一种快速高效提取革兰氏阳性菌微杆菌基因组DNA的新方法

[目的]探索可以快速从革兰氏阳性菌微杆菌中提取高质量基因组总DNA的新方法。[方法]采用3种不同方法提取微杆菌基因组DNA,并进行DNA纯度、完整度鉴定及16SrDNA扩增检测。[结果]紫外吸收结果表明,采用改良方法所获DNAA260/A280大于1.80,A260/A230为2.0,5ml过夜菌液可得6.5μg基因组总DNA。DNA凝胶电泳结果表明,DNA完整度高且无RNA污染。以此方法提取的基因组总DNA样品为模板,可灵敏有效地扩增16SrDNA基因。[结论]该方法用时短,操作简易,纯度好、产率高、成本低,适用于革兰氏阳性菌各相关的分子生物学研究。     

红掌基因组DNA提取方法的优化

[目的]采用改良的SDS法提取红掌基因组DNA。[方法]以4种不同花色的红掌品种为材料,分别采用改良SDS法和CTAB法提取红掌基因组DNA,用紫外分光光度计测定英DNA在A260nm和A280nm下的吸光值,根据A260nm/A280nm的比值检测DNA的纯度和浓度。[结果]用改良SDS方法提取的DNA透明且无杂质,A260nm/A280nm比值在1．6—2．0,DNA纯度较高,可满足红掌分子生物学试验的要求;用CTAB法提取的DNA呈褐色或淡黄色,A260nm/A280nm,比值小于1．6,DNA纯度较低并且浓度低,舍有大量蛋白,此方法不适于提取红掌基因组DNA。[结论J采用改良SDS法可以提取到高质量的红掌基因组DNA,所提取的DNA的纯度和浓度可以满足红掌分子生物学研究的要求。     

凉粉草基因组DNA提取与分析

[目的]为分子生物学研究提供高质量、高产量的凉粉草总DNA。[方法]采用改良CTAB法提取总DNA,通过测定OD260/OD280值、琼脂糖凝胶电泳和RAPD扩增对所得DNA的浓度和质量进行检测,考察该方法对DNA的提取效果。[结果]改良CTAB法提取的总DNAOD260/OD280值为1.6～2.0;电泳条带清晰,完整性好,纯度高,总DNA分子量与λDNA相近;以所提DNA为模板进行RAPD扩增时,可得到稳定的扩增条带。[结论]改良CTAB法适合凉粉草基因组DNA的提取。     

悬铃木方翅网蝽DNA提取及PCR检测

[目的]探索并建立悬铃木方翅网蝽总DNA提取方法。[方法]采用改良SDS法结合Silica吸附柱提取悬铃木方翅网蝽总DNA,通过分光光度法、琼脂糖凝胶电泳对获得的DNA进行浓度、纯度及质量检测。利用PCR技术,分别扩增悬铃木方翅网蝽线粒体基因细胞色素氧化酶亚基Ⅰ（COⅠ）和基因组28S基因,克隆测序。[结果]悬铃木方翅网蝽总DNA浓度为52.8μg/ml,A260/A280为2.06,琼脂糖凝胶电泳条带清晰。PCR扩增产物条带清晰特异,经克隆并测序后表明为悬铃木方翅网蝽COⅠ和28S基因。[结论]该方法可得到较纯净完整和扩增效果良好的DNA,能满足进一步分子生物学研究的需要。     

优化醋酸钾(KAC)法提取蚜虫基因组DNA

[目的]探索一种简便、有效的单头蚜虫基因组DNA提取方法。[方法]以从不同地区采集的桃蚜为试材,采用改进的KAC法和优化的KAC法提取单头桃蚜的基因组DNA,用紫外分光光度计测定所提DNA的浓度（以OD260/280表示）,用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测所提DNA的纯度,比较2种方法的提取效果;对优化KAC法所提DNA进行PCR扩增和电泳检测。[结果]优化KAC法提取的单头蚜虫基因组DNA的OD260/280为1.6-1.9,浓度为20-50 ng/g;改进KAC法提取的单头蚜虫基因组DNA的OD260/280为1.4-1.7,浓度为8-25 ng/g;来自同一地方桃蚜的基因组DNA PCR扩增产物的电泳条带基本相同。[结论]优化改进的KAC法提取的桃蚜基因组DNA浓度和纯度均较高。     

