大叶补血草Na+/H+逆向转运蛋白基因NHX1核心片段的克隆及序列分析

根据GenBank中已登陆植物的Na+/H+逆向转运蛋白基因的保守序列设计简并引物,以盐生植物大叶补血草总RNA为模板,通过RT-PCR方法得到长为983 bp的片段,将其克隆到pGM-T载体上,经PCR和酶切鉴定筛选得到阳性克隆,并进行测序.通过DNAMAN软件对该序列进行同源性比对,结果表明,本研究所克隆的基因片段编码的氨基酸序列与拟南芥、小麦、滨藜、番杏、冰叶日中花的Na+/H+逆向转运蛋白同源性很高,其同源性分别为80.06%、72.00%、82.07%、82.37%和82.37%,表明该序列确属Na+/H+逆转运蛋白基因的部分片段,同时也说明Na+/H+逆向转运蛋白基因在植物中高度保守.     

自贡大公古盐井中嗜盐菌的Na~+/H~+离子逆转运蛋白基因筛选

[目的]筛选四川自贡大公古盐井中嗜盐微生物的Na+/H+离子逆转运蛋白基因,并对其结构和编码蛋白进行分析。[方法]构建自贡大公古盐井中嗜盐微生物的Na+/H+离子逆转运蛋白宏基因组文库,通过与Na+/H+离子逆转运蛋白基因缺陷宿主菌株E.coliKNabc的功能互补筛选Na+/H+离子逆转运蛋白基因。并通过生物信息学方法对该基因的起始密码子、终止子、ORF、-35区、-10区和SD序列以及编码蛋白的分子量、等电点、疏水区域、跨膜区域、系统进化和耐盐特性进行分析。[结果]筛选到1个新的Na+/H+离子逆转运蛋白基因m-nha,该基因能够赋予E.coli KNabc在盐和碱性条件下良好生长的能力。[结论]由于m-nha编码蛋白在氨基酸序列和结构上不同于以往报道的Na+/H+离子逆转运蛋白,故鉴定该基因为1个新的Na+/H+离子逆转运蛋白基因。该研究结果对于理解古盐井中嗜盐微生物的嗜盐机制,开发利用古盐井中的基因资源及寻找新的耐盐基因具有重要的意义。     

自贡大公古盐井中嗜盐菌的Na~+/H~+离子逆转运蛋白基因筛选(英文)

[目的]筛选四川自贡大公古盐井中嗜盐微生物的Na+/H+离子逆转运蛋白基因,并对其结构和编码蛋白进行分析。[方法]构建自贡大公古盐井中嗜盐微生物的Na+/H+离子逆转运蛋白宏基因组文库,通过与Na+/H+离子逆转运蛋白基因缺陷宿主菌株E.coliKNabc的功能互补筛选Na+/H+离子逆转运蛋白基因。并通过生物信息学方法对该基因的起始密码子、终止密码子、ORF、-35区、-10区和SD序列以及编码蛋白的分子量、等电点、疏水区域、跨膜区域、系统进化和耐盐特性进行分析。[结果]筛选到1个新的Na+/H+离子逆转运蛋白基因m-nha,该基因能够赋予E.coliKN-abc在盐和碱性条件下良好生长的能力。[结论]由于m-nha编码蛋白在氨基酸序列和结构上不同于以往报道的Na+/H+离子逆转运蛋白,故鉴定该基因为1个新的Na+/H+离子逆转运蛋白基因。该研究结果对于理解古盐井中嗜盐微生物的嗜盐机制,开发利用古盐井中的基因资源及寻找新的耐盐基因具有重要的意义。     

大米草Na~+/H~+逆转运蛋白基因片段的克隆(英文)

根据水稻的保守区设计引物,利用PCR体外扩增技术,从大米草中克隆Na+/H+逆转运蛋白基因片段.克隆出了一段长度为862 bp的DNA序列,结果表明它与水稻、大麦、小麦、棉花、拟南芥等植物的Na+/H+逆转运蛋白基因序列具有很高的同源性,证明该序列确属Na+/H+逆转运蛋白基因的部分片段.     

