中国部分地区2005－2007年猪繁殖与呼吸综合征病毒分离株ORF5基因和Nsp2基因遗传变异分析

 【目的】为分析2005－2007年间中国部分省区猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）流行毒株的分子生物学特征,了解其遗传演化规律,查明中国目前PRRSV流行毒株现状。【方法】应用病毒分离方法从中国4个省份在2005－2007年间采集的81份疑似蓝耳病病料中分离到36株猪繁殖与呼吸综合征病毒,应用RT-PCR方法对36株PRRSV现地分离株的ORF5基因和Nsp2基因进行扩增和序列分析。【结果】36株现地分离株均属于美洲型 PRRSV,ORF5基因全长均为603 bp,未发现有基因缺失或插入,编码约200个氨基酸,分离株推导氨基酸序列变异主要发生在9～39位;36个分离株中有15株PRRSV Nsp2基因全长为2 940 bp,21株PRRSV Nsp2基因全长为2 850 bp;发生Nsp2缺失的PRRSV在Nsp2基因第481位、532～560位发生了不连续缺失,共缺失30个氨基酸。与GeneBank中收录的14个PRRSV ORF5、Nsp2基因进行核苷酸及氨基酸序列比较和分析,系统进化关系显示,除B02-2005株可能与疫苗株有关外,多数现地分离株与Ch-1a株遗传距离较近,不同年份分离到的毒株与早期PRRSV分离株的同源性逐年降低。【结论】根据氨基酸变异情况对PRRSV现地分离株进行亚群聚类分析,发现36株现地分离株分别归属于以VR-2332为代表的4亚群,以BJ-4为代表的1亚群和以Ch-1a为代表的２亚群。进化关系表明PRRSV ORF5、Nsp2基因及其推导的氨基酸序列均发生了较大变异,不同地区PRRSV分离株的遗传关系存在交叉现象,地域特征不明显。     

2007－2009年部分猪群PRRSV ORF5和Nsp2基因的克隆与序列分析

【目的】了解2007-2009年部分猪群中猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)株的遗传演化规律。【方法】按常规方法,从2007-2009年收集的疑似蓝耳病猪群组织样品中分离PRRSV,应用RT-PCR方法,对分离的10株PRRSV的ORF5和Nsp2基因进行扩增,测序后与19个PRRSV参考毒株的ORF5、Nsp2基因进行核苷酸、氨基酸序列比较及遗传进化分析。【结果】分离到的SDWF5、SDCX1、LN3、LN8、LN12、SD2、SD5、SD14、ZB1、ZB2共10株PRRSV均属于美洲型PRRSV变异株,其ORF5基因全长均为603bp,编码约200个氨基酸,其推导氨基酸序列变异主要发生在9～39位;SDWF5、SDCX1、LN3、LN12、SD2、SD5、SD14、ZB2等8个分离株的Nsp2基因全长为2845bp,编码950个氨基酸,与代表毒株VR-2332相比,8个分离株在Nsp2基因推导氨基酸序列的480和532～560位发生了不连续的30个氨基酸缺失。与19个PRRSV参考毒株的ORF5、Nsp2序列进行比较后发现,10个分离株的ORF5、Nsp2基因核苷酸序列及其推导氨基酸序列均发生了较大变异。遗传进化分析发现,10个分离株与以CH-1a为代表的国内流行毒株处于同一分支,与JXA1等变异毒株的遗传距离较近。【结论】来源于不同猪群的10个PRRSV分离株的遗传关系存在交叉,没有明显的地域特征,但可能具有相同的始祖Ch-1a。     

PRRSV JX0708株结构蛋白基因的克隆及其生物信息学分析

根据GenBank中登录的美洲型PRRSV JXA1株基因组序列设计合成了4对引物,应用RT-PCR技术对PRRSV JX0708株结构蛋白基因进行扩增、克隆和测序,将测序结果应用Blast和DNAStar软件进行分析,并与国内外分离株进行核苷酸序列以及推导的氨基酸序列同源性比较.结果表明:PRRSV JX0708株结构蛋白基因长约3 186bp,分为ORF2、ORF3、ORF4、ORF5、ORF6和ORF7共6个基因区;与国内分离的高致病性PRRSV美洲型毒株HuN、GD、JXA1、LN和普通毒株CH-1a以及经典毒株VR-2332和疫苗毒株pMLV的核苷酸及其推导的氨基酸同源性分别为88.0%～100.0%和83.5%～100.0%;而与欧洲型经典毒株LV和Euro-1的同源性差异显著,其核苷酸和推导的氨基酸同源性分别为64.0%～69.7%和53.3%～79.9%.遗传进化分析表明,PRRSV JX0708株在基因型上属于美洲型,同时美洲型PRRSV的变异存在某种地域和时间跨度上的相关性,但每个结构蛋白基因的变异并不严格遵从这种规律,而有所差异.     

