GC含量丰富的人I型原胶原蛋白基因片段克隆及其序列分析

鉴于做转基因牛羊乳腺生物反应器的需要,根据GenBank中所公布的人I型原胶原蛋白基因序列设计引物,利用健康人的胎盘中提取的基因组DNA为模板,通过优化的长距离PCR,成功地克隆出GC含量丰富的人I型原胶原基因组DNA片段,序列测定与分析的结果显示中国人I型原胶原蛋白基因组DNA片段与GenBank中所公布出来的序列所对应的部分有99.5%的同源性,其中外显子部分与GenBank中的对应部分完全一致;而在内含子中,本研究克隆到的基因与GenBank中公布出来的序列有不少差异,尤其表现在内含子1和2中,其中内含子2要比GenBank中公布的基因内含子2多出14个碱基,这14个碱基具体有什么作用尚需要进一步阐明,内含子间的差异凸显了东西方人种之间基因序列的多态性。     

豌豆早期结瘤素基因PSSYMl0的克隆及其表达载体的构建

采用PrimStar HS DNA聚合酶从碗豆基因组DNA中扩增出了碗豆早期结瘤素基因PsSYM10.序列分析结果表明,所克隆的基因与GenBank公布的同源基因在碱基和氛基酸序列上的相似性分别为98.6%和99.7%.将PsSYM10基因与结瘤相关基因PsENOD12,凝集素基因PsLectin串联组合,构建成了双元表达载体.     

豌豆早期结瘤素基因PsSYM10的克隆及其表达载体的构建

采用Pri mStar HS DNA聚合酶从豌豆基因组DNA中扩增出了豌豆早期结瘤素基因PsSYM10.序列分析结果表明,所克隆的基因与GenBank公布的同源基因在碱基和氨基酸序列上的相似性分别为98.6%和99.7%.将PsSYM10基因与结瘤相关基因PsENOD12、凝集素基因PsLectin串联组合,构建成了双元表达载体.     

几个棉花纤维突变体及纤维发育相关基因的初步分析

用4个陆地棉纤维突变体、1个亚洲棉纤维突变体及其对应的正常型品种作为研究材料,对纤维发育相关基因结构差异比较。根据GenBank公布的基因序列设计基因特异引物,分别在突变体与正常型棉花品种的基因组DNA中进行PCR扩增。经凝胶电泳检测发现：部分纤维发育相关基因在突变体与正常型材料之间存在显著的结构差异。用脱水诱导蛋白RD22基因、葡聚糖酶基因和肌动蛋白基因为模板设计引物,并将扩增的片段克隆测序,经Blast比对后发现克隆的3条序列与设计引物所用的基因序列同源性均在95%以上。该研究结果可为纤维发育相关基因的分子生物学研究提供依据。     

信阳水牛GH基因多态性与部分生长性状的相关性

采用PCR-SSCP及DNA测序技术,以106头信阳水牛为材料,采集血样,提取基因组DNA,以GenBank公布的牛GH基因序列（NC₀07317）为参照序列,设计PCR引物,对GH基因的第2、3外显子及部分内含子进行了遗传变异检测,并将其多态性与部分生长性状进行了相关分析。结果表明:每个位点的PCR产物经SSCP分析均出现不同的带型,第2外显子存在1处SNP（G413A）,第2内含子存在4处SNPs（G495C,A523C,A541G,G699A）,信阳水牛GH基因的GH-P3位点的多态性与部分生长性状没有显著相关性。     

信阳水牛GH基因多态性与部分生长性状的相关性

本研究采用PCR-SSCP及DNA测序技术,以106头信阳水牛为材料,采集血样,提取基因组DNA,以GenBank公布的牛GH基因序列(NC_007317)为参照序列,设计PCR引物,对GH基因的第2、3外显子及部分内含子进行了遗传变异检测,并将其多态性与部分生长性状进行了相关分析。结果表明:每个位点的PCR产物经SSCP分析均出现不同的带型,第2外显子存在1处SNP(G413A),第2内含子存在4处SNPs(G495C,A523C,A541G,G699A),信阳水牛GH基因的GH-P3位点的多态性与部分生长性状没有显著相关性。     

番茄质体转化载体pTom-GFPaadA的构建

采用PrimStar HS DNA聚合酶从番茄基因组DNA中扩增出了质体的trnI-trnA基因序列.序列分析结果表明,所克隆的基因与GenBank公布的序列完全相同,与烟草的trnI-trnA基因序列同源性高达94%.将该片段作为定点整合外源基因的同源重组片段,构建成包含Prrn::gfp-aadA::TpsbA表达盒的番茄质体定点转化载体pTom-GFPaadA,酶切鉴定表明,所构建的载体符合预期设计.     