黄瓜质膜型Na~+/H~+逆向转运蛋白基因(SOS1)的克隆与序列分析

采用RACE(rapid-amplification of cDNA ends)方法从黄瓜Cucumis sativusL.中克隆出质膜Na+/H+逆向转运蛋白基因的cDNA(CsSOS1),该cDNA全长3 638bp,其中开放阅读框为3 435bp,编码1 145个氨基酸。氨基酸同源性分析表明,CsSOS1氨基酸序列与水稻OsSOS1和拟南芥AtSOS1的氨基酸序列同源性较高,分别为64%和58%,而与液泡型的Na+/H+逆向转运蛋白氨基酸序列亲缘关系较远。蛋白质跨膜结构分析表明CsSOS1包含11个完全跨膜片段。激光共聚焦显微镜显示CsSOS1基因的编码区与YFP基因融合后,定位在细胞膜上。酵母功能互补试验结果显示CsSOS1参与Na+与H+的转运,表明该基因转化酵母后可以补充酵母SOS1的缺失。     

转Na^＋／H^＋逆向转运蛋白（PeNhaD1）基因派间杂种110杨的获得

胡杨Na+/H+逆向转运蛋白基因(PeNhaD1)编码一种质膜Na+/H+逆向转运蛋白,在胡杨细胞拒盐机制中具有重要作用.本研究利用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefacience)介导的叶盘法将PeNhaD1基因转入盐敏感且速生的派间杂种110杨(P.deltoidesX P.maximozoiczi‘Eridano')中.经PCR和PCR-Southern检测已获得转PeNhaD1基因的110杨再生植株.     

珠美海棠Mz_2NHX1基因的克隆和序列分析

以珠美海棠幼苗根系的c DNA为模板,根据珠美海棠NHX1(GQ503257)的保守序列设计引物,通过RT-PCR扩增得到目的基因全长1 865 bp,包含1个1 635 bp的开放阅读框,编码544个氨基酸,其核苷酸序列与苹果(GU338395)、玫瑰(KC188664)、杨树(ACU01853)的核苷酸序列同源性分别是95%、93%、91%。其对应的氨基酸序列与拟南芥(AAF21755)、玫瑰(BAD93487.1)和大叶补血草(BAB11940)液泡型Na+/H+逆向转运蛋白的氨基酸序列的同源性分别是79%、87%、79%,说明该蛋白是一种定位于液泡膜的Na+/H+逆向转运蛋白,该基因属于液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因。它编码的蛋白质分子量为60.5 ku,理论等电点(p I)为8.85,二级结构主要由α-螺旋、β-折叠和不规则卷曲构成,其N-末端具有12个跨膜疏水片段,C-末端具有亲水的长链尾巴,在跨膜片段内含有氨基酸保守序列85-LFFIYLLPPI-94,是Na+/H+逆向转运蛋白抑制剂氨氯吡嗪咪的结合位点。     

Na~+/H~+逆向转运蛋白与植物耐盐性的关系

植物抵御盐胁迫的有效策略之一是将细胞质中过多的Na+区隔化在液泡,这一过程是由液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白完成的.概述了 Na+/H+逆向转运蛋白的分子结构和功能,在次基础上介绍了该蛋白对盐胁迫的响应和耐盐性的关系,并简述了其基因的克隆和表达调控,同时对Na+/H+逆向转运蛋白研究的前景做了展望.     