一株湖北HP-PRRSV分离株nsp2基因遗传变异分析

为了解湖北地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的遗传变异情况和分子流行病学情况,从湖北地区某猪场采集疑似病料进行处理,接种Marc-145细胞,待细胞发生病变后收获病毒,提取病毒总RNA,应用RT-PCR法对PRRSV nsp2部分基因进行扩增,经序列测定,并与美洲株VR-2332、欧洲株Lelystad virus及国内各PRRSV分离株进行核苷酸及其推导的氨基酸进行同源性比较,并绘制系统进化树。结果表明,经RT-PCR扩增获得了PRRSV湖北分离株(命名为HDZZ1)的nsp2基因,核苷酸序列分析显示,获得的nsp2核苷酸与VR-2332的同源性为77. 7%,与Lelystad virus的同源性为44. 3%。其氨基酸与VR-2332的同源性为64. 58%,与Lelystad virus的同源性为13. 93%。证明所获得PRRSV仍为美洲型。与我国分离的高致病性PRRSV毒株07BJ、BJ0708、GD、GDYC、HEB1、Henan-1、HN-HW、HPBEDV、HUB1、HUN4、JXA1、SX-1、SX2009核苷酸同源性高达97. 3%~98. 8%,氨基酸同源性为96. 40%~98. 8%,氨基酸序列分析结果显示,Nsp2蛋白在222位和274-302位两处出现了30个氨基酸的不连续缺失,其Nsp2蛋白的抗原表位发生了改变。系统发生树结果表明,HDZZ1株与高致病性PRRSV毒株位于同一大分支中,与欧洲代表株(Lv)、美国NADC30株和国内NADC30-like HNjz15株处于不同分支中。由此断定,HDZZ1毒株为高致病性PRRSV毒株。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒山西分离株ORF7基因序列分析

采用RT-PCR方法对疑似猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)阳性病料进行克隆和测序,获得2个ORF7基因片段,并对其基因序列和推导的氨基酸序列与国内外毒株进行了同源性比较分析。序列分析结果显示,2个ORF7基因之间核苷酸和氨基酸同源性分别为99.7%和98.4%,其与欧洲型代表毒株LV、美洲型代表毒株VR-2332、高致病性PRRSV变异株(JXA1、HUN4、HEB1、HUB1)及我国早期分离毒株CH-1a的核苷酸同源性分别为65.9%、93.0%～93.3%、97.6%～98.1%、94.6%～94.9%,氨基酸同源性分别为58.1%、93.5%～94.4%、95.2%～96.0%、91.9%～92.7%。遗传进化树分析结果表明,分离的2个ORF7基因与美洲型代表毒株VR-2332亲缘关系较近,属于美洲型,与CH-1a、HB-2(sh)、我国2006年以后分离的10株(JXA1、SD-09、HUB1、HEB1、HUN4、Henan-A14、GD、GDQY2、GZgy15-1、GD-2011)组成同一个亚群。     

豫西地区PRRSV新近流行株ORF5基因变异及Nsp2基因特征分析

为研究豫西地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)新近流行株ORF5基因的变异情况及Nsp2基因的结构特征,采用RT-PCR方法扩增了26份近期采自豫西地区猪场疑似PRRS猪肺脏样品中的ORF5全序列和Nsp2部分序列,并对其生物信息学和结构进行了分析。结果表明:成功扩增出的21株PRRSV流行株间ORF5全基因同源性为96.6%～100%,氨基酸同源性为97.5%～100%;与参考毒株JXA1、MLV、VR-2332和LV的核苷酸同源性分别为96.6%～98.9%、88.4%～89.2%、88.0%～89.5%和66.8%～67.3%;对阳性病料进行了部分Nsp2基因的扩增,测序结果显示,所有流行株的Nsp 2基因与已报道的美洲株VR-2332相比,不存在核苷酸的插入或突变,但存在2个位点共90个碱基的缺失;遗传衍化分析表明,流行毒株属于美洲型。研究结果揭示了豫西地区新近流行的PRRSV ORF5基因的变异情况及Nsp 2基因的特征,为该地区的PRRS防控工作提供了理论依据。     