绵羊TTF-1基因分子克隆及序列分析

以经产小尾寒羊母羊基因组DNA为模板,利用特异性引物对P1和P2对绵羊甲状腺转录因子-1(TTF-1)基因进行扩增,克隆入pGEM-T载体.转化后挑取阳性克隆进行酶切与测序鉴定,并对获得的TTF-1基因序列及推导的氨基酸序列进行生物信息学分析.结果表明,扩增的绵羊TTF-1基因序列长度为1 459 bp,包括部分外显子1、外显子2序列以及内含子,共编码174个氨基酸.该基因与GeneBank报道牛、狗、猪、人、和小鼠的基因序列同源性分别为98.7%、98.3%、97.5%、96.6%和96.6%.内含子与猪、人、鼠的内含子同源性为83.7%、74.9%和59.5%.     

油菜(Brassica napus L.)BnPGIP基因克隆及其表达分析

以油菜品系甘蓝型油菜宁RS-1为植物材料,以南京油菜田里收集的核盘菌为致病菌,根据已经报道的油菜PGIP基因序列,设计简并引物。从宁RS-1基因组DNA中经PCR克隆到1条包含1个内含子与2个外显子的基因序列。序列比对分析显示,该基因与已公布的油菜PGIP1基因的核苷酸序列和氨基酸序列同源性均达99％,编码区序列全长9...     

山核桃FLOWERING LOCUST同源基因的克隆与序列分析

根据不同植物FLOWERING LOCUST（FT）同源基因序列的保守区,设计合成1对长度为18bp的PCR简并引物,以山核桃基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增出长度为152bp的DNA片段,克隆到pMD19-T载体上。测序及序列分析结果表明,扩增所获得的片段序列为FT基因第四外显子部分序列,不含内含子,推测共编码50个氨基酸;其序列在GenBank中注册号为FJ858260．1,同源性比对结果表明,其氨基酸序列与其他植物FT基因的同源性高达88％～96％。     

毛叶枣APETALA1同源基因的克隆

分析在植物花分子生组织及花器密形成过程中起重要作用的APETALA1（AP1）基因的保守区序列，设计1对长度为23pb的PCR引物，以毛叶枣基因组DNA为模板，采用PCR方法扩增出长为648bp的DNA片段，克隆人pUCm-T载体，测序和序列分析结果 表明获得了毛叶枣AP1同源基因中部的1个片段，该片段有2个内含子，长度分别为152bp和386pb，编码区共编码36个氨基酸，其序列已在GenBank中登记（登记号为AF356541）,在GenBank中进行同源性检索，结果表明其氨基酸序列与其他植物AP1同源基因的氨基酸序列同源性高达66％－88％，推测它们在功能上也是相似的。     

Cloning of TaCYP707A1 Gene that Encodes ABA 8'-Hydroxylase in Common Wheat (Triticum aestivum L.)

The plant hormone abscisic acid (ABA) regulates many important physiological and developmental processes in plants.The objective of this study was to clone the ABA 8'-hydroxylase gene in common wheat. In the present study, we used the cDNA sequence of barley HvCYP707A1 gene (GenBank accession no. AB239299) as a probe for BLAST search against the common wheat (Triticum aestivum L.) EST database in GenBank. All wheat ESTs sharing high similarity with the reference gene were subjected to contig assembly. Primers were designed based on the constructed contigs to clone the wheat CYP707A1 gene, designated as TaCYP707AI. The genomic DNA sequence of TaCYP707A1 gene comprised five exons and four introns, with a size of 2 225 bp. The corresponding cDNA sequence of TaCYP707A1 was 1 737 bp,containing an open reading frame (ORF) of 1 431 bp, a 42-bp 5'-untranslated region (UTR) and a 264-bp 3'UTR, with 94.9% of identical sequences to HvCYP707A1 gene (AB239299). The neighbor joining tree indicated that the deduced amino acid sequences of TaCYP707A1 gene was highly similar to those of barley and rice. The TaCYP707A1 gene was located on chromosome 6BL using a set of Chinese Spring nullisomic-tetrasomic lines and ditelosomic line 6BS. These results will be of high importance in understanding of molecular mechanism of ABA catabolism.     