盐爪爪液泡膜H+-ATPase B亚基基因克隆及盐胁迫液泡膜相关基因的表达

[目的]研究藜科盐生植物盐爪爪(Kalidium foliatum)V-H+-ATPase B亚基基因的克隆与液泡膜相关基因的表达分析.[方法]采用RT-PCR和RACE技术克隆盐爪爪V-H+-ATPase B亚基基因(VHA-B),利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术分析液泡膜相关基因KfVHA-B、Na+/H+逆向转运蛋白基因KfNHX的表达情况.[结果]KfVHA-B全长1 881 bp,含1 467 bp的ORF阅读框,命名为KfVHA-B(GenBank登录号:EF114316),编码488个氨基酸,推测的蛋白分子量大小为54.01 kD,理论等电点为4.68,含一个保守的ATP结合位点‘323-SGSIT-327’和两个推测的多聚腺苷酸化的信号保守序列;基因编码蛋白的系统进化树分析表明,盐爪爪VHA-B与盐穗木的VHA-B聚类关系最近;qRT-PCR检测了液泡膜相关基因KfVHA-B、Na+/H+逆向转运蛋白基因KfNHX的表达,100、500 mmol/L NaCl处理下,KfVHA-B在转录水平表达量始终保持较稳定,KfNHX基因在转录水平随盐浓度的增加其表达量呈现递增趋势,而且100 mmol/L NaCl处理下72 h时其表达量达到最大.[结论]KfVHA-B可能在盐爪爪应对盐胁迫中起着重要的作用.     

海滨锦葵耐盐基因KvSOS1的克隆与表达载体构建

为了克隆盐生植物海滨锦葵耐盐基因Kv SOS1并构建其表达载体,采用RT-PCR和RACE方法从海滨锦葵中克隆了质膜Na+/H+转运蛋白基因Kv SOS1(Gen Bank登录号KJ577576)的全长c DNA序列,长度为3 850 bp,其中开放阅读框长度为3 444 bp。Kv SOS1基因编码1个由1 147个氨基酸残基组成的蛋白,分子量为127.56 ku,理论等电点p I为6.18。疏水性分析结果表明,该蛋白N-末端具有高度疏水性,并含有11个跨膜区,C-末端为1个长约700个氨基酸残基的亲水性尾巴位于细胞质中。Kv SOS1基因编码蛋白与雷蒙德氏棉、可可和陆地棉SOS1蛋白的氨基酸序列同源性很高,分别为86%、82%和82%。系统进化树分析显示Kv SOS1基因编码蛋白与质膜Na+/H+转运蛋白、液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白(NHX)属于不同分支。同时将Kv SOS1基因构建入植物表达载体p BI121中,并成功转入农杆菌LBA4404中。     

橡胶树半胱氨酸蛋白酶基因HbCP2的克隆与表达特性分析

根据EST和基因组序列设计引物,应用RT-PCR技术从橡胶树的根组织中分离到1条长1056 bp的cDNA,该序列包含了1023 bp的开放读码框（ORF）,17 bp的5’UTR和16 bp的3’UTR;ORF预测编码340个氨基酸,理论分子量为37.52 kD,等电点为5.25,属于液泡定位的分泌型蛋白;蛋白含有1个Inhibitor_I29和1个Peptidase_C1A结构域,隶属于木瓜蛋白酶C1家族;蛋白与蓖麻、杨树中同源蛋白的相似性均在80％以上,将基因命名为Hb CP2。表达分析显示,在所分析的根、树皮、木质部、芽、叶片、叶柄和乳管等组织中,HbCP2仅在根中被检测到,表现出明显的组织特异性。     

杨树幼茎特异表达基因及PsnLAC基因的克隆

利用cDNA-AFLP技术对小黑杨茎、叶基因的差异表达进行分析.结果表明,64对引物组合在茎和叶中共扩增出4 192条带,其中差异条带2 275条.通过对茎中特异表达基因的克隆和测序,获得了4条cDNA序列.经Blast-x比对分析表明,它们分别是类伸展蛋白、漆酶、过氧化物酶和细胞壁相关水解酶.进行RT-PCR分析发现...     