2006年-2008年河南省PRRSV分子流行病学调查

根据GenBank公布的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ATCC VR-2332株的NSP2,ORF5-7基因的核苷酸序列,设计合成5对特异性引物,用RT-PCR方法扩增出10株PRRSV河南地方株的NSP2和ORF5-7片段,将扩增片段克隆到pMD-18T载体并进行测序。应用DNAStar序列分析软件对分离株的NSP2和ORF5-7基因和其推导的氨基酸序列与不同来源的PRRS毒株进行了同源性比较,结果表明PRRSV河南分离株的NSP2和ORF5-7基因与不同来源美洲型毒株之间的同源性分别为89.1%-98.1%和81.4%-96.1%,而与欧洲型毒株之间的同源性仅为46.7%-61.7%和44.7%-45.9%;同时将PRRSV河南分离株NSP2和ORF5-7基因的推导氨基酸序列与其他美洲型PRRSV毒株进行变异分析比较,证实了PRRSV河南分离株NSP2和ORF5-7基因发生了变异。     

高致病性PRRSV NSP 2基因的扩增与分析

利用软件Oligo6.0设计1对针对PRRSV Nsp2基因的特异性引物,对已检测为PRRSV阳性的病料进行PRRSV Nsp2基因扩增及测序.应用DNAstar软件将所测序列与VR-2332毒株、CH-1a毒株(2001)进行比对,发现JXYC与JXNC毒株的核苷酸序列都有87个碱基连续缺失,在与JX2毒株(2007)VR-2332毒株进行比对时发现有相同的缺失,这说明PRRSV已经发生重大变异,而高致病性PRRSV变异不大.该研究补充和丰富了PRRSV毒株的基因组信息数据及PRRSV的分子流行病学的内容.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒WF-1株的分离鉴定及NSP2和ORF5基因的变异分析

从山东某大型猪场患"猪高热病"的病料中分离到1株病毒,该病毒可在Marc-145细胞上增殖,产生细胞病变。经RT-PCR鉴定证明,该病毒为美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV),将其命名为WF-1株。用RT-PCR法分别扩增该分离株的NSP2基因和ORF5基因,并进行核苷酸序列测定和分析。结果表明,PRRSV WF-1株的NSP2发生30个氨基酸的不连续缺失,缺失位置与PRRSV参考变异株JXA1相同;ORF5基因与JXA1、CH-1a、VR2332核苷酸同源性分别为98.0%、94.2%、86.4%,氨基酸同源性分别为97.5%、94.0%、87.5%。基因遗传进化树分析结果显示,WF-1株与2006～2008年期间分离的JXA1、SX-1等高致病性变异株的亲缘关系很近,与1996年分离的中等毒力毒株CH-1a亲缘关系较远,与VR2332、CC-1、MLV等弱毒株或疫苗株处于不同的分支。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒TJ株的分离与鉴定

从某猪场发生高热死亡的仔猪病料中分离到1株病毒,该病毒在Marc-145细胞上增殖致细胞病变。经RT—PCR检测证明该分离株为美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）。该毒株回归易感动物可产生明显的临床症状,并引起死亡,将其命名为PRRSV TJ毒株。对其Nsp2序列进行扩增测序,结果表明：与美洲标准毒株VR-2332相比,TJ株Nsp2序列缺失第481位和第532～560位氨基酸,二者核苷酸同源性为83．7％,其编码的氨基酸同源性为77．9％。本试验结果表明,该分离株为发生了变异的PRILSV,对猪具有高致病性。     

新疆猪繁殖与呼吸综合征病毒分离鉴定及Nsp2和ORF5基因遗传变异分析

为探索新疆猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的变异特征,利用RT-PCR、ORF5和部分NSP2基因序列进行分析,鉴定从新疆某猪场疑似猪高热病死亡猪肺脏分离出的一株病毒.分离的病毒株被鉴定为PRRSV美洲型,命名为XJ-Q株.该株病毒与香港分离株HK13亲缘关系最近,与国内变异株(HUB1和JXA1)同源性较为亲近.与美洲型标准毒株VR-2332相比,该分离株在481位和532～560位共有30个氨基酸缺失;与国内分离的PRRSV变异株相比,在487～489位有3个氨基酸的独特缺失.结果表明,新疆分离株为PRRSV美洲型,属于新缺失的PRRSV毒株.     

