Agrobacterium-mediated transformation of Musa spp.cv.Tianbao with cDNA encodina S6PDH(NADP-dependent sorbitol-6-phosphate dehydrogenase) from Prunus salicina var.cordata

研究以香蕉栽培品种“天宝蕉”(Musa spp.cv.Tianbao)横切薄片(Thin cross-sections,TCSs)为材料,采用根癌农杆菌介导的方法,进行棒S6PDH基因转化香蕉的研究.结果表明,在横切薄片继代增殖培养基M4中添加5％～7％(V/V)的椰汁明显增强了香蕉芽苗的生长势；GUS基因瞬时表达检测表明,长势旺盛的香蕉芽苗(直径为7～8 mm)适宜作为香蕉遗传转化的受体材料,横切薄片厚度以2mm左右为佳；采用两步法进行抗性芽的筛选得到37个抗性芽苗,生根移栽后获得31株成活苗；目的基因S6PDH和报告基因GUS的PCR检测表明其中4株是转基因植株.该研究为将蔷薇科山梨醇代谢途径引入香蕉以提高其耐渗透胁迫的能力奠定了重要的基础.     

利用农杆菌介导法获得转基因香蕉植株

用含质粒pBI426的根癌农杆菌EHA105转化香蕉品种威廉斯的横切薄片,在含100mg/L卡那霉素和600mg/L羧苄青霉素的MS分化培养基上诱导分化芽,获得17株转化苗。抽提植株DNA,以未转化植株为阴性对照,进行聚合酶链式反应,结果发现7株苗含有GUS基因。这初步证明了GUS基因已经转入香蕉薄片中。     

硝酸银在香蕉遗传转化上的作用

试验以天宝蕉茎尖横切薄片为材料,研究硝酸银在根癌农杆菌介导的香蕉遗传转化中的作用。试验表明,硝酸银对农杆菌菌株LBA4404有较强的抑制作用;在筛选培养基中添加2 mg.L-1硝酸银,褐变乃至死亡的薄片比未添加硝酸银少9.0%,抗性芽分化率增高5%,因此硝酸银对香蕉的遗传转化有促进作用。     

基因枪介导大麦基因转化体系的建立

为了进一步提高基因枪转化效率，研究建立了以澳大利亚品种Franklin幼胚为受体的高效基因枪介导转化体系。结果表明，经愈伤组织诱导、筛选培养，从519块愈伤组织中获得16株再生苗，植株再生率高达3．0％。对长势良好的9株再生苗除草剂抗性检测和目的基因的PCR、PCR-Southern检测证实7株为转基因植株，并经过对外源基因(TrxS)表达活性检测表明，转基因大麦中Trxh的活性是CK的3．3倍，为基因枪高效转化提供了成功的证据。     

玉米基因枪转化受体材料的选择

以4种玉米转化受体为材料,进行了基因枪转化玉米受体材料的研究。通过GUS基因的短暂表达和转Bar基因抗性绿苗分化率研究表明,预培养3～4d的玉米幼胚更适合作基因枪转化的受体材料。对转基因再生植株的PCR分析及除草剂抗性检验,证明Bar基因已整合到玉米基因组中。试验结果还表明,在转基因筛选过程中加入AgNO3,可提高抗性绿苗分化。     

农杆菌介导的橡胶草遗传转化体系的建立

以橡胶草为试验材料,利用农杆菌介导法进行遗传转化研究。结果表明:50mg/L的卡那霉素(Kan)对橡胶草的抗性芽具有很好地筛选效果,生根筛选时,Kan的适宜质量浓度为35mg/L;最佳抑菌抗生素为羧苄青霉素(cb),适宜质量浓度为500mg/L,获得35株抗性试管苗,通过GUS染色及分子生物学检测,最终获得6株转基因植株,转化率为17.1%。可见,获得的橡胶草转基因植株,为橡胶草后续的遗传转化研究奠定了基础。     

大叶女贞抗寒基因AmEBP1高效转化体系的研究

本研究以大叶女贞为受体材料,利用农杆菌浸染方法对沙冬青抗寒基因AmEBP1进行转化试验,通过对不同的受体材料浸染部位、菌液浓度和浸染时间对转化材料的死亡率%、分化率%、分化芽数(个)、芽苗长度(cm)以及芽苗颜色影响进行了分析,结果表明:转化材料为茎段,菌液浓度稀释为50%,浸染时间15 min;其中浸染部位是影响基因高效转化的最主要因素,菌液浓度和浸染时间的作用次之;方差分析进一步发现,浸染部位的三个水平对于外源基因在植物体内的转化显著差异,因此选择合适的浸染部位、适宜的菌液浓度和浸染时间能提高基因转化效率;经在50 mg/L浓度的卡那霉素培养基筛选培养,获得一批抗性植株,经PCR检测获得5株转化株系.     

