下的关系,以荷斯坦奶牛为研究对象,筛选165头妊娠期各项指标正常的奶牛,于分娩前1周静脉采血及测定血浆中谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）、过氧化氢酶（CAT）含量,并按照胎衣不下的标准（产后胎衣12h内不能正常排出）进行分组对比分析。结果表明：筛选的165头奶牛有19头在产后表现为胎衣不下,发病率为11.5%;胎衣不下奶牛血浆GPX活性（104.00±80.19U/mL）显著低于正常奶牛（134.82±71.34U/mL,P〈0.05）,CAT活性（1.44±1.08U/mL）也低于正常奶牛（1.63±1.74U/mL,P〉0.05）。说明奶牛血浆中GPX、CAT活性与产后胎衣不下存在必然联系。     

Bipolaris australiensis HD-1胆红素氧化酶纯化、鉴定及其酶学性质

[目的]为了获得B.bipolaris HD-1胆红素氧化酶纯品,确定酶的同源性及其常规酶学性质.[方法]将B.bipolaris HD-1发酵液依次通过硫酸铵盐析、阴离子交换层析和凝胶过滤层析确定蛋白的纯度、浓度和酶活力;通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）法获得氨基酸序列,并利用Mascot软件在NCBI蛋白库中的比对,以确定同源蛋白来源;用SDS-PAGE方法测其表观分子量;用等电聚焦方法测定等电点;用Linwerver-Burk双倒数作图法测定米氏常数;并对该酶的酶学性质进行了常规的测定.[结果]获得具有胆红素氧化酶酶活性的电泳纯单体蛋白,酶活为46 000 U/L,比活为1.15 U/mg;MALDI-TOF共获得135个氨基酸,该蛋白与来源于Hel-minthosporium tritici-vulgaris的漆酶前体蛋白序列同源性达100％;蛋白的表观分子量为68 kDa;pI为4.1;它对ABTS和胆红素的米氏常数分别为Km（ABTS） =1.8×10-5 mol/L（pH 3.0）和Km（bilirnbin）=2.7×10-5 mol/L（pH 7.5）;对胆红素的最适催化活性为36℃,酶在-40℃下可保持2年,酶活保持在90％以上,在pH 8 ～9.5下可保持相当高的催化胆红素活性,能够耐受高浓度的硝酸钠和尿素,低浓度的叠氮化钠对酶活有促进作用而高浓度则抑制,对氯化钠、溶解氧敏感.[结论]该蛋白具有典型的胆红素氧化酶特性,又存在明显的不同.     

模拟酸雨与凋落物对柳杉幼苗根际土壤酶活性的影响

为了探讨酸雨和凋落物对柳杉Cryptomeria fortunei林地土壤酶活性的影响,以柳杉幼苗根际土壤为材料,采用酸雨(pH 4.0),凋落物(500 g·m-2)和酸雨与凋落物复合等3种处理,测定了短时间(30 d)和长时间(90 d)处理后土壤氧化还原酶和水解酶活性的变化。结果表明:酸雨和凋落物处理对土壤氧化还原酶活性具有不同的影响,酸雨对土壤硝酸还原酶活性无显著影响,凋落物极显著地提高其酶活性,复合处理极显著地降低其酶活性(P<0.01);3种处理均显著提高了土壤多酚氧化酶活性(P<0.05);复合处理对土壤过氧化物酶活性无显著影响,短时间酸雨和凋落物处理均对其具有抑制作用,长时间处理具有促进作用(P<0.05);凋落物处理对土壤过氧化氢酶活性表现为抑制作用,复合处理对其具有极显著促进作用(P<0.01)。在水解酶中,短时间3种处理和长时间复合处理均对土壤脲酶活性具有极显著促进作用(P<0.01);酸雨、长时间凋落物和复合处理对土壤酸性磷酸酶活性具有显著地抑制作用(P<0.05);酸雨和凋落物处理以及长时间复合处理均使土壤蛋白酶活性降低(P<0.05);长时间酸雨处理对土壤蔗糖酶活性具有显著抑制作用,复合处理和短时间凋落物处理具有促进作用(P<0.05)。酸雨和凋落物复合处理柳杉幼苗根际土壤,显著改变了两者对土壤酶活性的影响,说明酸雨和林地凋落物长时间并存,能够缓解两者对除土壤蛋白酶外其他土壤酶活性的不利影响,有助于改善土壤条件。     

昆虫病原细菌Cip蛋白基因工程菌发酵条件的优化

昆虫病原发光杆菌属(Photorhabdus)细菌产生的2种胞内晶体蛋白CipA和CipB已在大肠杆菌原核表达系统中进行稳定表达,为进一步提高该蛋白在大肠杆菌中的表达水平,确定工程菌摇瓶培养的最适条件,研究了多种无机离子、装液量、培养基初始pH值、诱导前添加葡萄糖等因素对工程菌摇瓶发酵的影响。结果显示,在发酵培养基中添加10 mmoL/L Mg2+和15 mmoL/LPO43-,调节初始pH值至7.2,装液量为25mL(250mL摇瓶),诱导前添加10g/L葡萄糖时,Cip蛋白的表达量可明显提高,发酵条件优化后CipA和CipB的表达量达到了39%和41%。