昆虫病原线虫共生细菌嗜线虫杆菌和发光杆菌的型变

嗜线虫杆菌(Xenorhabdus spp.)和发光杆菌(Photorhabdus spp.)是与昆虫病原线虫互惠共生的细菌,Xenorhabdus和Photorhabdus的一个显著特点是在共生菌体外培养期间出现细胞的型变,其型变的发生在几个方面不同于传统的型变.本文就近年来有关共生菌型变的生物学、遗传学等方面的研究进行了概述.     

嗜线虫致病杆菌YL001 cpxR基因敲除突变株的构建及其抑菌活性研究

【目的】通过同源重组技术敲除嗜线虫致病杆菌(Xenorhabdus nematophila)YL001中cpxR基因,为进一步研究CpxR调节子调控抗菌物质产生的机理奠定基础。【方法】通过融合PCR技术,将cpxR基因的上、下游同源片段及质粒pJCV53上的卡那抗性基因Kmr 3个片段连接,克隆到自杀载体pDM4中,将重组质粒转化到大肠杆菌S17-1λpir中,经接合转移导入嗜线虫致病杆菌内,通过同源重组敲除cpxR基因;采用琼脂扩散法和抑制菌丝生长速率法分别测定突变菌株对枯草芽孢杆菌和番茄灰霉病菌的抑制作用。【结果】从X.nematophila YL001基因组中成功敲除cpxR基因,得到了ΔcpxR突变菌株;ΔcpxR突变菌株对枯草芽孢杆菌和番茄灰霉病菌的抑制作用较野生菌株分别提高了1.4和1.7倍。【结论】CpxR负向调控嗜线虫致病杆菌YL001抗菌物质的产生。     

暹罗鳄致病性嗜水气单胞菌嗜水亚种的分离鉴定

对海南陵水某鳄鱼养殖场发病死亡鳄鱼进行病理解剖和病原分离鉴定,获得的分离菌株为革兰氏阴性杆菌,其培养特性、生化反应等与嗜水气单胞菌嗜水亚种生化特性基本一致,两者的16S rRNA基因序列同源性高达99.9%,在系统发育树中与嗜水气单胞菌嗜水亚种同属一发育分支。该菌的人工感染试验和药物敏感试验结果表明:分离菌株对NIH小鼠的半数致死量(LD50)为2.5×105/只,具有较强的致病作用;在耐药性上,该菌株对丁胺卡那霉素、环丙沙星、氟苯尼考等13种抗生素敏感,对红霉素、氨苄青霉素、青霉素、阿莫西林、链霉素、克林霉素及萘啶酸等9种抗生素有耐药性。     

赣南地区番茄青枯菌菌系多样性分析

【目的】分离鉴定赣南地区番茄青枯病菌,明确菌系分化,为当地番茄抗青枯病育种和病害防治奠定基础。【方法】从江西省赣南地区采集番茄青枯病病株,经选择性平板分离、纯化和分子鉴定,获得不同地理来源的青枯菌Ralstonia solanacearum菌株。通过生理生化测定和接种番茄试验,鉴定青枯菌的生化变种和致病类型。PCR扩增内切葡聚糖酶基因egl序列,明确青枯菌的演化型和序列变种。双层平板培养法测定其对8个不同噬菌体的敏感性。【结果】获得了来自赣南地区9个市(县)的番茄青枯菌菌株44个,其中,41个菌株为生化变种Ⅲ,3个菌株为生化变种Ⅳ;致病力测定结果聚为I、II和III类,其致病力分别为强、中和弱,其中,强致病力菌株占65.9%。所有菌株属于亚洲分支演化型(Ⅰ),并进一步划分为Sequevar13、14、15、17、18、34、44和48等8个序列变种。大部分菌株对供试的8个噬菌体敏感。【结论】赣南地区番茄青枯菌以生化变种III和强致病力菌株为主,对噬菌体较敏感,存在8个序列变种,具有明显的菌系分化现象和遗传多样性。     