幽门螺杆菌ureB基因的草莓转化研究

建立了农杆菌介导利用潮霉素抗性作为筛选标记的草莓转化系统。以草莓叶片为材料，把Helicobacterpylori的ureB基因连接到CaMV35S启动子后构成pCAMBIAI3011-ureB表达载体，通过根癌农杆菌EHAl05介导叶盘法转化草莓，经共培养和潮霉素抗性筛选，得到60株抗性植株。对所得植株进行PCR检测，表明阳性苗比例为42％。RT-PCR结果进一步证明目的基因在To代转化植株中已经转录。     

根癌农杆菌介导的葡萄风信子遗传转化体系

【目的】以葡萄风信子亚美尼亚(Muscari armeniacum)的胚性愈伤组织为受体系统,建立高效稳定的葡萄风信子遗传转化体系,为葡萄风信子遗传改良及相关基因功能的研究奠定基础。【方法】通过GUS(β-葡萄糖苷酸酶)瞬时表达率,研究根癌农杆菌的菌液浓度、侵染时间、共培养时间和超声波预处理时间等4个因素对葡萄风信子GUS瞬时表达效率的影响,并在最佳条件下将GUS基因转入葡萄风信子,获得稳定表达转化植株。【结果】葡萄风信子胚性愈伤组织GUS染色结果表明,随着根癌农杆菌菌液浓度的增加及侵染时间、共培养时间和超声波预处理时间的延长,GUS瞬时表达效率均呈现先增后降趋势;当根癌农杆菌菌液OD600为0.5、侵染时间20min、共培养4d、80W功率超声波预处理3min时,其GUS瞬时表达效率最高,分别为14.43%,13.73%,10.85%和75.36%;在最佳转化体系下将GUS基因转入葡萄风信子,获得207株潮霉素抗性植株。GUS组织化学检测结果表明:在抗性植株的不同部位都呈现不同程度的蓝色,PCR检测有7株为阳性植株,阳性率为7%;反转录PCR检测显示,7株阳性植株中有3株扩增出GUS基因目的条带。【结论】初步建立了根癌农杆菌介导的葡萄风信子遗传转化体系,该体系能显著提高葡萄风信子GUS瞬时表达效率。     

石楠抗寒基因AmGS高效转化体系的研究

本研究以石楠为受体材料,利用农杆菌浸染方法开展沙冬青抗寒基因AmGS转化试验,通过对不同的受体材料浸染部位、菌液浓度、乙酰丁香酮和浸染时间对转化材料的死亡率%、分化率%、分化芽数(个)、芽苗长度(cm)以及芽苗颜色的分析,得出最佳转化方法为:采用茎尖为转化材料,菌液浓度为2/3～1/2原液,浸染时间为10 min,添加乙酰丁香酮浓度为25～30 mg/L.其中浸染部位是影响基因高效转化的最主要因素,菌液浓度、乙酰丁香酮和浸染时间的作用次之,经在50 mg/L浓度的卡那霉素培养基筛选培养,获得一批的抗性植株,经PCR检测获得6株转化株系.     

香蕉穿孔线虫观赏植物种群对香蕉的致病性研究

 【目的】为了明确香蕉穿孔线虫（Radopholus similis）观赏植物种群对香蕉（Musa spp.）的致病性。【方法】通过室内盆栽接种测试的方法,研究侵入中国的6个香蕉穿孔线虫观赏植物种群对大蕉、粉蕉、皇帝蕉和巴西蕉的幼苗的致病性。【结果】供试的6个香蕉穿孔线虫观赏植物种群都能明显侵染大蕉、粉蕉和皇帝蕉,并显著抑制大蕉、粉蕉和皇帝蕉的生长;只有2个种群对巴西蕉表现为弱致病,对其生长有一定的抑制。【结论】侵入中国的6个香蕉穿孔线虫观赏植物种群普遍对大蕉、粉蕉和皇帝蕉有明显的致病性,少数种群对巴西蕉有一定的致病作用。     

