新颖抗猪流行性腹泻免疫制剂

以新生乳猪增殖猪流行性腹泻病毒（ＰＥＤＶ），通过蔗糖密度梯度离心纯化，获得结构较为完整的病毒颗粒，病毒ＥＬＩＳＡ效价为１：３×１０＾５，蛋白含量为３．９６ｍｇ／ｍＬ。将提纯的ＰＥＤＶ免疫Ｂａｌｂ／Ｃ小鼠，取其脾细胞与ＳＰ２／０骨髓瘤细胞进行融合，融合率为９５．６％。用间接ＥＬＩＳＡ筛选并进行３次再克隆，阳性率达１００％，共获得１５株能稳定分泌特异性抗ＰＥＤＶ单克隆抗体（ＭｃＡｂ）的杂交瘤细胞。其染     

水稻簇矮病毒：植物呼肠孤病毒属的一个新成员

水稻簇矮病毒（ＲＢＳＶ）是由黑尾叶蝉（Ｎｅｐｈｏｔｅｔｉｘｃｉｎｃｔｉｃｅｐｓ）和二点黑尾叶蝉（Ｎ．ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）传播的持久性病毒，但不经卵传递；病害表现有奇特的多蘖症或节枝症，且其病株汁液与水稻矮缩病毒（ＲＤＶ）抗血清不起免疫反应．采用差速离心和蔗糖密度梯度离心，可获得ＲＢＳＶ提纯制剂，提纯制剂经紫外扫描，呈典型的核蛋白吸收曲线，Ａ２６０／２８０＝１．６４．在电镜下观察提纯病毒，可见大量比较均一的球状粒体，直径为６０．０ｎｍ．病毒粒体有双层衣壳，蛋白亚基清晰可辨．通过免疫扩散和免疫电镜试验，病毒粒体与ＲＢＳＶ抗血清有明显的血清学反应，而这种抗血清与ＲＤＶ、水稻瘤矮病毒（ＲＧＤＶ）不起反应．提纯ＲＢＳＶ制剂以苯酚－甲基苯酚－ＳＤＳ方法提取核酸．将其注射到昆虫介体内，具有侵染性．核酸制品有典型的核酸紫外吸收曲线，Ａ２６０／２８０＝２．０２．根据核酸在不同离子强度下对ＲＮａｓｅ的稳定性等的测定，表明其核酸属双链ＲＮＡ．根据紫外吸收测定，ＲＮＡ在ＲＢＳＶ粒体中的含量为１７．５％．用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定，其ＲＮＡ的总分子质量为１６．６６×１０６．各组分相对分子质量分别为２．７０×１０６、２．３０×１０６、１?     

引起二月兰花叶病的芜菁花叶病毒研究

在表现花叶、植株矮化、茎叶坏死和畸形的十字花科观赏植物二月兰（Ｏｒｙｃｈｏｐｈｒａｇｍｕｓｖｉｏ－ｌａｃｅｕｓ）上分离到一种线状病毒,其病毒粒子分布范围为７８０～８００ｎｍ．通过寄主反应测定、病毒提纯和形态观察、血清学反应测定,确定该病毒为芜菁花叶病毒（ＴｕＭＶ）．病毒分离物ＡＨ１回接二月兰无病毒苗,引起黄斑、系统花叶、系统坏死和畸形,在供试十字花科植物上均产生系统侵染,并在洋酸桨等茄科供试寄主上引起系统症状．ＡＨ１与来自十字花科甘蓝型油菜上的一个ＴｕＭＶ有紧密的血清学关系,但在寄主反应上与之有一定差异．对自然发病的二月兰植株和接种ＡＨ１分离物的系统寄主用ＴｕＭＶ抗血清进行免疫电镜观察,均检测到线状病毒粒子,用ＣＭＶ抗血清、ＴＭＶ抗血清进行检测,均没有发现相关病毒．作者认为：ＴｕＭＶ即是引起二月兰花叶病的病原．这是ＴｕＭＶ侵染该属植物的首次报道．     