奶牛白细胞介素-2基因的克隆及序列分析

根据GenBank上发表的牛IL-2(M13204)基因序列,应用Primer Premier5引物设计软件自行设计一对引物,以ConA刺激培养24 h的奶牛外周血淋巴细胞为材料,从总RNA中扩增出奶牛IL-2基因,然后测序.结果表明克隆的奶牛IL-2基因大小477 bp,编码158个氨基酸,与GenBank上发表的牛IL-2基因序列比较,其核苷酸的同源性99.4%,与马、猪、猫、狗、山羊、绵羊的核苷酸的同源性分别为31.8%,32.0%,31.6%,30.3%,30.8%,31.0%.     

大白菜PAT1基因的克隆及其表达载体的构建

根据GenBank中大白菜（Brassica campestris L ssp．pekinensis）基因组测序结果,分析了大白菜PAT1（phytochrome A sjgnal transduction）基因的内含子和外显子。通过拼接外显子,获得了大白菜PAT1基因的cDNA编码序列。根据编码区序列,设计并合成了一对引物;利用这对引物,采用RT—PCR技术扩增出大白菜福山包头PAT1基因（CcPAT1）的全长cDNA序列。CcPATl编码区共1500bp,与拟南芥PAT1相似性为85．03％。同时构建了含有35S启动子的pCAMBIA-2300-CcPAT1过表达载体,并利用以PAT1 5’端特异区域构建了pFGC-1008-PAT1RNAi（RNA interference）载体,以备将来研究大白菜CcPAT1基因的功能。     

山核桃APETALA1同源基因的克隆与序列分析

根据植物花分生组织及花器官形成过程中起重要作用的APETALA1（AP1）基因的高度保守区序列,设计合成一对长度为23bp的聚合酶链式反应（PCR）引物,以山核桃Carya cathayensis因组DNA为模板,采用PCR方法扩增出长为486bp的DNA片段,克隆到pMD18-T载体。测序和序列分析结果表明,获得了山核桃AP1同源基因中的1个片段,该片段序列包含2个内含子,长度分别为86bp和291bp,编码区共编码36个氨基酸。其序列已在Gen荷Bank中注册（注册号为EU155118）,在Gen Bank中进行同源性检索结果表明,其氨基酸序列与其他植物AP1同源基因的氨基酸序列同源性高达69％～88％,推测它们在功能上也是相似的。     

牦牛心脏脂肪酸结合蛋白(H-FABP)基因的克隆及序列分析

【目的】对牦牛H-FABP基因进行克隆和序列分析，以期为进一步开展牦牛该基因与其肉质性状的相关分析，进行分子标记辅助选择以及基因定位、表达等研究提供理论基础。【方法】用特定引物对牦牛H-FABP基因进行PCR扩增并进行T-A克隆和测序，在此基础上使用RepeatMasker、DNAMAN4.0、BioEdit4.8.10、Clustal W1.81等生物信息学软件进行序列分析。【结果】牦牛H-FABP基因(已在NCBI上登录，登录号为DQ026674)由4个外显子和3个内含子组成，CDS序列全长为402 bp，前体氨基酸数为133个。4个外显子大小分别为73 bp、173 bp、102 bp和54 bp；3个内含子大小分别为3 460 bp、1 892 bp和1 495 bp；外显子与内含子的连接区序列遵循通常的基因组成规律。外显子和内含子个数与普通牛、绵羊、山羊、猪、人、大鼠、小鼠、鸡、斑马鱼各物种相同。牦牛H-FABP基因序列中，重复序列所占比率为13.07%。内含子Ⅰ含有5个重复元件，包括1个SINE/Artiodactyls元件、1个SINE/MIR3元件、1个SINE/Bov-tA1元件和2个SINE/MIR元件；内含子Ⅱ无重复元件；内含子Ⅲ有3个重复元件，其中SINE/MIR元件、LINE/L2元件、SINE/Artiodactyls元件各1个。SINEs短重复序列所占比率为11.85%，哺乳动物分散性重复序列MIRs比率为6.44%。LINEs所占比率为1.22%，小于SINEs元件。其中，LINE1、BovB/Art2、L3/CR1重复元件以及LTR类反转录元件和DNA转座子元件在牦牛该基因区域中不存在。不同物种间在该基因编码区核苷酸序列和氨基酸序列上有较高的保守性。牦牛与普通牛、绵羊、山羊、猪、人、大鼠、小鼠、鸡、斑马鱼各物种在H-FABP基因编码区核苷酸序列上同源性大小分别为99.8%、97.8%、97.0%、92.8%、88.8%、83.3%、83.1%、76.4%、68.7%；相应的氨基酸序列间同源性大小为100%、96.9%、96.9%、92.4%、88.7%、85.7%、85.7%、77.4%、69.9%。【结论】牦牛H-FABP基因由4个外显子和3个内含子组成，其中外显子I、外显子Ⅱ、 外显子Ⅲ 和外显子Ⅳ大小分别为73 bp、173 bp、102 bp和54 bp，内含子I、内含子Ⅱ和内含子Ⅲ大小分别为3 460 bp、1 892 bp和1 495 bp。牦牛该基因区域含有较为丰富的重复序列元件且外显子与内含子的连接区序列遵循通常的基因组成规律。牦牛与普通牛、绵羊、山羊、猪、人、大鼠、小鼠、鸡、斑马鱼9个物种在H-FABP基因编码区核苷酸及氨基酸序列上具有较高的保守性。     