兴安落叶松DNA提取-试剂盒改良法

[目的]寻找一种快速简便的兴安落叶松基因组DNA的提取方法。[方法]对DNA提取试剂盒进行改良,与原试剂盒法(离心柱)进行比较,并用琼脂糖凝胶电泳、蛋白核酸测定和ISSR-PCR对所提取的总DNA进行检测。[结果]试剂盒改良法提取的总DNA纯度和浓度较高,电泳显示其主条带较清晰,无降解现象,A260/A280值为1.75～1.84。[结论]改良后的DNA提取方法更适合兴安落叶松基因组DNA的提取。     

雷公藤叶片基因组DNA不同提取方法比较

[目的]比较雷公藤叶片中基因组DNA的提取方法。[方法]采用常规CTAB法、改良CTAB法、常规SDS法、高盐低pH值法和一步法分别提取雷公藤叶片基因组DNA,利用琼脂糖凝胶电泳、紫外分光光度法测定样品OD260与OD280的比值以及RAPD扩增结果,判断所得DNA样品的纯度,并根据OD260值计算不同提取方法的DNA得率。[结果]改良CTAB法提取效果最佳,所提DNA的平均得率为219.3μg/g,OD260/OD280比值在1.869～1.903,用于RAPD-PCR均有较好的扩增结果。[结论]改良CTAB法是雷公藤叶片基因组DNA提取的最佳方法。     

太子参药材总DNA提取研究

[目的]从太子参干药材中快速提取高质量基因组DNA。[方法]采用CTAB法和SDS法2种方法提取药材太子参干燥块根总DNA,并用紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测。[结果]2种不同的提取方法均可从太子参中提取到一定纯度的DNA,其中CTAB法提取DNA的A260/A280>1.9,纯度和产率较高,蛋白质、多糖、RNA等杂志去除较为彻底。[结论]利用CTAB法可从太子参干药材中能快速提取到高质量DNA。     

小麦不同部位DNA提取的比较研究

[目的]探讨小麦不同取材部位对DNA提取质量和产率的影响。[方法]分别以小麦的种子、根尖和幼嫩叶片为材料,采用改良CTAB法分别提取小麦3个部位的基因组DNA,用0．8％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量,用紫外分光光度计分别测定3个部位的DNA在A260和A280下的吸光值,根据A260/A280的值检测DNA的浓度和纯度,并以3个部位提取的DNA为模版进行RAPD扩增。[结果]采用小麦叶片提取DNA的产率最高,种子次之,根尖最低。3个部位提取的DNA纯度均相近,提取叶片获得的DNA浓度最大,为756μg/ml;其次是种子,为233μg/ml;根尖获得的DNA浓度最低,为90μg/ml。小麦不同部位提取的DNA模板对RAPD扩增没有明显影响,DNA浓度都能达到扩增的要求。[结论]小麦3个部位提取的DNA质量均较好,可以进行后续的酶切和PCR扩增等实验。     

适合库尔勒香梨SCoT分析用的DNA提取方法研究

[目的]有效利用SCoT分子标记法对库尔勒香梨优良营养系中相关基因,获得高质量基因组DNA,对目前常用的3种提取植物基因组DNA的方法进行比较研究,研究最适合库尔勒香梨SCoT分析的DNA提取方法.[方法]采用改良CTAB法,改良SDS法和试剂盒法从库尔勒香梨优良营养系的叶片中提取基因组DNA.采用NANODROP 2000核酸仪检测DNA浓度和纯度,并用1.2;琼脂糖凝胶电泳检测其完整性.以3种方法提取的基因组DNA为模板分别进行SCoT-PCR.[结果]改良CTAB法提取的基因组DNA的浓度为600 ～1 600 ng/μL,A260/A280为1.8 ～2.0,A260/A230＜2.0,电泳结果显示:有一条清晰的带,有拖尾现象,点样孔发亮;改良SDS法提取的基因组DNA的浓度为600 ～ 900 ng/μL,A260/A280为1.8 ～2.0,A260/A230为1.9 ～2.2,电泳结果显示:一条清晰的带,无拖尾现象只有一个点样孔发亮;试剂盒法提取的基因组DNA的浓度为100 ～ 200 ng/μL,A260/A280为1.8 ～2.0,A260/A230为2.2 ～2.5,电泳结果显示:一条清晰的带,无拖尾,无点样孔发亮现象,蛋白、多糖、酚类物质、RNA等去除彻底;以3种方法提取的基因组DNA为模板进行SCoT-PCR,PCR产物电泳结果显示:试剂盒法提取的DNA可以扩增出7条清晰明亮的带,改良CTAB法提取的DNA只能扩增出4条清晰的带,改良SDS法提取的DNA只能扩增出2条带.[结论]比较目前常用的3种提取植物基因组DNA的方法,综合成本高低,毒性大小,步骤多少,时间长短,试剂盒法是最适合提取库尔勒香梨优良营养系叶片基因组DNA的方法.     