蜡样芽胞杆菌NJSZ-13致死松材线虫的因子

蜡样芽胞杆菌NJSZ-13对松材线虫有较高的致死作用。为了明确蜡样芽孢杆菌NJSZ-13对松材线虫的致死因子，探讨了蜡样芽胞杆菌NJSZ-13对松材线虫的作用机制。首先将NJSZ-13菌悬液处理的松材线虫体表彻底消毒并研磨后涂含青霉素的抗性平板，并通过荧光显微镜观察线虫虫体上含gfp荧光质粒的NJSZ-13菌体以明确菌株在线虫虫体上的存在位置。然后测定菌株与松材线虫混合后上清液及其中胞外蛋白粗提物的杀线活性，并测定虫菌混合液的吸光度，观察菌体繁殖量的变化。结果表明：松材线虫体表彻底消毒研磨后涂布抗性平板未长出菌落，且在松材线虫体表观察到菌株NJSZ-13。菌株与松材线虫混合并静置48 h后，其上清液无显著杀线活性。菌株与松材线虫混合并摇培4 d后，上清液中胞外蛋白粗提物浓缩10倍后具有较高的杀线活性，处理松材线虫48 h后的松材线虫死亡率达到66.23%。粗提物经沸水浴30 min后处理松材线虫，线虫死亡率显著降低，处理48 h后松材线虫死亡率仅有23.88%。菌株与松材线虫混合并摇培1 d后，虫菌混合液的吸光度开始显著高于菌液的吸光度，此后两者吸光度下降明显，摇培2至10 d期间，虫...     

两株番茄细菌性斑点病拮抗放线菌的鉴定及功能基因筛查

本研究从分离自新疆巴里坤盐湖的放线菌中筛选到两株抗菌活性放线菌GWB1-7和ZW2-11,该菌株对番茄细菌性斑点病致病菌(丁香假单胞杆菌番茄致病变种,Pseudomonas syringae pv.tomato)具有显著的抗菌活性。采用平板对峙法对上述菌株进行菌株拮抗分析,并对其进行菌株形态观察、系统进化树分析及抗生素合成相关功能基因筛查。结果表明：放线菌GWB1-7和ZW2-11不仅对丁香假单胞杆菌番茄致病变种具有显著抗菌活性,而且对大肠杆菌(Escherichia coli)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的拮抗作用明显;放线菌GWB1-7在进化关系上与拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis)放线菌最相近,而放线菌ZW2-11同链霉菌属(Streptomyces)放线菌聚类在相同的分支;这两株菌均携带有Nrps和Aph基因,另外GWB1-7菌株中还含有I型Pks基因,而ZW2-11菌株还含有II型Pks基因。放线菌GWB1-7和ZW2-11的鉴定及抗生素合成相关功能基因的筛查,为后期分离这些菌株中的活性代谢产物奠定理论基础。     

2株昆虫病原线虫共生菌的分离与初步分类鉴定

从陕西杨凌采集的昆虫病原线虫S teinernem a sp.YL 001和S teinernem a sp.YL 002肠道内分别分离到1株具有较高杀虫和抑菌活性的共生菌菌株YL 001和YL 002,并对其从形态特征、培养特性及生理生化特征等方面进行了鉴定。结果表明,YL 001和YL 002菌株分别为嗜线虫致病杆菌(X enorhabdus nem a toph ila)和伯氏致病杆菌(X enorhabdus bov ien ii)。     

昆虫病原线虫共生细菌的分子鉴定及其培养特性的初步研究

【目的】确定昆虫病原线虫共生细菌YL001和YL002菌株的分类及其系统进化地位,并为该类生物资源的后续研究及开发应用奠定基础。【方法】对YL001和YL002菌株进行分子鉴定,PCR扩增并克隆其16SrRNA全序列,对其全序列进行了序列测定及系统进化分析,并采用参数测定法对其培养特性进行了初步研究。【结果】YL001和YL002菌株与嗜线虫致病杆菌(Xenorhabdus nematophila)种内菌株形成一个类群,序列同源性大于99%,与发光杆菌(Photorhabdus)属内菌株的序列同源性大于94%。2菌株的延缓期、对数生长期、稳定期和衰亡期分别为0~6,6~18,18~66和66 h;培养12 h后,YL001和YL002菌株发酵液的pH值分别降低至5.70和5.56,此后逐渐上升,至发酵结束时其pH值分别为7.74和8.07;培养0~18 h时2菌株发酵液中还原糖含量迅速降低,此后保持稳定;12 h时氨基氮含量达到最低,此后开始缓慢上升;YL001菌株培养54 h后及YL002菌株培养42和66 h后,其对番茄灰霉病菌和枯草芽孢杆菌的抑制作用最强。【结论】YL001和YL002菌株属于嗜线虫致病杆菌种内的菌株;YL001和YL002菌株的培养特性符合细菌生长和代谢的一般规律,其适宜的发酵周期分别为54和66 h。     

