大豆疫霉基因组SSR标记开发

 【目的】开发大豆疫霉基因组SSR标记,为从分子水平深入研究大豆疫霉及其近缘种提供一种理想的分子标记。【方法】用FPCR软件从大豆疫霉全基因组序列中查询SSRs,选择合适的SSR序列用Primer5.0软件设计引物。【结果】从发现的1 234个含有2～4个碱基重复单元的完全SSRs中选出260段设计引物,经10个大豆疫霉分离物基因组DNA检测,有213对(81.9%)扩增出SSR特征条带,其中114(53.5%)对引物扩增出多态性。通用性检测表明,14.6%～28.6%引物分别在选择的8个疫霉种中有效扩增。基于10个SSR标记数据进行聚类分析,结果表明表明这些标记可以完全区分大豆疫霉及其它疫霉。【结论】大豆疫霉基因组SSR标记具有高多态性,是大豆疫霉遗传变异、遗传多样性、及遗传图谱构建等研究理想工具。部分大豆疫霉基因组SSR标记在其近缘种中具有通用性,可以用于疫霉菌的系统进化、鉴定、区分及开发近源种的SSR标记。特别开发的SSR标记,在大豆疫霉基因组中具有准确的位置,将极大地方便大豆疫霉菌功能基因的定位和克隆,以及进行疫霉菌的比较基因组的研究。     

新疆大豆疫霉的来源分析

应用SSR标记对新疆地区大豆疫霉菌（Phytophthora sojae Kaufmann ＆ Gerdemann）的遗传多样性和与美国、黑龙江、福建等3个不同地理来源大豆疫霉菌的遗传关系进行研究。结果表明,新疆地区大豆疫霉菌遗传多样性相对较低,遗传背景单一,推断为外来生物。与大豆疫霉菌美国分离物和福建分离物相比,新疆分离物与黑龙江分离物的遗传关系最近,表明新疆大豆疫霉菌可能从黑龙江传人。     

适用于大豆疫霉菌遗传分析的新EST-SSR标记

【目的】开发大豆疫霉菌SSR标记,为深入了解大豆疫霉菌遗传变异提供理想分析工具。【方法】用SSRIT软件对28 197条大豆疫霉菌EST进行SSR搜索,选择含有SSR的合适EST设计、合成引物和PCR扩增。【结果】发现1 454条EST含有SSR,其中3个碱基重复基元类型最多,有855个,占鉴定总数的54.3%。设计合成140对引物,用10个大豆疫霉菌菌株基因组DNA进行PCR检测,有111对引物（79.3%）扩增出SSR特征条带。通用性检测表明有33对引物在检测的1个或多个其它疫霉菌或腐霉菌中产生扩增产物。【结论】大豆疫霉菌EST含有丰富的SSR位点,本研究从EST中开发了111个新大豆疫霉菌SSR标记,可有效地用于大豆疫霉菌及其相关种的遗传变异研究。     

黑龙江省东部大豆疫霉群体遗传多样性时空动态

为明确大豆疫霉群体遗传多样性时空变化规律,采用简单重复序列(Simple sequence repeat,SSR)标记技术,分析2014~2017年黑龙江省东部生产田和试验田大豆疫霉群体遗传多样性。选用8对SSR引物扩增547株供试大豆疫霉,获得123个条带,其中110个为多态性条带,占89.43%,基因多态性位点主要集中在700、450和350 bp,在450 bp处基因多样性复杂;遗传变异分析表明,随时间推移,黑龙江省东部大豆疫霉群体内基因变化极显著,遗传多样性复杂,基因变异频率升高,群体明显进化。试验田大豆疫霉群体遗传多样性丰富,基因变异频率略高于生产田。     

安徽省辣椒疫霉菌株遗传多样性的RAPD分析

通过利用RAPD(Random Amplified Polymorphic DNAs)随机引物中筛选到的可扩增出清晰条带、主带明显、稳定的10条引物,对来自安徽合肥、淮南、和县、潜山、岳西、江苏南京和四川邛崃等县市的发病辣椒上分离鉴定获得23个辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)进行全基因组DNA RAPD标记遗传多样性分析。选用引物共标出DNA指纹图带113条,其中多态性条带96条,多态性检测率为84.96%,表明辣椒疫霉菌具有较丰富的遗传多样性。根据引物扩增的DNA指纹图谱,运用UPGMA法分析,以遗传相似系数0.7为阈值,供试菌株被划分为3个遗传聚类组,除部分相同地理来源的菌株被划分为同一组外,其他不同菌株间的遗传相似性与地理来源无直接相关性。     