广西北海红树林土壤放线菌的分离与鉴定

[目的]鉴定广西北海红树林土壤放线菌的物种多样性。[方法]从广西北海红树林土壤中分离、筛选10株典型放线菌菌株,提取基因组DNA,进行16SrDNAPCR扩增与测序,并构建进化树。[结果]通过Blast比对,10株放线菌属于2个属,其中8株为链霉菌属（80%）,2株为拟诺卡氏菌属（20%）。[结论]广西北海红树林土壤蕴藏着种类丰富的放线菌。     

一株产紫红色色素的沙雷氏菌的分离与鉴定

[目的]为有效预防和控制由沙雷氏菌引起的多种疾病提供依据。[方法]以华蓥山香菇作为研究材料,从其表面中分离出了1株产紫红色色素的细菌,采用形态学、生理生化方法对其进行初步鉴定;提取基因组DNA,采用16S rRNA的通用引物,PCR扩增16S rDNA基因片段,克隆入pMD-18T载体,转化E.coliDH5α,筛选阳性重组质粒鉴定后测序;通过多序列比对和同源性分析,构建系统发育树。[结果]该菌株革兰氏染色阴性,与沙雷氏菌属菌的同源性最高,命名为Serratiasp.JG05。扩增得到序列大小为1 506 bp,系统发育树表明JG05与Serratiasp.BBTR23的亲缘关系最近,核苷酸水平有99.20%的相似性。[结论]该研究为进一步研究这种附生菌与香菇的共生关系,以及它们之间的作用机制奠定了基础。     

用16S rDNA序列分析方法鉴定4个拮抗细菌

用1对16SrDNA通用引物，对4个拮抗细菌96-38、96-41、96-79和9682的基因组DNA进行扩增，PCR产物经克隆、测序、同源性分析表明，这4个菌株的16SrDNA全长均为1513bp，同源性达99．79％，仅在13个碱基位点存在差异。Blast分析发现，这些菌株与Genbank收录的芽孢杆菌属5个菌株16SrDNA序列的同源性为99．1％～99．9％，由此推断这4个拮抗细菌为芽孢杆菌属细菌。     

6种链霉菌基因组DNA提取方法比较

采用优化SDS、SDS、优化CTAB、CTAB、液氮研磨、微波法分别提取委内瑞拉链霉菌基因组DNA,比较6种方法的差异,选出最佳提取方法分别提取S.fradiae,S.venezuelae,S.ambofa-ciens,S.glaucescens,S.coelicolor基因组DNA,并利用16S rDNA的通用引物扩增相应的目的基因。结果表明:6种方法制备的基因组DNA以优化SDS法和微波法为上选,后者的纯度高但量很少。优化SDS法是6种提取方法中最可靠的DNA提取方法,DNA量大,纯度高,可靠,可作为PCR反应的模板进行16S rDNA基因有效扩增。     

玉米叶面微生物DNA提取方法及PCR引物的筛选

传统的微生物培养方法在反映叶面微生态信息上具有局限性,因此逐渐被分子生态学所代替,而获得高质量、大片段、无偏好的总DNA是研究叶面环境微生物的基础。本文采用改进的Sambrook法、CTAB法、改良的化学法以及试剂盒法对玉米生长初期、中期、末期的叶面微生物总DNA进行提取,并对4种方法提取的DNA片段的大小和产量进行综合评价。将得到的DNA用引物357/518以及984/1387对细菌16S rDNA进行扩增;用5种常见引物NS1/fung、ITS1-F/ITS2、NS1/AM1、EF4/fung5、SSU-0817/SSU-1196对真菌18SrDNA进行扩增。结果表明:4种方法提取的DNA片段均适用于PCR,但DNA的得率和纯度有一定差别,其中以试剂盒提取效果最好。PCR结果显示,除化学法外,其他3种方法提取的DNA均能够获得目的条带;并通过比较得出引物984/1387对16S rDNA以及ITS1-F/ITS2对18S rDNA扩增效果较好且扩增量最大。     