新疆猪繁殖与呼吸综合征病毒分离鉴定及Nsp2和ORF5基因遗传变异分析

为探索新疆猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的变异特征,利用RT-PCR、ORF5 和部分NSP2 基因序列进行分析,鉴定从新疆某猪场疑似猪高热病死亡猪肺脏分离出的一株病毒。分离的病毒株被鉴定为PRRSV 美洲型,命名为XJ-Q 株。该株病毒与香港分离株HK13 亲缘关系最近,与国内变异株（HUB1 和JXA1）同源性较为亲近。与美洲型标准毒株VR-2332 相比,该分离株在481 位和532~560 位共有30 个氨基酸缺失;与国内分离的PRRSV 变异株相比,在487~489 位有3 个氨基酸的独特缺失。结果表明,新疆分离株为PRRSV 美洲型,属于新缺失的PRRSV毒株。     

猪繁殖与呼吸综合征流行株ORF5基因遗传变异分析

[目的]分析猪繁殖与呼吸综合症（PRRS）发病原因、流行趋势,为预防和控制PRRSV提供理论依据。[方法]根据GenBank上的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）ATCCVR-2332的全基因序列,设计并合成引物,采用RT—PCR技术扩增了7株流行株（HIJ10,HL148,HLJ64,HLJ76,HL177,HLJ85,HLJ87）中的ORF5基因序列。应用DNAStar软件分析所测序列,并与ATCCVR-2332、CH-1a、BJ-4、LV及疫苗株MLV进行序列比较。同时用系统进化树分析了分离株之间的亲缘关系。[结果]核苷酸序列分析表明这7株流行株中ORF5基因与VR-2332、CH—1a、BJ-4等代表株的同源性分别为88．1％～98．8％,89．9％～95．2％,85．6％～98．7％;与LV的同源性为54．7％～56．9％。氨基酸序列分析表明这7株流行株与VR-2332、CH-1a、BJ4等代表株的同源性分别为88．1％～96．8％,88．1％～94．5％,86．1％～96．5％;与LV的同源性为54．7％～56．2％。通过系统发育进化树分析可知HLJ48、HL164、HLU6、HLJ77、HLJ85与CH-1株亲缘关系密切,同属一亚群,表明所获得的毒株与参考株CH．1亲缘关系较近,可能由CH-1演化而来。HLJ10、HU87与疫苗株MLV关系较近,而且HLJ10、HLJ87的同源性高达100％,可能由于使用疫苗而感染,说明黑龙江省存在疫苗毒的隐性感染。[结论]流行株在ORF,基因区域的变异较大,同一地域分离株间ORF,基因序列同源性较高且亲缘关系较近,不同地域则较远。     

高致病性PRRSV TJ株和致弱毒TJM株Nsp2测序及结构分析

参照GenBank中PRRSV VR-2332株全序列设计特异性引物,扩增高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)TJ株和其致弱毒株TJM株非结构蛋白2(Nonstructure protein 2,Nsp2)编...     

猪繁殖与呼吸综合症流行株ORF_5基因遗传变异分析

[目的]分析猪繁殖与呼吸综合症发病原因,流行趋势,为预防和控制猪繁殖与呼吸综合症病毒（PRRSV）提供理论依据。[方法]根据GenBank上的PRRSV的ATCCVR-2332的全基因序列,设计并合成引物,采用RT-PCR技术扩增了7株流行株中的ORF5基因序列。应用DNAStar软件分析所测序列,并与ATCCVR-2332、CH-1a、BJ-4、LV及疫苗株MLV进行序列比较。同时用系统进化树分析了分离株之间的系统进化树。[结果]核苷酸序列分析表明这7株流行株中ORF5基因与VR-2332、CH-1a、BJ-4等代表株的同源性分别为88.1%～98.8%,89.9%～95.2%,85.6%～98.7%;与LV的同源性为54.7%～56.9%。氨基酸序列分析表明,这7株流行株与VR-2332、CH-1a、BJ-4等代表株的同源性分别为88.1%～96.8%,88.1%～94.5%,86.1%～96.5%;与LV的同源性为54.7%～56.2%。[结论]流行株在ORF5基因区域的变异较大,同一地域分离株间ORF5基因序列同源性较高且亲缘关系较近,不同地域则较远。