甘蔗花叶病毒的提纯及抗血清制备

以ＳｃＭＶ－Ａ为材料,采用ＰＥＧ沉淀结合差速离心技术,经１０－４０％蔗糖密度梯度离心后再经浓缩后即为提纯病毒制剂。该提纯病毒具有典型的核蛋白吸收曲线,最大紫外吸收值在２５７ｎｍ处,最小紫外吸收值为２４０ｎｍ,Ａ２６０／２８０＝１．６８,病毒产量可达１．２５－１．３７ｍｇ／ｋｇ。将提纯病毒免疫家兔制备抗血清,所制备的抗血清经Ａ蛋白酶联免疫吸附法测定,其效价为１／１０２４,且可用于检测甘蔗花叶病毒。     

花生病毒病研究──Ⅰ．花生矮花叶病的病原鉴定

１９８７～１９９３年期间，在河北、河南、山东、辽宁、北京４省１市先后采集花生矮花叶病及斑驳病标样２９０个，冷干保存，经用鉴别寄主测定、间接ＥＬＩＳＡ、电镜观察证明，引起北方花生产区花生矮花叶病的病原是花生条纹病毒（轻斑驳病毒）（ＰＳＴＶ原ＰＭＭＶ）、花生矮化病毒（ＰＳＶ）、花生黄瓜花叶病毒（ＣＭＶ—ＣＡ）、花生斑驳病毒（ＰＭＶ）其发生频率依次为４７％，４１．３％，３３．３％，３．３％．在我国除台湾省外，在北方花生产区第１次报道ＰＭＶ的发生。     

苹果潜隐病毒快速检测

该文以优系短枝富士为主要试材，采用木本指示植物和间接酶联免疫（ＰＡＳ－ＥＬＩＳＡ）两种方法，对苹果褪绿叶斑病毒（ＣＬＳＶ）、苹果茎沟病毒（ＳＧＶ）和苹果茎痘病毒（ＳＰＶ）进行了检测．试验表明，俄罗斯苹果Ｒ１２７４０－７Ａ、司派２２７和弗吉尼亚小苹果３种指示植物可作为上述３种潜在病毒的鉴定植物．植物生长状况对鉴定结果有重大影响．间接酶联免疫检测速度快，准确度高．该试验所用最佳抗体工作浓度ＣＬＳＶ：第一抗体１／６０００，第二抗体１／２０００；ＳＧＶ：第一抗体１／５０００，第二抗体１／３０００．     

芜菁花叶病毒外壳蛋白基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

本文报道采用反转录酶一聚合酶链式反应，体外扩增芜菁花叶病毒外壳蛋白基因及其克隆，并在大肠杆菌中获得表达的结果。从杭州市郊区感病的油菜上分离到一致病力极强的芜菁花叶病毒分离物，提纯后，经５０ｎｇ／ｍｌ蛋白酶Ｋ和０．５％ＳＤＳ处理，苯酚／氯仿和氯仿抽提两次，酒精沉淀，获得了纯化的病毒ＲＮＡ，该ＲＮＡ与ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１３退火后，在ＡＭＶ反转录酶的作用下合成了单链ｃＤＮＡ，然后加入用以扩增ＴｕＭＶ－Ｃ     

花生病毒病研究：I.花生矮花叶病的病原鉴定

１９８７－１９９３年期间，在河北、河南、山东、辽宁、北京４省１市先后采集花生矮花叶病及斑驳病标样２９０个，冷干保存，经用鉴别寄主测定、间接ＥＬＩＳＡ、电镜观察证明，引起北方花生产区花生矮花叶病的病原是花生条纹病毒（轻斑驳病毒）（ＰＳＴＶ原ＰＭＭＶ）、花矮化病毒（ＰＳＶ）、花生黄瓜花叶病毒（ＣＭＶ－ＣＡ）、花生斑驳病毒（ＰＭＶ）其发生频率依次为４７％，４１．３５，３３．３％，３．３％。在我国除台湾外     

