"大通牦牛"Lfcin基因克隆及生物信息学分析

[目的]克隆“大通牦牛”Lfcin基因,为将该基因应用于饲料工业和养殖业提供依据。[方法]利用PCR技术从“大通牦牛”基因组DNA中获得乳铁蛋白素（Lactoferricin,Lfcin）基因序列;将Lfcin基因连接于pGEM-T easy载体,送至生物公司测序;将“大通牦牛”与奶牛的Lfcin基因序列进行比对;同时,对牦牛、奶牛、人、小鼠等物种的Lfcin蛋白进行序列分析和进化树分析。[结果]克隆获得了含“大通牦牛”LF（Lactoferrin）第二外显子的DNA序列,共778bp,其中Lfcin基因编码区长75bp,编码25个氨基酸;序列分析显示,克隆获得的牦牛DNA序列与奶牛该序列存在11个碱基的变异;牦牛和奶牛的Lfcin蛋白质序列完全相同,各物种Lfcin蛋白具有较高的同源性;进化树分析表明Lfcin进化树符合物种进化规律。[结论]该研究为Lfcin基因在原核或真核细胞中的表达研究以及进一步研究Lfcin蛋白的生活活性奠定了基础。     

天祝白牦牛LF基因克隆及分子特征

 【目的】哺乳动物乳铁蛋白（Lactoferrin,LF）在抗菌、抗病毒、抗肿瘤、调节免疫等方面起着重要作用。本试验对天祝白牦牛乳铁蛋白基因的编码区进行克隆和分子特征分析。【方法】以处于干乳期的天祝白牦牛乳腺组织为材料,通过RT-PCR克隆了包含LF基因编码区的cDNA序列（GenBank收录号为EU547252）;将克隆获得的天祝白牦牛LF基因的cDNA与奶牛相应序列进行比对;对天祝白牦牛LF蛋白（GenBank收录号为ACB29795）与其它物种LF蛋白进行序列比对和进化树分析;对牦牛LF蛋白的特性和结构进行预测。【结果】克隆获得天祝白牦牛LF基因cDNA片段长度为2 344 bp,其中LF基因编码区全长2 124 bp,编码708个氨基酸;序列分析显示,克隆获得的牦牛cDNA序列与奶牛该序列存在15个碱基的变异,其中位于LF基因编码区的变异有12个,这些突变造成4个氨基酸变异;天祝白牦牛LF蛋白与奶牛、人、小鼠、山羊、绵羊、猪、狗、马、骆驼、猩猩、鸡LF蛋白氨基酸相似度分别为99.4%、69.5%、63.5%、92.4%、91.5%、72.9%、69.1%、72.6%、75.3%、69.5%和50.9%;各物种LF蛋白进化树符合物种进化规律;同源建模预测LF 3D模型显示,LF为多肽链在二级结构基础上折叠形成2个极相似的、对称的球状叶,即N叶和C叶,中间由1段对蛋白酶敏感的α-螺旋连接,呈“二枚银杏叶型”结构。【结论】从天祝白牦牛克隆获得LF基因编码区全长序列并揭示了其分子特征,为牦牛LF蛋白基因工程和蛋白质功能的研究奠定了基础。     

天祝白牦牛IGF-1基因克隆、生物信息学及差异表达分析

旨在获得天祝白牦牛 IGF-1基因序列,分析其分子结构特征及在牦牛毛囊发育周期中的表达规律,为解析白牦牛毛囊发育及被毛生长提供理论依据。以天祝白牦牛体侧皮肤为试验材料,通过PCR扩增及测序技术克隆 IGF-1基因CDS区序列,并与黄牛序列比对,进行生物信息学分析;采用实时荧光定量PCR(qPCR)技术检测天祝白牦牛毛囊发育不同时期 IGF-1基因的mRNA表达水平。结果表明,天祝白牦牛 IGF-1基因的CDS区长465 bp,编码154个氨基酸; IGF-1基因编码蛋白的分子质量为17 065. 81 ku,理论等电点为9.36;蛋白质二级结构以无规卷曲(57.79%)和α-螺旋(27.27%)为主,序列分析表明,天祝白牦牛IGF-1蛋白为不稳定亲水蛋白;qPCR检测结果表明, IGF-1基因在牦牛毛囊发育的生长期、退行期和休止期均有表达,生长期和退行期表达量显著高于休止期。     