一种适用于PCR的土壤微生物DNA的提取方法

[目的]对土壤微生物的DNA进行提取,以建立一种适用于PCR技术分析的土壤微生物DNA的快速提取方法。[方法]采用了2种不同的直接裂解法提取土壤微生物DNA,并用细菌通用引物27F和1492R进行PCR扩增16SrDNA片段。[结果]2种方法提取的土壤微生物总DNA电泳结果显示没有差别,但是只有CTAB、溶菌酶、冻融裂解法提取的总DNA不需要纯化,在增加Mg^2＋用量的条件下,只需用第一轮非特异PCR产物作为模板即可扩增出16SrDNA片段。[结论]CTAB、溶菌酶、冻融裂解法提取土壤DNA,方法操作简单、快捷。同时适用于PCR分析。为土壤微生物群落结构的多样性分析奠定了基础。     

观音土曲乳酸菌的分离与分子鉴定

[目的]指导白酒生产,提高白酒质量。[方法]采用平板分离法从观音土曲中分离到7株乳酸菌（B1~B7）,测定其发酵产乳酸的量。选取乳酸产量最高的1株菌B7,提取其DNA并进行16S rDNA的PCR扩增、克隆、测序。从GenBank中选取与B7同源性最高的典型菌株,下载其16S rDNA序列,采用邻位相连法构建进化树。[结果]B1~B7的产乳酸量分别为：24.7、20.7、30.7、15.2、9.5、21.8、35.7mg/100m l;对B7的基因组DNA进行16S rDNA的PCR扩增,并对纯化后的扩增产物进行TA克隆,阳性克隆经琼脂糖凝胶电泳后在3000和1 600 bp处出现电泳条带,说明B7的16S rDNA PCR扩增产物已克隆到测序载体上。同源性分析结果表明,B7为乳杆菌属的短乳杆菌。[结论]该研究从观音土曲中分离到1株高产乳酸菌——短乳杆菌。     

一株高产脂肪酶产生菌16S rDNA的序列分析

[目的]对分离获得的高产脂肪酶菌株进行鉴定,为其改造和更好利用奠定基础.[方法]对从食堂下水道中分离获得的一株高效产脂肪酶细菌(JLΠ-4)进行培养,提取其基因组DNA.设计16S rDNA通用引物,扩增16S rDNA基因片段,并连接到pUC19-T载体上,转化大肠杆菌DH5X,经PCR鉴定的阳性克隆摇菌培养后测序.[结果]提取获得较高质量的基因组DNA,扩增获得新分离菌株16S rDNA基因片段,长度为1528 bp,BLAST相似性比对分析结果表明,其与伯克霍尔德氏菌16S rDNA序列相似性达97%,是一株与伯克霍尔德氏菌最近的革兰氏阴性菌.[结论]初步将高产脂肪酶细菌JTΠ-4鉴定为唐菖蒲伯克霍尔德菌.     

中国北方地区甘草根瘤菌表型及遗传多样性研究

【目的】了解中国北方地区甘草根瘤菌的生物多样性。【方法】采用表型数值分类、16S rDNA PCR-RFLP分析和BOX-PCR指纹图谱分析的方法对北方地区的甘草根瘤菌进行表型、遗传多样性分析。【结果】供试菌株在数值分类聚类分析中约85％的相似水平上产生2个表观群，有11株菌未与已知参比菌株聚群。16S rDNA PCR-RFLP分析表明，供试的20株菌共产生14种遗传型，表现出丰富的遗传多样性。BOX-PCR指纹图谱分析进一步证明与甘草共生的根瘤菌的基因组也具有多样性。【结论】在中国北方地区与甘草共生的根瘤菌在Sinorhizobium、Rhizobium和Mesorhizobium属中均有分布。