一株拮抗葡萄灰霉病的嗜线虫致病杆菌发酵条件优化

【目的】分析单因素试验和响应面法优化嗜线虫致病杆菌(Xenorhabdus nematophila-ALL)对葡萄灰霉菌抑菌活性的发酵条件,提高拮抗菌(ALL)对灰葡萄孢菌丝的抑制率,为Xenorhabdus nematophila-ALL菌株发酵生产及生物防治应用奠定基础。【方法】以菌丝抑制率为指标,经菌丝生长速率法,单因素试验及Box-Behnken设计对菌株发酵条件进行优化,确定菌株最佳发酵抑制条件。【结果】最佳培养条件为培养基初始pH值改为7.12,装液量为56％,发酵培养时间为77 h。经验证的抑制率为87.70％,比优化之前提高了1.82倍。【结论】发酵条件优化有效提高了嗜线虫致病杆菌对葡萄灰霉菌的抑菌活性。     

昆虫病原线虫共生菌筛选及其发酵液抑菌活性初步研究

对分别采自陕西杨凌、汉中、渭南、太白4地区的315份土样进行了昆虫病原线虫筛选及其共生菌分离,得到2种昆虫病原线虫及1株Ⅰ型昆虫病原线虫共生菌。Ⅰ型昆虫病原线虫共生菌经初步鉴定为致病杆菌属(X enorhabdus)的嗜线虫致病杆菌种(X enorhabdus nem a toph ilus)内的一个变种;对其抑菌活性研究结果表明,Ⅰ型昆虫病原线虫共生菌发酵液对植物病原真菌菌丝生长具有不同程度的抑制作用,其中对小麦纹枯病菌与辣椒疫霉病菌有强烈的抑制作用,对番茄灰霉病菌孢子萌发有延缓作用。     

嗜线虫致病杆菌CB6菌株胞内外杀虫蛋白的纯化及比较研究

 【目的】分离和纯化嗜线虫致病杆菌北京变种（Xenorhabdus nematophila var. pekingensis）CB6菌株胞内和胞外杀虫蛋白，鉴定其蛋白种类。为进一步利用此类杀虫蛋白奠定基础。【方法】采用硫酸铵沉淀、DEAE Sepharose FF离子交换柱层析、Butyl Sepharose FF疏水柱层析和Sephacryl S-200 HR凝胶过滤对该类蛋白进行分离和纯化，采用Native-PAGE和SDS-PAGE技术对所纯化蛋白进行组分分析。【结果】获得达电泳纯的胞内杀虫蛋白E1和胞外杀虫蛋白E2。以2.58 μg•ml-1含量E1、以4.21 μg•ml-1含量E2喂饲棉铃虫初孵幼虫，对幼虫的生长抑制率分别达62.63％和97.9％。E1、E2经相同纯化参数处理获得的洗脱图相似，经native-PAGE和SDS-PAGE呈现出相似的单带电泳图谱。SDS-PAGE测得E1、E2表观分子量大于212 kD，该杀虫蛋白在60℃仍表现出较强的活性。电泳染色结果表明该类蛋白非糖蛋白也非酯蛋白。【结论】CB6菌株胞内杀虫蛋白E1和胞外杀虫蛋白E2可能是同一种（类）蛋白。     