北方梭囊孔菌漆酶基因DNA片段的克隆与序列分析

根据报道的10几种真菌漆酶氨基酸序列的保守区域设计了一对简并引物,以北方梭囊孔菌总DNA为模板,通过PCR扩增到一个1 201 bp的基因片段.将片段序列在NCBI的BLAST软件上进行同源性搜寻,显示99个序列,全部为漆酶基因及其类似基因,因而认为克隆到的片段就是北方梭囊孔菌漆酶基因片段.经过与同源性最高的粗毛革孔菌（laccase lcc1）同一区段编码区序列进行ClustalW比较,其中有6个间隔区,确定为内含子区.去除内含子后,推导的氨基酸序列为286个残基.经与其他几种真菌漆酶的氨基酸序列进行ClustalW比对,同源性均在51%以上.      

Cloning of TaCYP707A 1 Gene that Encodes ABA 8′-Hydroxylase in Common Wheat（Triticum aestivum L.）

The plant hormone abscisic acid （ABA） regulates many important physiological and developmental processes in plants. The objective of this study was to clone the ABA 8′-hydroxylase gene in common wheat. In the present study, we used the eDNA sequence of barley HvCYP707A1 gene （GenBank accession no. AB239299） as a probe for BLAST search against the common wheat （Triticum aestivum L.） EST database in GenBank. All wheat ESTs sharing high similarity with the reference gene were subjected to contig assembly. Primers were designed based on the constructed contigs to clone the wheat CYP707A1 gene, designated as TaCYP707A1. The genomic DNA sequence of TaCYPTO7A1 gene comprised five exons and four introns, with a size of 2225 bp. The corresponding cDNA sequence of TaCYP707A1 was 1737 bp, containing an open reading frame （ORF） of 1431 bp, a 42-bp 5′-untranslated region （UTR） and a 264-bp 3′UTR, with 94.9% of identical sequences to HvCYP707A1 gene （AB239299）. The neighbor joining tree indicated that the deduced amino acid sequences of TaCYP707A1 gene was highly similar to those of barley and rice. The TaCYP707A1 gene was located on chromosome 6BL using a set of Chinese Spring nullisomic-tetrasomic lines and ditelosomic line 6BS. These results will be of high importance in understanding of molecular mechanism of ABA catabolism.     

牛ME1基因cDNA编码序列的克隆与分析

在NCBI中GenBank里查询已登录的牛的ME1 mRNA序列(GenBank Accession:XM-613987),发现其1-69 bp序列与已知的人、猪和小鼠的ME1基因mRNA序列没有任何相似性,因此,认为这段序列有误。研究利用人的ME1基因mRNA序列作为电子探针共找到44段牛的相关ESTs序列,然后利用此ESTs重叠群拼接成的序列设计了三对引物。提取牛的肝脏和肌肉总RNA,从中克隆测序得到M1为525 bp、M2为1039 bp和M3为1171bp的三段序列,拼接成长度为2015 bp的序列。此段序列与前述ESTs重叠群一致序列完全相同,并与人、猪和小鼠的ME1基因mRNA序列相似性分别达89%、85%和84%,从而证实了本序列的正确性。本序列已在NCBI登录(GenBank Accession:FJ495084)。研究为进一步研究牛的ME1基因结构提供了真实的序列信息。