一串红花叶病及其病原研究

１９８９─１９９２年间对杭州等地一串红（Ｓａｌｖｉａｓｐｌｅｎｄｅｎｓ）花叶病的发生及其病原进行了系统研究，从病株上分离得到的１７个病毒分离物，经生物学和血清学反应测定均符合黄瓜花叶病毒（ＣＭＶ）的特点。病毒分离物Ｍ－２２不能经由桃蚜传播使黄苗榆等供试寄主发病。用０．５ｍｏｌ／Ｌ磷酸钾盐缓冲液对Ｍ－２２进行提纯，提纯病毒经醋酸铀负染，测定其粒子大小为３０．２ｎｍ。ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳测定Ｍ－２２的外壳蛋白分子量约为２８ｋＤ，经琼脂双扩散测定，Ｍ－２２与几个已知ＣＭＶ抗血清均有强阳性反应，Ｍ－２２与一个番茄不孕病毒（ＴＡＶ）抗血清有阳性反应，但其抗血清与供试ＴＡＶ抗原无阳性反应。ＥＬＩｓＡ反应测定结果表明，Ｍ－２２与一个来自于十字花科大白菜上的ＣＭＶ分离物和一个来自于前科烟草上的ＣＭＶ分离物，在血清学关系上有明显差异。根据实验结果，作者认为目前在杭州等地侵染一串红的病原病毒主要是ＣＭＶ，侵染一串红的ＣＭＶ分离物Ｍ－２２可能是一个独立的血清型．     

鸭源新城疫病毒和减蛋综合征病毒在同一鸭胚中增殖的观察

用鸭源新城疫病毒（ＮＤ）Ｄ１０株和减蛋综合征（ＥＤＳ—７６）病毒ＧＣ２株同时在同一鸭胚中复制增殖．结果表明：（１）两种病毒同时感染同一鸭胚后，鸭胚平均死亡时间（ＭＤＴ）７３．６ｈ，死亡率８８．２％（１５／１７）．胚体皮肤出血、淤血，绒毛尿囊膜水肿、增厚，尿囊液能凝集人和鸡红细胞．（２）尿囊液感染鸡胚成纤维（ＣＥＦ）细胞，致细胞病变（ＣＰＥ），证实尿囊液中存在ＮＤＶ．用间接法Ｄｏｔ—ＥＬＩＳＡ检测ＥＤＳ—７６病毒抗原，结果为阳性．（３）电镜观察经提纯浓缩后的尿囊液，可见到两种病毒粒子：ＮＤＶ形态不一，多数直径约１２０～１３０ｎｍ或更大．有囊膜；ＥＤＳ—７６病毒呈圆形，直径约７０ｎｍ，有囊膜．（４）用血凝试验（ＨＡ）测定两种病毒．其生长规律与单独接种时一致．（５）接种灭活的含毒尿囊液的雏鸡，在血清中出现抗两种病毒的ＨＩ抗体及抗ＥＤＳ－７６病毒的中和抗体，对ＮＤＶ强毒攻击有坚强的免疫力。     

百里香酚体外抗伪狂犬病毒活性评价及其作用方式

采用细胞体外培养技术,以BHK-21细胞为研究模型,探讨不同质量浓度的百里香酚在体外抗伪狂犬病毒(PRV)的活性及其作用方式。使用CCK-8法检测百里香酚对BHK-21细胞的最大无害浓度(MNTC),计算得出其半数抑制浓度(IC₅₀)为(212.789±1.652)μg·mL^-1,对PRV的半数有效浓度(EC₅₀)为(30.710±0.303)μg·mL^-1,对PRV的治疗指数(TI)为6.929,说明百里香酚属于高效低毒类抗PRV药物。使用CPE观察法检测百里香酚对PRV病毒滴度和病毒一步生长曲线的影响,结果显示,百里香酚能够剂量依赖性显著降低PRV的病毒滴度,并降低PRV在BHK-21中增殖后的毒力。采用荧光定量PCR方法检测不同处理下PRV感染的BHK-21细胞的PRV-gE基因的拷贝量,研究百里香酚体外抗PRV的作用方式,结果显示,百里香酚主要是通过抑制PRV在BHK-21细胞中的增殖来发挥抗病毒活性的,同时能够直接杀灭部分PRV病毒粒子。     