天祝白牦牛MSTN基因编码区克隆及生物信息学分析

为探讨天祝白牦牛MSTN基因的分子结构特征,通过PCR扩增和测序技术以及生物信息学分析工具对天祝白牦牛MSTN基因进行克隆、测序及相关生物信息学分析。结果表明,天祝白牦牛MSTN基因编码区序列全长1 128 bp,编码375个氨基酸残基;天祝白牦牛MSTN基因编码蛋白分子量42.55 ku,理论等电点为6.14;生物信息学预测发现,天祝白牦牛MSTN蛋白是不稳定的亲水蛋白,mRNA二级结构的最小自由能为-1 135.16 k J·mol~(-1),蛋白质二、三级结构均是以无规卷曲和延伸链为主的混合型蛋白。天祝白牦牛MSTN基因的成功克隆为进一步研究牦牛MSTN的遗传特性和生理机制奠定了基础。     

天祝白牦牛金属硫蛋白基因的克隆及表达

运用RT-PCR和RACE(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术获得天祝白牦牛金属硫蛋白(MT-2)基因全长cDNA序列,对其生物学进行分析,并通过荧光定量PCR双标准曲线法和2-ΔΔct法建立检测MT-2基因表达的方法.结果表明:扩增获得的天祝白牦牛MT-2基因全长为410bp(GenBank登录号:KF888633),ORF长185bp,编码61个氨基酸.该基因无跨膜结构,为非分泌型蛋白.构建系统进化树结果显示,天祝白牦牛MT-2基因在不同物种以及进化的过程中具有高度保守性,与黄牛和羊的亲缘关系最近.荧光定量PCR结果表明,双标准曲线法特异性强、灵敏度高、稳定性好,对天祝白牦牛MT-2的定量检测具有重要意义.     

牦牛DAZL基因编码区的克隆和序列特征与进化分析

根据黄牛DAZL基因序列设计引物,通过PCR扩增和克隆测序获得牦牛睾丸组织DAZL基因编码区序列,利用生物信息学软件分析牦牛DAZL基因编码区序列结构以及与其他物种的系统发育关系.结果表明:牦牛DAZL基因cDNA序列长度为1782 bp,编码区全长885 bp,编码295个氨基酸,与黄牛的氨基酸序列同源性为98.31%;牦牛DAZL蛋白含有DAZ基因家族所具有的典型的RNA结合域和DAZ重复基序.系统发育分析显示:牦牛与黄牛首先聚为一类,然后与哺乳纲的其他物种相聚,而与鱼纲、爬行纲动物的亲缘关系最远.     

牦牛JHDM2A基因的克隆测序及其生物信息学分析

利用RT-PCR克隆技术对牦牛JHDM2A基因进行cDNA克隆测序,并用生物信息学软件分析该基因的编码区序列、蛋白结构及进化关系。结果表明:①牦牛JHDM2A基因cDNA序列大小为4 605bp,其中CDS区序列3 969bp,编码氨基酸1 323个。牦牛JHDM2A基因与人、小鼠、褐鼠、原鸡等物种该基因序列比对,一致性分别为90.3%、86.9%、86.3%、69.9%,在物种间具有较高的一致性。②牦牛的JHDM2A蛋白存在JMJC结构域,属于JMJD家族的一员,该蛋白是一种弱碱性、无跨膜结构的游离蛋白,不定位于细胞的任何部位,进化速度慢、保守性强。以上结果为进一步从分子水平上了解牦牛JHDM2A基因和JHDM2A蛋白的结构、功能提供了理论基础。     

驴生长激素基因的克隆与分析

 【目的】克隆驴生长激素基因DNA和cDNA的全序列,分析其序列和cDNA编码的蛋白序列特征及其在不同物种中的遗传差异。【方法】根据不同物种同一基因序列的同源性比对结果设计引物,应用RT-PCR和PCR 技术克隆基因,用生物信息学方法对获得的DNA和cDNA及推定的氨基酸序列进行分析。【结果】从驴肝组织和血液中分别得到驴GH基因全序列1 928 bp和包括完整的编码区的cDNA序列706 bp,两者序列比对后证明驴GH基因DNA序列由5个外显子和4个内含子组成,编码216个氨基酸的GH前体蛋白,其中包括26个氨基酸的信号肽和190个氨基酸的成熟肽。序列比较结果表明,驴GH基因的序列与马同源性最高,启动子不是哺乳动物的典型TATA盒,而是CATA盒,该基因在进化过程中是保守的。【结论】从驴肝组织和血液中克隆了GH基因DNA和cDNA,DNA序列在1 267位的C→G可能影响到驴和马生长发育的差异,为下一步驴GH基因的表达调控、进化和多态性分析奠定了基础。     