辣椒疫霉EST-SSRs标记的发掘

通过对GenBank上发布的55 848条辣椒疫霉EST的鉴定,在328条EST中发现331个SSR.在筛选的EST序列中SSR平均密度为每23.7 kb含有1个SSR.在鉴定的SSR中,三核苷酸重复基元的SSR类型最多,占鉴定总数的59.5%;其次为二核苷酸乖复基元的SSR类型,为39.3%;四核苷酸重复基元的SSR类型最少,为1.2%.设计40对SSR引物对5个辣椒疫霉菌株基因组DNA进行PCR扩增,有27对引物扩增出SSR特征条带,其中有18对引物在5个辣椒疫霉菌株间扩增出多态性条带25条.基于SSR标记进行聚类分析,可将5个检测大豆疫霉菌菌株划分为3类.该研究是辣椒疫霉的SSR标记开发的首次报道,为辣椒疫霉的遗传变异和分子作图等分析提供了一种有效的分子标记系统.     

基于SSR的藕莲新品种(系)指纹图谱构建

[目的]利用SSR分子标记构建藕莲品种(系)鉴定的DNA指纹图谱,为藕莲品种鉴定和新品种选育提供技术支持。[方法]利用SSR标记对9个莲藕新品种(系)进行鉴定,统计条带并进行遗传多样性分析,选择核心引物,建立DNA指纹图谱。[结果]从45对引物中筛选到9对多态性引物,对9个品种(系)扩增得到条带,共扩增出52条带,其中差异条带32条,多态性比率为61.54%,扩增片段大小为100～400 bp。选出4对SSR核心引物构建9个藕莲品种(系)的DNA指纹图谱。[结论]藕莲品种遗传多样性水平较低,4对引物组合所构建的DNA指纹图谱可用于藕莲品种鉴定。     

对甲霜灵不同敏感程度的辣椒疫霉的遗传多样性分析

为研究不同地区及对甲霜灵不同敏感程度的辣椒疫霉菌株间的遗传差异,采用RAPD分子标记对分离自安徽省和县等(15株)、江苏省南京市(1株)、四川省邛崃市(1株)的17个菌株及经甲霜灵处理筛选得到的3个抗性突变菌株进行了RAPD指纹分析。结果显示10对引物共扩增出30个比较清晰的条带,且均为多态性条带;当以遗传相似系数0.7为阀值时,可以将供试的20个菌株分为4个遗传聚类组,说明辣椒疫霉具有一定的遗传多样性。同时,RAPD分析结果还表明,经甲霜灵处理所筛选得到的抗性突变株与野生型敏感亲本之间存在一定的遗传变异,但是辣椒疫霉菌株对甲霜灵的敏感程度与RAPD的聚类分组没有相关性。     

中国大豆疫霉菌分布及毒力多样性研究

 通过大豆疫霉根腐病发生的田间调查、从病株和土壤中分离大豆疫霉菌 ,对大豆疫霉菌在我国的分布进行了研究 ,结果表明 ,除东北地区外 ,我国黄淮流域和长江流域也存在大豆疫霉菌。应用 13个鉴别寄主 ,对来自不同地区的 83个大豆疫霉菌分离物进行毒力鉴定 ,证明我国大豆疫霉菌存在丰富的毒力多样性。与植株分离物相比 ,土壤分离物的毒力多样性程度更高。对不同地区来源分离物的毒力组成比较表明 ,长江流域分离物的毒力多样性最丰富 ,其次是黄淮流域 ,而东北地区分离物的毒力组成相对简单。     

基于SSR标记的葡萄品种(系)遗传多样性分析与指纹图谱构建

[目的]对供试葡萄材料进行遗传多样性分析,构建其指纹图谱,为葡萄分类、种质鉴定和制干葡萄定向育种提供科学依据.[方法]利用SSR标记对新疆44个相对适宜制干葡萄(VitisL)品种(系)进行遗传多样性分析及指纹图谱构建.[结果]以52对SSR引物对供试材料的基因组DNA进行PCR扩增,筛选出8对多态性高、谱带清晰的引物.共扩增出190条带,均为多态性条带,多态性百分率为100;.多态性信息含量指数(PIC)变幅为0.686 8～0.964 0,平均为0.908 4.UPGMA聚类分析表明,44份葡萄品种(系)间遗传相似系数的变异范围为0.63～0.92,在遗传相似系数0.654处,可将44份供试材料分为5个类群,在一定程度上反映了品种之间的亲缘关系.利用Vmc9a2.1、UDV-017、UDV-033和UDV-041等4条引物构建了品种DNA指纹图谱,可区分44个供试材料.[结论]SSR标记方法可分析供试材料的亲缘关系,利用筛选出的4种引物可构建其DNA指纹图谱.     