中华猕猴桃华优遗传转化系统建立研究

为了更好的利用遗传转化技术进行猕猴桃品种改良研究,以中华猕猴桃华优组培苗幼嫩叶片为材料, 研究了外植体分化不定芽再生途径所需的培养条件及转化效率提高方法。结果表明,在叶片不定芽诱导培养基中加 入浓度为0.75~1.0 mg/L 的TDZ 时,叶片愈伤发生率达85.7%~90.1%,不定芽发生率达41.8%~44.6%;在TDZ 1.0 mg/L 基础上,补充0.1~0.4 mg/L IAA 可使叶片愈伤发生率提高到96.7%~100%,不定芽发生率提高到67.4%~71.9 %; 在农杆菌侵染液与共培养基中同时加入75~100 滋mol/L 浓度的AS,可使GUS 瞬时表达率及卡那抗性芽发生率分别 提高至27.9%、14.5%;外植体被农杆菌侵染前,的预培养2~3 d有利于提高GUS 表达率与卡那抗性芽发生率。GUS 染色与PCR 扩增检测结果显示,Shiva A基因已转化至中华猕猴桃华优转基因植株。     

不同施磷量对柱花草侧芽发生的影响

 为了探索不同磷肥施用量对柱花草侧芽发生的影响,以热研2号、有钩柱花草和电白柱花草为材料,设置了3个磷肥（P2O5）水平,分别为每千克土施入磷肥0.2,0.8,1.6g,并以不施磷肥为对照,在温室条件下进行盆栽试验。以累计主茎和侧枝的侧芽数量为指标进行了连续观测和分析。结果表明, 供试柱花草材料的主茎和侧枝的侧芽数是其遗传特性和栽培条件共同作用的结果。不同供试柱花草有利于其侧芽发生的最佳施磷量不同,热研2号柱花草最佳磷肥施用量为每千克土施入磷肥0.2g,其他2个供试柱花草的最佳磷肥施用量为每千克土施入磷肥0.8g。施用磷肥可以促进柱花草主茎侧芽和侧枝侧芽的发生,但对侧枝侧芽发生的影响更大,促进侧枝侧芽的发生可能是磷肥提高柱花草产量的重要途径。     

一种快速分离小麦条锈菌转GUS基因转化体的方法

为了获得更多整合有外源GUS报告基因并且稳定表达的小麦条锈菌毒性突变菌株.探索小麦条锈菌夏孢子转GUS基因遗传转化体的分离方法.以从菌种筛选品种上分离转化体法为主、从繁殖品种辉县红上分离转化体法为辅可有效提高转化体的检出率;建立了利用透明胶带粘取夏孢子并通过染色分离小麦条锈菌转GUS基因转化体的新方法.试验证明,透明胶带粘取夏孢子染色法是一种快速有效分离小麦条锈菌转GUS基因转化体的方法.     

棉花GhCAD6基因表达载体构建及GUS基因的瞬时表达

[目的]以GUS基因为报告基因,构建GhCAD6基因的瞬时表达载体.[方法]采用PCR方法和基因枪法.[结果]用PCR法,以pGEM-T-CAD6质粒为模板,获得GhCAD6基因目的片段.然后将其克隆到瞬时表达载体pRTL2-GUS/NIa中,获得由CaMV35S启动子调控目的基因的pGUS-CAD6融合表达载体,使目的基因能够和GUS基因同时表达.采用基因枪法将pGUS-CAD6转化到洋葱表皮细胞中,暗培养24 h,经GUS组织化学染色,检测到多个洋葱细胞呈现蓝色.[结论]构建的瞬时表达载体可在植物细胞中高效表达,为进一步研究棉花GhCAD6基因的功能奠定了实验基础.     

东莞大蕉超表达拟南芥CBF1基因及其抗寒性检测

【目的】研究超表达拟南芥CBF1基因（AtCBF1）对大蕉抗寒性的影响,为从大蕉克隆抗寒相关基因奠定基础。【方法】采用农杆菌介导法转化东莞大蕉的胚性细胞悬浮系,获得转AtCBF1基因的大蕉植株;利用GUS组织染色、PCR、RT-PCR以及RT-qPCR对转基因植株进行鉴定;比较低温处理后的转基因株系和对照的冷害特征以及超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量等生理生化指标,鉴定转基因大蕉植株的抗寒能力。【结果】试验共获得6个抗性再生转化系。GUS组织染色结果表明,除T1外,其余均为阳性;PCR鉴定结果表明,AtCBF1在6个抗性再生转化系均为阳性,而GUS基因在T1转化系中没有检测出;RT-PCR结果表明,AtCBF1在6个转化系均得到表达,对T1、T2和T3 3个转化系进行RT-qPCR检测发现,AtCBF1基因在3个转基因株系表达水平存在差异;在低温处理下,转基因植株的叶片相对电导率、MDA的累积都低于非转基因植株,而SOD总活性高于对照;低温处理条件下,转基因植株叶片的冷害症状明显轻于对照。【结论】AtCBF1在大蕉中超表达,具有增强大蕉SOD活性,降低因低温导致的MDA含量和离子渗漏率,缓解质膜过氧程度,进而改善大蕉植株抗低温胁迫的能力。     