河南省猪伪狂犬病的流行动态及防制研究

对河南省１９ 个猪场发病仔猪的检测发现,许多被检仔猪存在ＰＲＶ 感染,发病猪场占全省猪场的９ ．６ ％ ,其ＰＲＶ 阳性检出率平均为３４ ．５ ％ ,占被检发病仔猪的３５ ．８ ％ ,并呈快速上升趋势。对３ 个ＰＲＶ 污染猪场采取了综合控制措施,取得了较好的效果,为养猪场控制此病提供了可靠的方法。     

基因重组技术在猪伪狂犬病毒基因工程疫苗中的研究进展

猪伪狂犬病是一种由伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)感染引起的急性高度接触性传染病,可造成不同日龄的猪发病,给养猪业造成了严重的经济损失。预防、控制甚至消灭猪伪狂犬病的主要措施之一是疫苗免疫接种。通过基因重组技术对PRV关键毒力基因进行改造,敲除毒力基因或插入免疫增强基因,是降低PRV毒力或提高病毒免疫保护效果的有效方法之一,也是研制安全高效PRV基因工程疫苗的重要手段。从基因同源重组、Cre/lox P位点特异性重组、细菌人工染色体和CRISPR基因编辑等不同基因重组技术应用方面对猪PRV基因工程疫苗的研制进行综述,为PRV重组疫苗的进一步深入研究提供参考。     

Research and development of a novel subunit vaccine for the currently circulating pseudorabies virus variant in China

Pseudorabies (PR) is a devastating viral disease which leads to fatal encephalitis and respiratory disorders in pigs. Commercial gE-deleted live pseudorabies virus (PRV) vaccine has been widely used to control this disease in China. However, the new-emerging variants of PRV compromises the protection provided by current vaccines and lead to the outbreak of PR in vaccinated pig herds. Several killed and live vaccine candidates based on current PRV variants have been reported to be effective to control the disease. A subunit vaccine based on gB protein, one major PRV glycoprotein which elicits strong humoral and cellular immune responses, however, was never evaluated for protection against the current circulating PRV variants. In this study, full-length PRV gB protein was successfully expressed in baculovirus/insect cells in the soluble format and was tested on 3-week-old piglets as a subunit vaccine. Compared with unvaccinated pigs, the gB-vaccinated pigs developed specific antibody-mediated responses and were protected from the virulent PRV HN1201 challenge. All vaccinated pigs survived without showing any PRV-specific respiratory and neurological signs, but all unvaccinated pigs died within 7 days after HN1201 challenge. Hence, this novel gB-based vaccine could be applied as an effective subunit vaccine to control PRV variant in China.     

应用PCR检测猪伪狂犬病毒野毒的研究

[目的]对猪伪狂犬病毒野毒进行检测.[方法]根据已发表的猪伪狂犬病病毒gE基因核苷酸序列,设计合成1对引物,扩增片段长度为276 bp,优化PCR反应条件,建立检测PRV野毒的PCR方法.[结果]利用建立的PCR方法检测疑似PRV野毒感染的临床送检组织病料34份,阳性样品18份,阳性率达52.94％（18/34）,选取6份阳性病料PCR产物送生工生物工程（上海）股份有限公司进行序列鉴定,测序结果表明均为PRV gE基因特异性序列.[结论]该方法敏感、特异、可靠,可用于PRV野毒感染的快速诊断和流行病学调查.     

抗猪轮状病毒VP6单克隆抗体的制备与鉴定

用纯化的重组PRV VP6蛋白免疫BALB/c小鼠,运用淋巴细胞杂交瘤技术,通过间接ELISA筛选,获得了1株稳定分泌抗PRV VP6的单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名C5D10。经鉴定C5D10为IgG1亚类,杂交瘤细胞的平均染色体数为93,细胞培养液上清及腹水效价分别为18∶00和11∶×106,且C5D10单克隆抗体不与猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪伪狂犬病病毒发生交叉反应,显示良好的特异性。     

