EPSPS基因克隆及其表达载体的构建

[目的]克隆大豆EPSPS基因并构建其表达载体,为培育抗草甘膦作物提供理论基础和技术储备.[方法]以抗草甘膦大豆总基因组为模板,扩增EPSPS基因,构建EPSPS基因的植物表达载体PCAMBIA1300-UBI-GFP-EPSPS,并导入农杆菌,使其能够进行作物的遗传转化.[结果]扩增获得EPSP基因全长1368 bp,共编码455个氨基酸.测序结果表明,其与GenBank(AF464188.1)中已知的CDS序列完全一致,成功构建了EPSPS值物表达载体,并将其导入农杆菌菌株EHA105中.[结论]构建的表达载体可用于甜高粱等单子叶作物抗草甘膦性状的遗传改良.     

土壤宏基因组中抗草甘膦新基因的克隆及其功能验证

【目的】从土壤宏基因组中克隆新的抗草甘膦新基因,并对其功能进行验证,为培育抗除草剂转基因新品种奠定基础。【方法】利用被草甘膦污染的土壤建立宏基因组文库,经筛选从中成功克隆了一个新的具有草甘膦抗性的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)基因(命名为soilA)。构建了Prrn启动子驱动soilA基因的原核表达载体pSYTH-soilA,将其导入大肠杆菌进行原核草甘膦抗性试验,构建了35S启动子驱动soilA基因的植物表达载体pC330E,利用农杆菌介导法转化烟草,并对经PCR和胶体金试纸条鉴定的转基因烟草植株进行草甘膦耐受能力检测。【结果】序列分析表明,所获得的soilA基因长1 347bp,编码448个氨基酸,经BLAST分析,结果表明其属于ClassⅡ型EPSPS基因家族。原核表达soilA可使受体菌具有耐受1 200mmol/L草甘膦。构建soilA植物表达载体pC330E,通过农杆菌介导法将其导入烟草,经PCR和胶体金试纸条检测共获得107株阳性烟草植株,经过喷洒试验获得了3株高耐受草甘膦植株,这3株转基因烟草最高可耐受200mmol/L草甘膦。【结论】新克隆的编码EPSPS的soilA基因能够提高受体材料的草甘膦耐受能力。     

抗草甘膦与磷高效吸收基因双价表达载体的构建及对甘蓝型油菜的遗传转化

【目的】甘蓝型油菜是产油效率较高的油料作物,在其生长过程中往往伴随着土壤环境中磷素匮乏及杂草胁迫,严重影响着最终产量和品质.因此,同时解决有效磷匮乏及草害问题已经成为目前油菜研究的重要方向.【方法】采用PCR法克隆得到了与草甘膦抗性(eCTP和EPSPS)和磷高效吸收(Pht1;2和phyA)的相关目的基因,随后构建了双价植物表达载体,通过农杆菌介导法转化甘蓝型油菜,对转化植株进行PCR检测筛选,并通过qRT-PCR法对筛选的阳性植株内目的基因的表达进行定量分析.【结果】将PCR扩增得到的片段经琼脂糖凝胶电泳检测,结果符合预期.测序结果也与GenBank注册序列同源性高度一致,可用于后续试验.对转基因油菜进行草甘膦抗性筛选和PCR扩增检测,共获得5株转基因阳性植株.实时荧光定量结果发现转基因阳性植株内phyA和EPSPS基因的表达量均较对照植株有显著提高.【结论】本研究成功构建了抗草甘膦和磷高效吸收基因双价植物表达载体,获得的转基因阳性植株同时兼具草甘膦抗性及磷素高效吸收利用的特性,为培育甘蓝型油菜优良种质资源提供了理论依据.     

种子特异启动子的DGAT基因植物表达载体构建

利用PCR技术从甘蓝型油菜(Brassica,napus L.)的基因组DNA和拟南芥(Arabidopsis thaliana)cDNA中分别扩增种子特异启动子napin和二脂酰甘油酰基转移酶(DGAT)基因片段,并将它们依次插入到植物表达载体pCAMBIA1390的多克隆位点处,构建了种子特异启动子napin驱动的DGAT基因植物表达载体p1390ND,冻融法将其导入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404、EHA105和AGL1中,PCR检测结果证明,重组质粒p1390ND已成功导入农杆菌细胞.该载体可应用于油料能源植物种子含油最的遗传改良.     