毛白杨4CL-like基因的克隆与原核表达分析

为得到毛白杨4CL-like基因并对其原核表达特性进行分析,利用毛白杨叶片的总RNA反转录得到的总cDNA为模板,利用PCR技术克隆得到毛白杨4CL-like基因(登录号:XP_002315339.1).利用MEGA软件对4CL-like基因及其他9个来自不同物种的4CL基因进行进化树分析.最后通过构建pET30-4CL-like原核表达载体对该基因进行原核表达分析.结果显示,克隆得到的4CL-like基因CDS区全长为1 758 bp,编码585个氨基酸.系统进化分析表明,该基因与葡萄中的4CL-like5有很高的同源性.另外,SDS-PAGE分析表明,4CL-like基因在大肠杆菌BL21中成功表达,所表达融合蛋白的分子量约为60 ku.     

琯溪蜜柚BAC文库的构建和汁胞粒化相关基因的筛选

【目的】构建琯溪蜜柚BAC文库,利用该文库筛选与汁胞粒化相关的基因。【方法】用温和的物理方法获得高分子量DNA,部分酶切后进行回收、连接、转化,超低温保存阳性克隆。构建DNA样品混合样,PCR法筛选文库,生物信息学分析DNA序列。【结果】改进了适合琯溪蜜柚BAC文库构建的方法;构建的琯溪蜜柚BAC文库含有26112个单克隆,空载率小于1%,叶绿体DNA的污染率不超过1%,插入片段平均大小大约120kb,覆盖8倍的琯溪蜜柚基因组。利用与琯溪蜜柚汁胞粒化相关的EST序列设计PCR引物筛选文库,得到一段大小为1088 bp的DNA序列,该序列含有两段大小分别为122bp和172bp的内含子,经同源比对发现,该序列中部分序列与蓖麻(Ricinus communis)、杨树(Populus trichocarpa)多铜氧化酶(multicopper oxidase)cDNA序列分别有85%和71%的同源性;与毛叶番荔枝(Annona cherimola)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)果胶酯酶(pectinesterase)cDNA序列分别有76%和73%的同源性。【结论】本研究构建的BAC文库适用于琯溪蜜柚功能基因组的研究,从BAC文库筛选获得的DNA序列与汁胞粒化相关的基因有高度同源性。     

利用trnL—F序列分析杨属树种的系统发育关系

对杨属4个派17个主要栽培树种及杂种共26个雌雄单株进行了叶绿体trnL-F间隔区序列的PCR扩增、回收和纯化,并分别克隆到pGEM-T载体中进行序列测定。结果表明:在杨树中基因trnL-F间隔区序列的长度为771～811bp,G+C含量为30.6%～31.9%;排序后的比对长度为857个位点,其中46个为变异位点,33个为系统发育的信息位点。以嵩柳和极地柳为外类群,分别用邻接法和UPGMA方法构建了杨属主要栽培树种的系统发育进化树。系统进化分析显示:1)白杨派能聚类形成一个单独分支,而黑杨派亚支与青杨、胡杨派亚支聚类形成另外一个主要的分支,其中胡杨派和青杨派不能区分开;2)青杨派的藏川杨独立于杨属其他种形成一个单独分支,而冬瓜杨却与白杨派聚类在一起;3)白杨派为单系起源,黑杨派和青杨派为多系起源,胡杨派可能也是多系起源。研究结果在分子水平上为杨属树种的起源和系统进化研究提供了证据,具有重要的理论意义和潜在的实践价值。     

一种鉴定山杨性别的SSR分子标记的筛选

为了对山杨的幼苗进行早期的性别鉴定,通过寻找与杨属性别染色体相关的分子标记,试着鉴定山杨的雌雄。采用SSR结合BSA技术对96个山杨个体(雌性各48个)进行性别差异标记的筛选,发现1对引物(BPCA90)在雄基因池扩增出差异条带。利用引物BPCA90检测待测样品的微卫星标记基因型,若检测得到长度约550 bp的单一片段为雄性,未检测到长度约550 bp的单一片段为雌性,从而完成对山杨的雌雄性别的鉴别。整个鉴定过程操作简单,方法鉴别率为100%,且得到条带结果清晰、鉴定过程特异性高、重复性好、稳定性强。     