用SSR标记和巢式PCR快速检测大豆疫霉菌

 【目的】建立快速、准确的大豆疫霉菌检测和病害早期诊断分子技术。【方法】基于大豆疫霉菌SSR标记Psc239设计两对引物Psc239EF/Psc239ER和Psc239F/Psc239R,建立特异性检测大豆疫霉菌的巢式PCR方法。【结果】用36个大豆疫霉菌分离物和25个其他卵菌和真菌分离物基因组DNA评价引物及巢式PCR的专化性,引物对Psc239EF/Psc239ER、Psc239F/Psc239R和巢式PCR反应只在大豆疫霉菌中分别扩增出519、242和242 bp的特异片段,在其它卵菌和病原真菌中不扩增片段;用两对引物进行常规PCR扩增,检测大豆疫霉菌DNA的灵敏度均为50 pg?μl-1,而巢式PCR的灵敏度为50 fg?μl-1;巢式PCR检测土壤中卵孢子的灵敏度为每克土壤0.4个卵孢子;巢式PCR能够特异地从大豆病株和土壤中检测到大豆疫霉菌。【结论】基于SSR标记建立的巢式PCR方法能够用于大豆疫霉菌的快速检测和病害诊断。     

Identification, Genetic Analysis and Mapping of Resistance to Phytophthora sojae of Pm28 in Soybean

Phytophthora sojae Kanfman and Gerdemann (P.sojae) is one of the most prevalent pathogens and causes Phytophthora root rot,which limits soybean production worldwide.Development of resistant cultivars is a cost-effective approach to controlling this disease.In this study,127 soybean germplasm were evaluated for their responses to Phytophthora sojae strain Pm28 using the hypocotyl inoculation technique,and 49 were found resistant to the strain.The hypocotyl of P1,P2,F1,and F2:3 of two crosses of Ludou 4 (resistant)×Youchu 4 (susceptible) and Cangdou 5 (resistant)×Williams (susceptible) were inoculated with Pm28,and were used to analyze the inheritance of resistance.The population derived from the cross of Ludou 4×Youchu 4 was used to map the resistance gene (designated as Rps9) to a linkage group.932 pairs of SSR primers were used to detect polymorphism,and seven SSR markers were mapped near the resistance gene.The results showed that the resistance to Pm28 in Ludou 4 and Cangdou 5 was controlled by a single dominant gene Rps9,which was located on the molecular linkage group N between the SSR markers Satt631 (7.5 cM) and Sat_186 (4.3 cM).     

Distribution and Virulence Diversity of Phytophthora sojae in China

By investigating occurrence of Phytophthora root rot in fields and isolating P. sojae from diseased plants and soils, the distribution of P. sojae in China was surveyed. In addition to northeast region, P. sojae existed in Huanghe-Huaihe basin and Yangtze basin too. Eighty- three isolates of P. sojae isolated from different areas were identified on virulence using 13differential soybean cultivars, abundant virulence diversity was found in P. sojae. The greater diversity in virulence of P. sojae was in isolates from soil than from plants. And the greatest virulence diversity of P.sojae was found in Yangtze basin.     