内生拮抗菌株AC8在甘蓝体内的定殖及其促生效果

为了研究内生拮抗菌株AC8在甘蓝植株体内的定殖及其促生效果,试验通过连续多代抗性筛选,获得了抗利福平300 μg/mL且能稳定生长的菌株.除喷雾法外,浸种法、浸根法、伤茎法、伤叶法均可使AC8菌株侵入甘蓝植株内,并且在根内的定殖能力最强,茎内的定殖能力相对较弱,叶内的定殖能力最弱.在甘蓝的2～3叶期和4～5叶期,与对照相比,AC8菌株处理后的甘蓝植株林高分别增加了27.4％和24.8％,根长分别增加了51.1％和36.1％,鲜重分别增加了19.0％和16.3％,干重分别增加了18.1％和16.7％,反映出AC8菌株对甘蓝有明显的促生作用.     

我国栎属十一种树木叶的化学分析及其利用的可能性

作者测定了短柄枹栎、锐齿槲栎、扁果麻栎、北方麻栎、蒙古栎、白栎、栓皮栎、北京槲栎、麻栎、槲栎、辽东栎等11种树叶中的蛋白质、氨基酸、矿质元素和微量元素的含量,并在种间进行了比较,阐述了这些成分的含量与生长季节、生长地区、树种本身的关系,为探讨种间的化学分类提供部分数据。分析表明这些栎叶的蛋白质含量在9.8—17.9％之间,均含有18种氨基酸,但各种之间的含量差别很大,其中含量较高的氨基酸有天门冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、亮氨酸,苯丙氨酸、赖氨酸、精氨酸,含量较低的氨基酸有胱氨酸、蛋氨酸、组氨酸、色氨酸。在各种间氨基酸的组成和含量有共同的变化趋势,但个别氨基酸在种间有较大差别。 各种栎叶的矿质元素含量也有各自的范围,镁、磷在树种间含量较为近似,钙、钾、铁差异较大,钠和锰比其它科属的树叶含量均高,铜、锌含量最低仅有几个ppm。 槲树、槲栎、辽东栎等树叶均可食,而且是个好饲料。     

副猪嗜血杆菌lpxM基因缺失株构建及生物学特性分析

【目的】研究副猪嗜血杆菌脂寡糖合成相关基因lpxM对其生长、生物被膜形成能力、抗50%猪血清杀菌能力、对巨噬细胞毒力和抗生素敏感性部分生物特性的影响,为揭示HPS致病机制,lpxM基因缺失疫苗的构建奠定理论基础,为猪场防治HPS进行药物选择时提供依据。【方法】以高致病性血清5型HPS地方分离株H45为研究对象,自杀性质粒PK18mobsacB为载体,通过自然转化法将构建好的重组质粒转进H45,使其在抗生素的压力下发生同源重组,最终经过抗生素筛选并通过PCR和测序验证得到lpxM基因缺失株H45-△lpxM,比较两者之间部分生物学特性的差异。测定两者的OD₆₀₀-t关系曲线比较生长情况;用结晶紫染色法比较两者在培养24h后生物被膜形成的能力;测定两者在50%猪血清中存活率,比较两者的抗血清补体杀菌能力;将两者同时刺激小鼠单核巨噬细胞RAW264.7细胞,作用时间为6、12和24h,检测细胞培养上清液中LDH的释放量,比较两者对巨噬细胞毒力影响;利用K-B 纸片扩散法研究两者对氨苄西林等临床上常用13种抗生素和多粘菌素B抗生素敏感性,通过测定抑菌圈直径来并参照耐药标准判断对抗生素的敏感性。【结果】成功构建lpxM基因缺失株H45-△lpxM,生长情况比较发现菌株生长前期缺失株慢于野生株,8h后保持一致,结果表明lpxM基因缺失能在一定程度上抑制H45的生长;两者均能形成生物被膜,但是缺失株弱于野生株;野生菌株在50%猪血清中存活率为16.1%,而缺失株只有0.71%,缺失株明显低于野生菌株;两者均能引起巨噬细胞的死亡,作用6、12和24h后,野生株对细胞的致死率分别为6.63%、10.86%和22.17%,而缺失株对细胞的致死率为2.62%、6.35%和18.01%,结果表明随着作用时间的延长,两者对细胞的毒力作用越来越大,具有一定的时间依赖性,在各个时间点,缺失株的毒力作用均低于野生株;抗生素敏感性结果发现,两者对头孢噻吩等10种抗生素均表现敏感,对恩诺沙星均表现抗性,但对阿莫西林克拉维酸、磺胺二甲异噁唑和氨苄西林三种抗生素的耐药性发生了较大的差异,阿莫西林克拉维酸和磺胺二甲异噁唑两种抗生素由耐药变成了敏感,氨苄西林也从中介变成敏感,结果表明lpxM基因缺失对H45抗生素敏感性具有一定影响。【结论】lpxM基因缺失能一定程度地抑制HPS生长,降低其生物被膜形成能力、抗血清杀菌能力和对巨噬细胞的毒力作用,增大对临床上多数常用抗生素的敏感性,揭示lpxM基因可能是HPS毒力基因,与HPS的致病能力密切有关,但具体机制还需要进一步研究。     