牦牛TLR4基因的克隆测序及序列分析

旨在了解牦牛天然免疫受体TLR4基因特点。根据GenBank已公布的牛TLR4基因序列,分3段设计引物,测序、拼接克隆序列,并对所得序列进行生物信息学分析和预测。基因序列分析表明,克隆得到牦牛TLR4基因编码区全长2 807bp,开放阅读框2 526bp,编码氨基酸841个,N端含有27个氨基酸组成的信号肽,分子质量96.009 8ku,理论等电点为6.35。蛋白预测结果表明,TLR4编码蛋白整体表现为亲水性。同源性分析表明,10条序列当中牦牛与野牦牛、普通牛、绵羊等物种具有较高的同源性,在系统发育树中距离最近。说明TLR4基因序列具有较高的保守性。     

牦牛Cygb基因的克隆及序列分析

【目的】对牦牛Cygb基因进行克隆与序列分析,为进一步深入研究Cygb基因在牦牛对低氧环境适应性中的作用提供理论基础。【方法】参照GenBank中牛的Cygb基因序列设计引物,提取牦牛肝组织RNA,以反转录合成的cDNA为模版,克隆牦牛Cygb基因并进行测序,运用生物信息学软件对所得序列进行分析。【结果】牦牛Cygb基因编码区全长573bp,编码190个氨基酸,编码产物分子质量21.5ku,理论等电点为6.61。蛋白预测表明,Cygb编码蛋白整体表现为亲水性,蛋白质的二级结构主要由α螺旋及延伸链构成。同源性分析表明,11条序列当中牦牛与牛、绵羊等物种具有较高的同源性,在系统发育树中距离最近,其中牦牛与牛的同源性最高,达到99.0%。【结论】克隆到573bp的牦牛Cygb基因编码区全长序列,该序列在哺乳动物中具有很高的保守性。     

“大通＂牦牛Lfcin基因克隆及生物信息学分析

乳铁蛋白素（Lactoferricin,Lfcin）是从乳铁蛋白（LF）上被胃蛋白酶水解下来的25个氨基酸残基的小肽,位于乳铁蛋白第二外显子,是乳铁蛋白的抗菌活性中心,其抗菌活性是LF的几百倍。Lfcin具有广谱抗菌活性,对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有效,同时具有抗真菌、抗病毒、抑制肿瘤细胞生长、参与免疫调节等多种生物学功能和维持动物肠道菌群正常生态稳定的功能,从而起到提高动物生产性能的作用。     

“大通”牦牛Lfcin基因克隆及生物信息学分析(英文)

[Objective] This study was to clone Lfcin gene from Datong yak, so as to provide reference for applying this gene in feed industry and breeding industry. [Method] Using PCR technology, the lactoferricin(Lfcin)-encoding gene was obtained from genome of Datong yak; then it was cloned into pGEM-T easy vector, and then sequenced; the sequencing results were subsequently aligned with the sequences of dairy cow accessed in GenBank. Moreover, amino acid sequences of Lfcin gene from various species including yak, dairy cow, human and mouse were used for sequence alignment and phylogenesis analysis. [Result] The second exon of lactoferrin(LF) from Datong yak, which is 778 bp in length, was obtained, within which the coding region of Lfcin gene is 75 bp (25 amino acid residues); sequence analysis showed that there is discrepancy of eleven bases between Datong yak and dairy cow; Lfcin proteins from various species shared high homeology, of which that from Datong yak and dairy cow were completely identical; phylogenesis analysis showed that cladogram based on Lfcin was consistent with species evolutionary law. [Conclusion] This study laid a foundation for the prokaryotic or eukaryotic expression of Lfcin gene and further understanding the activity of Lfcin protein.     