内质网分子伴侣GRP94对伪狂犬病毒增殖的调节作用

为探究葡萄糖调节蛋白94(GRP94)对伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)增殖的影响,以及GRP94与PRV结构蛋白之间的相互作用。利用慢病毒转染构建GRP94基因过表达的BHK-21细胞,以及CRISPR/Cas9技术构建GRP94基因敲除的BHK-21细胞,检测PRV感染不同细胞的增殖水平,比较内质网应激相关蛋白表达水平,探索GRP94与PRV结构蛋白之间的互作关系。结果表明,GRP94基因过表达细胞株显著有利于PRV增殖,而GRP94基因缺失细胞株对PRV增殖无显著影响。蛋白免疫印迹结果显示,在GRP94基因缺失细胞株中,GRP78表达水平显著上调。免疫共沉淀结果表明,GRP94与gB、gD、gL具有相互作用。GRP94基因过表达有利于PRV增殖,检测未折叠蛋白反应(unfolded protein response, UPR)相关蛋白,研究GRP94在病毒增殖过程中的具体作用,可为PRV与内质网应激提供分子方面的研究基础,于对抗PRV病毒的感染具有重要意义。     

猪Ⅱ型圆环病毒-伪狂犬重组病毒活疫苗SA215(C)株的构建(初报)

根据GenBank发表的PCV2序列设计一对特异性引物,采用PCR方法,扩增PCV2 ORF2基因,将ORF2基因插入到含有EGFP报告基因的转移载体质粒pPI-2.EGFP,获得重组中间转移质粒pPI-2.EGFP-ORF2。采用脂质体介导法,将重组中间转移载体pPI-2.EGFP-ORF2与伪狂犬病毒SA215株基因组共转染真核ST细胞,通过空斑纯化得到了表达猪Ⅱ型圆环病毒ORF2基因和绿色荧光蛋白基因的重组伪狂犬病毒SA215(C)。经检测,重组病毒能表达具有生物活性的ORF2基因蛋白和绿色荧光蛋白。并且重组病毒及亲本株在同一细胞上的增殖滴度基本相同,表明EGFP和PCV2 ORF2基因的插入不影响PRV SA215的增殖。该重组病毒可作为猪Ⅱ型圆环病毒和伪狂犬病毒候选疫苗毒株。     

伪狂犬病基因缺失疫苗研究进展

 伪狂犬病是由疱疹病毒科α-疱疹病毒亚科猪疱疹病毒I型的伪狂犬病毒引起的包括多种家畜和野生动物共患的一种急性传染病。猪是本病病毒的天然宿主和贮存者,本病可引起猪严重的繁殖障碍,给我国乃至全世界的养猪业造成巨大经济损失。采取安全有效的疫苗进行免疫预防,是控制该病的主要手段。     

伪狂犬病病毒鄂A株gC基因的克隆、序列分析及其在大肠杆菌中的表达

 以伪狂犬病病毒国内地方分离株 (鄂A株 )为材料 ,采用核酸杂交、DNA重组技术直接从基因组DNA中克隆了最主要的保护性抗原基因gC ,测定了全序列并对其原核表达产物作为血清学诊断抗原进行了初步探讨。结果表明 :所克隆的 gC基因全长 175 5bp(含启动子序列和 poly(A)信号序列 ) ,具有典型I型膜蛋白结构特征。同具有代表性的国外标准株NIA 3株、IndianaS株相比 ,多个酶切点不同 ,尤其是具有分型意义的BamHI位点消失 ;氨基酸水平上也存在一定程度的差异 ,鄂A株 gC可编码 4 87个氨基酸残基 ,而以往所报道的gC均只编码 4 78或 4 79个氨基酸 ,有意义的是功能区突变较多 ,并存在连续 7个氨基酸残基的插入。同 pET 2 8a的 6xHis Tag融合的gC基因完整编码区在大肠杆菌中获得高效表达 ,融合蛋白分子量为 6 2ku ,能同伪狂犬病病毒高免血清发生特异性反应。纯化的表达产物作为ELISA和乳胶凝集诊断抗原 ,具有很高的敏感性和特异性