从水稻种子上分离到一个胶德克斯氏菌的新变种

从水稻品种卷叶白的种子上分离到的菌株‘7954’,细胞杆状、单生或成对排列,革兰氏阴性,以周生鞭毛运动,细胞内有很多聚β-羟基丁酸盐颗粒,不形成孢囊。无芽孢,细胞外含有大量浓稠坚韧的胶状物质,呈淡黄色至淡暗棕褐色,需氧性,营呼吸代谢,接触酶阴性。马铃薯块上生长较差,薯块不变色,还原硝酸盐。12～42℃中生长,最适32～35℃;pH5.3～9.5生长,最适pH6.8～7.9°DNA中的G+C克分子百分率为74.3±0.12％,与胶德克斯氏菌的DNA体外杂交的DNA同源性百分率为54％,有固氮酶活性。经鉴定认为菌株‘7954’应属于德克斯氏菌属,暂定名为胶德克斯氏菌周毛变种(Derxia gummaxa var.peritrichan.var.Wu et Chen)。     

(亚洲棉×司笃克氏棉)不同倍性杂种一代的育性和花粉母细胞减数分裂行为的研究

亚洲棉与司笃克氏棉杂交,获得了125粒杂种种子,用0.05%秋水仙素水溶液处理,获得7株加倍的四倍体F_1植株。1984-1987年的研究结果表明,二倍体F_1花粉母细胞减数分裂不正常,中期Ⅰ染色体构型是20.53Ⅰ+2.45Ⅱ+0.19Ⅲ,二价体交叉频率为1.07;后期Ⅰ和后期Ⅱ染色体分向两级不均衡,产生各种类型的异常四分孢子,由此发育的花粉无生活力,用亚洲棉回交或自然授粉均未结铃。四倍体F_1减数分裂较正常,中期Ⅰ染色体构型为0.1Ⅰ+25.9Ⅱ,二价体交叉频率为1.96,后期Ⅰ和后期Ⅱ染色体走向两极较均衡,产生的花粉部分可育,授陆地棉花粉或自然授粉能结少数种子。     