牛乳素Lfcin B基因的合成及其在酵母菌中的表达研究

[目的]为临床研究和治疗某些病原微生物引起的感染提供依据。[方法]参照LfcinB的氨基酸序列,利用化学合成法合成LfcinB基因并克隆到pPIC9K载体中,转化到酵母菌GS115感受态细胞中,用抗性选择标记G418筛选出高拷贝酵母菌转化子。利用甲醇诱导表达重组LfcinB,经Tricine-SDS-PAGE电泳检测目的蛋白牛乳铁蛋白素的表达情况,同时通过体外抑菌试验检测表达产物的抑菌活性。[结果]提取的酵母菌DNA扩增出1条预期的560bp左右的特异性条带。目的基因已经成功克隆到pPIC9K载体中,并转到酵母菌GS115中而且获得了表达。重组酵母表达上清中牛乳铁蛋白素抗菌肽对沙门氏肠炎杆菌的抗菌活性为42.857IU/ml,表明LfcinB基因的酵母表达载体构建成功。[结论]该研究证明利用化学合成法直接合成编码LfcinB的DNA构建真核表达载体、通过生物发酵工程来制备LfcinB是可行的。     

牦牛心脏脂肪酸结合蛋白(H-FABP)基因的克隆及序列分析

【目的】对牦牛H-FABP基因进行克隆和序列分析，以期为进一步开展牦牛该基因与其肉质性状的相关分析，进行分子标记辅助选择以及基因定位、表达等研究提供理论基础。【方法】用特定引物对牦牛H-FABP基因进行PCR扩增并进行T-A克隆和测序，在此基础上使用RepeatMasker、DNAMAN4.0、BioEdit4.8.10、Clustal W1.81等生物信息学软件进行序列分析。【结果】牦牛H-FABP基因(已在NCBI上登录，登录号为DQ026674)由4个外显子和3个内含子组成，CDS序列全长为402 bp，前体氨基酸数为133个。4个外显子大小分别为73 bp、173 bp、102 bp和54 bp；3个内含子大小分别为3 460 bp、1 892 bp和1 495 bp；外显子与内含子的连接区序列遵循通常的基因组成规律。外显子和内含子个数与普通牛、绵羊、山羊、猪、人、大鼠、小鼠、鸡、斑马鱼各物种相同。牦牛H-FABP基因序列中，重复序列所占比率为13.07%。内含子Ⅰ含有5个重复元件，包括1个SINE/Artiodactyls元件、1个SINE/MIR3元件、1个SINE/Bov-tA1元件和2个SINE/MIR元件；内含子Ⅱ无重复元件；内含子Ⅲ有3个重复元件，其中SINE/MIR元件、LINE/L2元件、SINE/Artiodactyls元件各1个。SINEs短重复序列所占比率为11.85%，哺乳动物分散性重复序列MIRs比率为6.44%。LINEs所占比率为1.22%，小于SINEs元件。其中，LINE1、BovB/Art2、L3/CR1重复元件以及LTR类反转录元件和DNA转座子元件在牦牛该基因区域中不存在。不同物种间在该基因编码区核苷酸序列和氨基酸序列上有较高的保守性。牦牛与普通牛、绵羊、山羊、猪、人、大鼠、小鼠、鸡、斑马鱼各物种在H-FABP基因编码区核苷酸序列上同源性大小分别为99.8%、97.8%、97.0%、92.8%、88.8%、83.3%、83.1%、76.4%、68.7%；相应的氨基酸序列间同源性大小为100%、96.9%、96.9%、92.4%、88.7%、85.7%、85.7%、77.4%、69.9%。【结论】牦牛H-FABP基因由4个外显子和3个内含子组成，其中外显子I、外显子Ⅱ、 外显子Ⅲ 和外显子Ⅳ大小分别为73 bp、173 bp、102 bp和54 bp，内含子I、内含子Ⅱ和内含子Ⅲ大小分别为3 460 bp、1 892 bp和1 495 bp。牦牛该基因区域含有较为丰富的重复序列元件且外显子与内含子的连接区序列遵循通常的基因组成规律。牦牛与普通牛、绵羊、山羊、猪、人、大鼠、小鼠、鸡、斑马鱼9个物种在H-FABP基因编码区核苷酸及氨基酸序列上具有较高的保守性。     

黄牛、牦牛和犏牛b-Sycp2基因的克隆 与睾丸组织mRNA的表达水平

【目的】克隆黄牛、牦牛和犏牛Sycp2基因序列,了解牛Sycp2基因序列特征和组织表达特征,分析睾丸组织中Sycp2基因的表达水平。【方法】采用电子克隆和克隆测序技术获得黄牛、牦牛和犏牛Sycp2基因序列,利用生物信息学方法分析其序列特征;采用RT-PCR分析牛Sycp2基因的组织表达特征;采用real-time PCR技术检测黄牛、牦牛和犏牛睾丸组织Sycp2基因的表达水平。【结果】①黄牛、牦牛和犏牛Sycp2基因编码区序列全长均为4 365 bp,命名为b-Sycp2,编码蛋白含有1 454个氨基酸残基,并包含卷曲螺旋结构域等典型结构域;②b-Sycp2基因在睾丸组织中特异表达,黄牛和牦牛睾丸组织中b-Sycp2基因的表达水平显著高于犏牛（P＜0.05）。【结论】成功克隆了b-Sycp2基因,b-Sycp2基因为睾丸组织的特异表达基因,且黄牛和牦牛睾丸组织b-Sycp2基因表达水平显著高于犏牛。     