农杆菌介导的黄瓜炭疽菌遗传转化

建立并优化了农杆菌介导转化瓜类炭疽菌(Colletotrichum lagenarium)获得T-DNA插入突变体体系,包括农杆菌使用浓度、农杆菌与炭疽菌孢子共培养时间、抗生素配合使用抑制农杆菌污染等.所用的转化载体pBIG2RHPH2-GUS-GFP除了抗生素选择标记外还携带有融合GFP-GUS报告基因.转化106个孢子平均可获得约150～200个潮霉素抗性转化子.PCR检测表明,所有潮霉素抗性转化子菌株都能从其基因组DNA中扩增到转化载体中的GUS基因片段,而且都能产生GFP荧光或GUS染色阳性.转化子菌株经过连续继代培养后保持稳定.随机对36个转化子菌株进行致病性测定,发现1个转化子菌株对黄瓜致病性下降,1个丧失致病性,而大多数表现为野生型致病性.农杆菌介导转化瓜类炭疽菌体系的建立,为进一步构建大库容量的T-DNA插入突变体库、致病性突变体筛选以及致病性相关基因的克隆鉴定奠定了基础.     

甜杨葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因的电子克隆及其功能预测

［目的］对甜杨葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PDH）进行克隆及功能预测。［方法］采用电子克隆和RT-PCR相结合的方法首次从甜杨中分离了G6PDH基因,通过Blast和其他生物信息学软件进行功能预测。［结果］甜杨G6PDH基因的cDNA长1697bp,可编码510个氨基酸,cDNA序列及其推导的氨基酸序列均与其他植物G6PDH存在着较高的同源性,说明所获得的cDNA是甜杨G6PDH基因（PsG6PDH,AY445917）。同时,运用PCR扩增技术获得了甜杨G6PDH基因组序列,测序结果表明,基因组DNA长度为5 040bp,含有15个外显子和14个内含子。Southern杂交结果表明,G6PDH基因在甜杨的基因组中可能是单拷贝或者低拷贝。通过网络服务器平台进行PsG6DH的功能预测,结果显示,PsG6PDH为G6PDH的成员之一,含有NADP结合区和G6P结合区2个保守功能域,具有多个磷酸化位点和跨膜区域,但不含有信号肽,表明PsG6DH可能作为膜受体而起作用。另外,G6PDH的电子表达谱分析结果发现,G6PDH在多种组织和不同发育过程均表达,并涉及各种逆境胁迫应答反应,这也说明了G6PDH在植物生长反育中的重要地位。［结论］可为下一步研究PsG6PDH基因的分子功能提供参考。     

虾青素合成关键酶基因bkt和CrtR-B双价植物表达载体的构建及对花生的遗传转化

虾青素是一种具有极强抗氧化活性的类胡萝卜素,具有广泛的应用价值。β-胡萝卜素酮化酶(BKT)和β-胡萝卜素羟化酶(CrtR-B)是虾青素的生物合成途径中的两个关键酶。采用LaTaqDNA聚合酶用PCR的方法分别从pET-28a(+)-bkt,pET-28a(+)-CrtR中扩增得到bkt和CrtR-B基因,用bkt基因替换pBI221中的GUS基因形成含有CaMV 35S启动子和NOS终止子的bkt基因表达盒,然后插入植物表达载体pCAMBIA1301的多克隆位点,再用CrtR-B基因替换pCAMBIA1301中的另一个GUS基因,形成CrtR-B基因表达盒,最终获得带有抗性基因的双价植物表达载体pCAMBIA1301-bkt-CrtR。通过农杆菌EHA105介导将其转入花生(花育23),获得了经卡那霉素筛选的抗性植株,通过PCR扩增验证,花生基因组中含有这两个基因。     

桉树葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)的全基因组分析与进化研究

[目的]对桉树基因组中葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PDH）进行全基因组分析与进化研究。[方法]利用巨桉（Eucalyptus grandsis）全基因组数据,采用BLAST等生物信息学软件分析桉树G6PDH的基因特性、蛋白序列、系统进化树以及启动子特征。[结果]桉树基因组内存在6个G6PDH基因,其编码蛋白中,1个为胞质型G6PDH,5个为质体型G6PDH,而且桉树G6PDH均含有保守基序motif 1、motif 2、motif 3、motif 7、motif 9和motif 11。此外,桉树G6PDH启动子序列中均存在TATA框、增强子与涉及光应答、激素应答、胁迫应答等调控元件。[结论]可为下一步研究桉树G6PDH家族基因的分子功能提供参考。