鹰嘴豆LHY基因cDNA克隆及生物信息学分析

从鹰嘴豆中克隆生物节律钟LHY基因的cDNA全长序列,进行序列信息学分析。通过同源克隆策略,利用RT-PCR技术获得核心片段,结合5＇-RACE和3＇-RACE技术,克隆得到鹰嘴豆生物节律钟基因LHY的cDNA全长序列,其核苷酸序列长度为3 061 bp,包括2 220 bp的完整开放阅读框（ORF）,编码739个氨基酸。验证后命名为CarLHY基因,获得基因登录号为KJ558378。生物信息学研究表明CarLHY基因cDNA序列与其他植物LHY基因具有较高的相似性;预测CarLHY蛋白不具有跨膜结构;为转录因子,定位于细胞核中;不具备信号肽。对CarLHY蛋白功能结构域预测表明,蛋白质核心结构存在符合转录因子与DNA结合的常见功能域HTH。蛋白系统进化树显示,与大豆分子进化距离最近,其次是黑杨、拟南芥。     

毛白杨木质素合成酶基因F5H克隆与生物信息学分析

克隆毛白杨阿魏酸-5-羟基化酶(F5H)基因全长序列,并通过生物信息学分析,为进一步研究F5H基因功能提供基础.利用RT-PCR方法成功从毛白杨741组培苗叶片中克隆了F5H基因,并对F5H基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行分析,包括疏水性-亲水性、氨基酸翻译后修饰、亚细胞定位、跨膜结构域、蛋白质二级三级功能结构域等进行分析预测和推断.获得的基因长度为l 686 bp,编码区1542 bp,与已公布的毛果杨F5H mRNA序列(GenBank登录号为AJ010324)的编码区相似性达97.45％,并与其他植物的该基因序列具有同源性.F5H是亲水性较强的蛋白,整条肽链有1个跨膜结构域;通过亚细胞定位表明F5H主要位于质体中,并含有磷酸化位点有19个.F5H含有丰富的二级结构,卷曲占44.44％、折叠占7.02％、螺旋占48.54％,并预测了其三维结构.分析结果显示,植物的阿魏酸-5-羟基化酶是一个具有跨膜结构域的亲水性蛋白,在内质网等分泌途径中表达.     

红海榄液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因的克隆与分析

根据液泡膜Na+/H+反转运蛋白基因(fHXl)的保守序列设计引物,通过RT-PCR扩增得到红海榄Na+/H+反转运蛋白基因的cDNA片段,然后采用cDNA末端快速扩增法(RACE)得到RsHX1基因的全长cDNA序列,GenBank登录号为FJ627273,被命名为RsNHXl.该基因序列的长度为2 094 bp,包...     

巴西橡胶树LIM结构域基因克隆与生物信息学分析

根据乙烯利刺激巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)胶乳差异表达cDNA文库的EST序列信息,利用RACE技术从胶乳中成功克隆了1个含有LIM结构域的未知功能新基因HbLIM的全长cDNA。生物信息学分析表明,该基因全长cDNA由1016bp的碱基组成,拥有1个570bp的开放阅读框编码189个氨基酸残基;推测氨基酸序列富含Lys,Ser,Ala和Leu,含有2个LIM结构域和2个N-豆蔻酰化位置。序列相似性分析表明,HbLIM编码的氨基酸序列与蓖麻、杨毛、葡萄相应的LIM基因的相似性高达98%,95%和92%。这些研究结果为深入探讨LIM结构域蛋白在巴西橡胶树乳管发育及乳管代谢中的功能奠定了基础。