牛BRY基因的分子克隆及序列分析

以荷斯坦奶牛、西门塔尔牛和甘南牦牛为观测对象,利用Y染色体上特异性序列BRY基因进行性别预测,并对其进行PCR扩增、分子克隆及序列分析;最后以牛基因组DNA为模板,利用牛BRY基因作为雄性特异性基因,ZFX/ZFY作为内标基因进行双重PCR.结果表明:公牛可获得长度约为300 bp和445 bp两条扩增带的PCR产物,母牛则仅获得1条长度约为445 bp的PCR产物,与实际性别完全相符,说明该基因可用于牛的性别预测.对BRY-PCR产物克隆测序,得到300 bp的BRY基因部分核苷酸序列,与GenBank上登录的牛和绵羊的同源性序列进行比对发现,同源性都高于87.0%,表明哺乳动物的BRY基因具有高度保守性,种间差异很小.     

牦牛和犏牛DDX25/GRTH基因序列及其在睾丸组织的表达水平

为了解DDX25基因的结构、功能及对犏牛雄性不育的影响。采用RT-PCR技术克隆获得牦牛和犏牛的DDX25基因,对核苷酸序列和氨基酸序列进行生物信息学分析,运用实时荧光定量PCR技术检测睾丸组织DDX25 mRNA的表达情况。结果表明,牦牛和犏牛DDX25基因编码区序列全长均为1 452bp,编码483个氨基酸,氨基酸存在19个磷酸化位点,无信号肽。牦牛睾丸组织DDX25基因表达水平显著高于犏牛,DDX25基因在犏牛睾丸组织的低表达与其雄性不育存在一定关系,该基因可作为研究犏牛雄性不育的候选基因。     

甘肃天祝白牦牛与甘南牦牛乳中水解酶活力比较(英文)

对甘肃天祝白牦牛乳与甘南牦牛乳中水解酶活力进行比较分析。结果表明:天祝牦牛乳中ACP活性显著大于甘南牦牛乳(P0.05);AKP活性大于甘南牦牛乳,但显著性不明显(P0.05);AMS活性小于甘南牦牛乳,但显著性不明显(P0.05)。3种水解酶活性随着胎次的变化均无显著差异(P0.05),即胎次对牦牛乳酶活性影响不显著。对甘肃天祝白牦牛乳和甘南牦牛乳中水解酶活力的比较研究,以便于更深入了解甘肃2个品种牦牛乳的特点,为牦牛乳的进一步开发提供一定的参考依据。     

牦牛和犏牛Dmrt7基因序列分析及其 在睾丸组织中的表达水平

【目的】研究牦牛和犏牛Dmrt7基因编码区序列和编码蛋白的结构,以及在睾丸组织中mRNA及其蛋白表达水平,探讨Dmrt7与犏牛雄性不育的关系,为揭示犏牛雄性不育的分子机理提供依据。【方法】利用分子克隆技术获得牦牛和犏牛Dmrt7基因编码区序列,并采用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白的功能位点和二级结构等方面进行了预测和分析;通过半定量PCR技术检测Dmrt7基因mRNA在牦牛各组织器官中的表达水平;利用实时荧光定量PCR技术检测牦牛和犏牛睾丸组织中Dmrt7基因mRNA表达水平;并通过western blotting检测牦牛和犏牛睾丸组织中Dmrt7蛋白的表达水平。【结果】牦牛和犏牛Dmrt7基因cDNA序列一致,包含一个长度为1 113 bp的开放阅读框,编码370个氨基酸,具有完整的DM功能域,二级结构主要以无规则卷曲、α螺旋和延伸链为主。在牦牛各组织器官中,Dmrt7基因mRNA仅在睾丸组织中特异性表达。牦牛睾丸组织中Dmrt7mRNA和蛋白的表达水平极显著高于犏牛（P＜0.01）。【结论】牦牛睾丸组织中Dmrt7基因mRNA和蛋白表达水平明显高于犏牛,且Dmrt7蛋白表达水平与其mRNA表达水平相一致。