谷子EPSPS基因的分离、修饰及表达载体的构建

5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)是植物莽草酸合成途径中的一个重要酶,与芳香族氨基酸及其次生代谢物的合成有关。利用RT-PCR方法,从谷子中分离到5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶基因Si EPSPS,全长1 573 bp,开放阅读框1 536 bp,编码511个氨基酸。同源序列比较发现,Si EPSPS氨基酸序列与小麦、短柄草、高粱的EPSPS序列高度同源。结构同源性分析表明,Si EPSPS与其他植物一样,均具有2个序列保守的结构域。对其启动子序列分析显示,该片段富含ABRE、TC-rich repeats、TCA-element等响应胁迫的顺式作用元件。针对草甘膦结合位点,对Si EPSPS基因进行定点修饰。为研究其功能,构建植物表达载体p WM101-EPSPS,并导入农杆菌进行检测。测序结果比对表明,突变型EPSPS基因在173位的脯氨酸变为丝氨酸,为后续EPSPS的真核表达奠定了基础。     

抗草甘膦基因(EPSPS)植物双价表达载体的构建

针对目前报道的抗草甘膦转基因作物中,强组成型启动子驱动抗草甘膦基因在转基因植物的所有部位和所有发育阶段都表达,增加植株代谢负担,对植物的产量可能引起负效应的这一问题,利用Ag2这种草甘膦胁迫诱导启动子来驱动epsps基因,只在草甘膦喷施后高效表达对草甘膦的抗性.另外,同时利用具有组织特异性的启动子RuBP,使epsps基因在植物草甘膦农药田间喷施主要部位叶片中高效表达,应可以进一步增强转基因植物的抗草甘膦能力,但又不致过多地增加转基因植物的代谢负担,以利培育高抗草甘膦且农艺性状优良的转基因植物.实验分别以pBI121-E-M-Bt(Kanar)和pBI121-CP4E(Kanar)质粒为基础,通过载体pUC19及对EcoRⅠ位点的接头改造,构建了由RuBP启动子和新发现的诱导型启动子Ag2共同调控epsps基因的植物表达载体pGBI-Ag2EM-RuBPEM和pGBI-Ag2CP4E-RuBPCP4E,选择标记为卡那霉素,通过冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌LBA4404,并通过农杆菌介导的浸花法转化拟南芥,获得了T0代种子,为利用epsps基因改良植物对草甘膦的抗性奠定了物质基础.     

薤白EPSP基因对亚麻的转化及检测

薤白EPSP基因编码5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶,对除草剂草甘瞵具有一定的抗性.利用该基因构建植物表达重组体.薤白EPSPcDNA重组到植物表达载体pWM101中,构建成35S启动子控制的植物组成型表达载体,利用农杆菌介导法将其转入亚麻,经过潮霉素筛选获得了抗性的愈伤组织,诱导分化后获得了亚麻苗.经特异引物的PCR扩增,证明目的基因已经整合到亚麻基因组中,对转基因亚麻愈伤组织及幼苗进行的草甘膦抗性检测表明,转基因亚麻对草甘膦的耐受性明显提高.     

蒺藜苜蓿二氢黄酮还原酶基因克隆及植物表达载体构建

采用RT-PCR方法,从蒺藜苜蓿(Medicargotrunctula)中克隆了二氢黄酮还原酶(DFR)基因cDNA片段,并进行DFR基因植物表达载体的构建.结果表明:扩增的DFR基因片段全长约1 000 bp,编码337个氨基酸,与Gen-Bank中已注册的DFR基因核苷酸序列的同源性为99.80%.以pBI121为基础载体,构建了CaMV35S启动子驱动的DFR基因的植物表达载体pBIDFR,然后导入农杆菌EHA105,经PCR验证确定构建出植物表达载体.     

农杆菌介导法将深黄被孢霉△6-脂肪酸脱氢酶基因(D6D)导入油菜的研究

△6-脂肪酸脱氢酶基因可将亚油酸转化为γ-亚麻酸。我们将克隆的深黄被孢霉△6-脂肪酸脱氢酶基因(D6D)插入植物表达载体pBI121,构建了重组质粒pBI121-D6DMI。通过农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导途径,将深黄被孢霉△6-脂肪酸脱氢酶基因导入了甘蓝型油菜恢复系,经过诱导分化获得抗卡那霉素的再生植株。PCR检测及Souther杂交结果表明,外源基因△6-脂肪酸脱氢酶基因已整合到油菜再生植株的基因组中。     

含抗草甘膦CP4-EPSPS基因和耐逆Trihelix类转录因子GmGT-2A基因的植物表达载体构建及转化验证

高效易用的植物表达载体在基因功能相关研究中起着重要的作用。以植物表达载体p BA002为基础载体,使用抗草甘膦CP4-EPSPS基因替换原载体的Bar筛选标记基因,获得新的植物表达载体p ES002。将大豆耐逆相关Trihelix类转录因子Gm GT-2A连接到p ES002,构建了同时含耐逆相关基因和抗除草剂标记基因的植物表达载体p ES002-Gm GT-2A。利用农杆菌介导的花序浸润法转化拟南芥,并对转基因植株进行抗草甘膦和耐盐性鉴定。结果表明,转基因植株在抗草甘膦和耐盐性上均显著强于对照,表明该载体可以用于转基因相关的基因功能研究。