基于SSR荧光标记的79份桃种质遗传多样性分析

【目的】利用SSR荧光标记毛细管电泳技术对取自国家果树种质南京桃资源圃的79份种质进行基因分型和遗传多样性分析,筛选出多态性高的引物可用于桃品种间鉴定、亲缘关系分析,并用于分子标记辅助选种体系建立。【方法】对母本‘中油4号’进行从头测序,以物理距离1 Mb为单位在全基因组范围内开发SSR标记。以79个桃品种为材料进行PCR扩增,扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测后筛选目标条带清晰且多态性丰富的标记。对筛选出的标记进行5′端荧光修饰,PCR产物在ABI3730XL测序仪测序,实现对标记的复筛。利用Genemapper 4.0软件对测序结果进行统计,Data Formater 2.1软件将统计得到的bp数据转换成Power Marker v3.25软件所需要的数据格式。对筛选出的引物进行多态性分析,选择多态信息含量（PIC）大于0.45的荧光SSR引物作为79份种质材料的核心引物。以Nei’s为参数,利用NTSYSpc 2.1软件中的UPDM聚类方法分析品种间的遗传多样性。利用基于贝叶斯模型的Structure v2.3.4软件解析79份种质的居群遗传结构。【结果】基于79份种质,利用聚丙烯酰胺凝胶电泳对覆盖全基因的SSR标记进行初筛,共筛选出207对多态性良好的引物;利用SSR荧光标记毛细管电泳技术对207对引物进行复筛,最终筛选出26对核心引物,利用其中5对核心引物可将79份品种完全区分开。26对SSR核心引物在79份桃种质中共扩增出174种多态性基因型,每对引物扩增出的基因型为4—13种,平均每对引物扩增出6.69个基因型,每对引物的多态信息含量PIC在0.45以上。基于207对SSR引物在79份种质中扩增出的位点信息,构建了79份种质的遗传关系图谱和居群遗传结构图。207对引物从遗传距离上将79份种质划分为7组,从居群结构上分为2组。79份品种遗传多样性较高,部分品种聚类结果与系谱图相符。【结论】构建了79份材料的聚类分析图和居群遗传结构图,在一定程度上揭示了79份材料的亲缘关系。由于桃复杂的遗传背景,不能依据单一特性对品种间亲缘关系进行判定。本研究筛选出的26对核心引物可用于全基因组范围内连锁性状的鉴定、桃种质资源鉴定、新品种鉴定及保护、分子标记辅助育种体系构建。     

福建省大豆根腐病病原菌的鉴定

为明确福建省大豆根腐病病原菌的种类及组成,于2007～2009年从漳州、厦门、龙岩等地大豆产区采集根腐病标样216份,从中分离到307株丝状病原真菌.根据其培养性状、形态学特征、代表性菌株的致病性测定及rDNA-ITS序列分析,将这些病原菌分为5种,分别为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum,112株)、茄...     

绿豆高密度分子遗传图谱的构建

【目的】在前期研究的基础上,进一步利用绿豆基因组SSR、EST-SSR、STS和普通菜豆基因组SSR等标记构建绿豆遗传连锁图谱,为绿豆重要性状相关基因的定位、克隆及分子标记辅助选育新品种等研究搭建技术平台。【方法】利用澳大利亚引进的Berken（高感豆象绿豆栽培种）× ACC41（高抗豆象绿豆野生种）及其重组自交系（recombinant inbreed line,RIL）群体,对6 686对引物进行PCR扩增及多态性筛选,包括6 100对绿豆基因组SSR、149对EST-SSR、13对STS和424对普通菜豆基因组SSR引物,将亲本间多态性引物,进一步分析重组自交系群体。结合前期研究的分子标记数据,利用Mapmarker/Exp 3.0软件构建遗传图谱,并设置LOD≥3.0,最大图距50.00 cM。用Joinmap 4.0软件进行图谱整合。【结果】用2个亲本共筛选了6 686对SSR引物,共有3 691对引物有稳定的扩增产物,得到有多态的引物有588对。其中,通过磁珠富集法开发的绿豆SSR引物6 100对,有效扩增3 459对,有效扩增率56.7%,得到多态性引物559对;通过转录组测序开发的绿豆MGCP引物149对,有效扩增126对,有效扩增率84.6%,得到多态性引物21对;通过磁珠富集法开发的菜豆SSR引物424对,有效扩增97对,有效扩增率22.9%,得到多态性引物6对;绿豆STS引物13对,有效扩增9对,有效扩增率69.2%,得到多态性引物2对。表明不同来源和种类的SSR引物在RIL群体亲本中的有效扩增率有明显差别,绿豆EST-SSR引物（84.6%）最高,绿豆STS引物（69.2%）和SSR引物（55.7%）次之,菜豆SSR引物（22.9%）最低。获得一张含有585个标记（499个SSR标记、74个RFLP标记、9个STS标记和3个RAPD标记）的绿豆遗传图谱,图谱总长732.9 cM,包括11个连锁群,每个标记间的平均距离为1.25 cM,平均长度为66.63 cM。每个连锁群长度为45.2-112.8 cM,每条染色体上面的标记数为35-92个,平均53.18个。标记位点数最多的连锁群LG1含92个标记,长度为112.8 cM;标记位点数最少的连锁群LG11仅含有35个标记,长度为48.7 cM。对图谱的585个标记位点进行χ2测验,在P＜0.05和P＜0.01条件下,分别有79个和151个标记表现为偏分离,占总标记位点数的39.3%。【结论】构建了一张目前国内外发表的标记数最多、密度最高的绿豆遗传连锁图谱。