上海凡纳滨对虾源副溶血弧菌耐药性及其耐药基因检测分析

【目的】掌握上海地区养殖凡纳滨对虾源副溶血弧菌的耐药性及耐药基因携带情况,并明确耐药表型与耐药基因间的相关性,为科学防控凡纳滨对虾副溶血弧菌病及揭示耐药机制提供理论依据。【方法】通过K-B纸片扩散法检测21株上海凡纳滨对虾源副溶血弧菌对14种常见抗生素的敏感性,采用二倍稀释法测定高度敏感抗生素对副溶血弧菌的最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）,并以PCR检测其耐药基因的携带情况,包括β-内酰胺类耐药基因blaTEM和blaCARB、磺胺类耐药基因Sul II和Sul III、氨基糖苷类耐药基因strA和str B、四环素类耐药基因tetA及I类整合子inT1基因。【结果】21株上海凡纳滨对虾源副溶血弧菌对14种常见抗生素表现出不同程度的多重耐药性,六重耐药1株（4.76%）,五重耐药3株（14.29%）,四重耐药5株（23.81%）,三重耐药8株（38.10%）,二重耐药4株（19.05%）;AMP/PG/SMX和PG/SMX为优势耐药菌谱。上海凡纳滨对虾源副溶血弧菌对恩诺沙星的敏感率最高（90.48%）,对应的MIC为0.10~1.60μg/mL、MBC为3.20~12.80μg/mL。blaTEM、blaCARB、Sul II、Sul III、str B和inT1等耐药基因的检出率分别为23.81%、71.43%、33.33%、19.05%、9.52%和23.81%,未检测出strA和tetA基因。从21株上海凡纳滨对虾源副溶血弧菌中共检出11种耐药基因型,其优势耐药基因型有blaCARB（28.57%）、blaCARB-blaTEM（14.29%）、blaCARB-Sul II（14.29%）和Sul III-inT1（9.52%）。除str A基因和tetA基因外,其余耐药基因与其对应抗生素耐药表型间均存在相关性,但其相关性不显著（P>0.05）。【结论】上海凡纳滨对虾源副溶血弧菌对14种常见抗生素表现出不同程度的敏感性,对恩诺沙星的敏感性最高,故可考虑将恩诺沙星作为上海地区凡纳滨对虾副溶血弧菌病防控的备选药物。此外,针对对虾源副溶血弧菌日趋严重的多重耐药问题,应同时加强副溶血弧菌耐药基因及整合子携带情况的监测,掌握其流行趋势,以提高对虾副溶血弧菌病的防控策略。     

中国栎属木材的构造及物理-力学性质(三)

介绍落叶栎属的小叶栎、黄山栎、北京榭栎和袍栎的木材解剖构造与材性的测试结果。四种栎木均属环孔材,心边材区分明显,薄壁细胞发达,具宽木射线,密度较大,强度指标高,属于高强度的木材。其中黄山栎、北京榭栎晚材管孔小,链状;袍栎和小叶栎晚材管孔为单孔,早晚材管孔的直径渐变,侵填体都较发达。除黄山栎以外,其它三树种有菱形结晶体,黄山栎的纤维细胞最长,袍栎的差异干缩大。     

水稻对白叶枯病抗性的生物诱导及凝集素的作用

用白叶枯非亲和性菌株G-3-1,G-3-2,78-3的活/死细胞剪叶法,分别于孕穗期对高感的金刚30和中抗的74-105水稻品种植株的顶部展开叶连续3次(间隔4d)诱导接种,7d后在同一叶片及其上一叶接种亲和性菌株76-25,结果发现两品种的被接种叶及紧接其上的一叶均获得了诱导抗性,活体诱导物较死体诱导物诱导的抗性强,74-105品种获得的抗性较金刚30强,金刚30,74-105及抗病的南粳15经78-3活细胞诱导接种的叶片组织液,对78-3和76-25菌株的生长有显著的抑制作用;抗病品种的正常和受伤叶片组织浓也有抑菌作用,但均较诱导叶弱,从前述3个水稻品种的胚及叶片组织提取凝集素并纯化,经测定,二者对供测的5个白叶枯菌株均有凝集作用,但对非亲和性菌株的凝集作用比对亲和性菌株强;洗去胞外多糖可增加这种凝集作用;凝集素对病原菌无抑菌作用;诱导处理后叶片的凝集素含量与未诱导处理者无明显差异,初步认为凝集素在诱导抗性的初始阶段起着寄主对病原菌的识别作用,且其半抗原糖具有诱导抗性的活性。     

干旱胁迫下马蔺与高羊茅的生理反应比较

以正常供水为对照,对相同条件下生长的草坪草—高羊茅及马蔺进行干旱胁迫,研究干旱胁迫下2种植物的生理反应差异,旨在探讨植物可能的抗旱机理。结果表明:马蔺自然干旱胁迫14 d后开始萎蔫,比高羊茅耐胁迫天数长8d;水分胁迫下,马蔺土壤含水量、叶片含水量下降速度比高羊茅慢;游离脯氨酸含量、SOD及CAT活性缓慢上升,且高于高羊茅;MDA及电导率低于高羊茅,细胞膜较稳定。研究认为,马蔺具有忍受较强程度干旱胁迫的反应机制,有较好的抗旱性。