弓形虫分子免疫学研究进展

弓形虫病是由刚第弓形虫引起的一种危害严重的全球性人兽共患寄生虫病,全世界各国学者对此原虫的研究十分重视,尤其是近年来对其免疫学的研究成果对深入了解该原虫的致病机理和进行有效的免疫预防非常重要。从宿主感染弓形虫后的免疫效应、免疫诊断及其疫苗等方面阐述了弓形虫分子免疫学研究进展。     

两种兔艾美耳球虫顶质体rpoB和TufA基因的扩增及序列分析

为了探讨顶质体序列在顶复门寄生虫遗传进化研究中的意义,应用PCR技术扩增了兔维氏艾美耳球虫(Eimeria vejdovskyi)和无残艾美耳球虫(E.irresidua)顶质体rpoB和TufA基因序列,并利用生物学软件与GenBank中收录的顶复门寄生虫相关序列进行比对和进化分析。结果表明:扩增的两种兔艾美耳球虫rpoB和TufA基因片段的大小均相同,分别为469 bp和481 bp,两种球虫rpoB和TufA基因种间的差异分别为6.8%和0.2%,rpoB基因差异相对较大,而TufA基因差异较小。因此,rpoB基因序列可以作为兔艾美耳球虫种间的遗传标记,用得到的rpoB基因序列为参考与其他顶复门寄生虫进行进化分析进一步证明了该结论,实验首次报道兔艾美耳球虫顶质体rpoB和TufA基因的部分序列,为兔艾美耳球虫的鉴定和进化分析提供参考依据,也为顶复门顶质体的深入研究奠定了基础。     

马泰勒虫RON2基因的原核表达及生物信息学分析

【目的】对马泰勒虫棒状体颈部蛋白2（RON2）进行原核表达和生物信息学分析,为后续蛋白互作试验提供材料基础。【方法】以马泰勒虫新疆分离株为研究对象,克隆其RON2基因,并与GenBank中已知的马泰勒虫美国WA株基因组数据和顶复门原虫RON2基因序列本地数据库进行BLAST比对,确定其进化关系。构建重组表达载体pET-32a-RON2,融合表达重组蛋白,对RON2基因编码蛋白进行生物信息学分析。【结果】马泰勒虫新疆株RON2基因（NCBI登录号MT939257）长3 920 bp,高度保守,与顶复门原虫RON2基因核苷酸和氨基酸序列的相似性分别为31.2%～82.7%和23.8%～79.5%。成功构建原核表达重组质粒,获得的RON2融合重组蛋白分子质量为26 ku,为包涵体蛋白。生物信息学分析表明,RON2蛋白是一种碱性、不稳定亲水性跨膜蛋白,二级结构以α螺旋为主,亲水性较差,抗原性较弱,与其他顶复门原虫RON2蛋白具有相似的三级空间特殊结构和氨基酸序列,且可能与其他入侵蛋白存在相互作用关系。【结论】获得马泰勒虫新疆株RON2基因,诱导表达获得部分RON2融合重组蛋白,该蛋白存在与其他入侵相关蛋白相互作用的位点,可能参与了虫体入侵宿主细胞的过程。     

RNA干涉技术研究进展

RNA干涉是由双链RNA引起的转录后基因沉默机制.RNAi作为一门新的基因沉默技术,具有序列特异性和高效性等许多优点,在基因功能研究、疾病治疗、药物开发等方面具有广泛的应用.综述RNAi现象的发现、发生机制及其应用,并展望未来的研究.     

猪弓形体病的防治建议

<正>弓形虫病是由顶器门、真球虫目、肉孢子虫科、弓形虫属的龚地弓形虫引起的一种人兽共患的寄生性原虫病。弓形虫病呈世界性分布,在人、家养动物和野生动物中广泛传播,据估计全球有超过1/3的人口感染弓形虫。大多数温血动物都可以成为弓形虫的中间宿主,中间宿主感染弓形虫的主要途径为经口感染:(1)食用了被孢子化卵囊污染的饮水和食物;(2)食用了含有组织包囊的生肉(Dubey,2004)。     

弓形虫速殖子缓殖子转化调控机制研究进展

正刚地弓形虫(Toxoplama gondii)是一种重要的人兽共患病原体,与疟原虫、巴贝斯虫以及柔嫩艾美尔球虫同属于顶复门寄生虫,长期以来给公共卫生安全和畜禽生产发展带来巨大威胁。弓形虫速殖子和缓殖子可引起急性和慢性感染,两者的相互转化是引起致病的主要原因。目前只有针对速殖子时期的治疗药物,掌握弓形虫速殖子和缓殖子转化的调控机制,对筛选有效的药物靶标和疫苗具有重要意义。     

基因功能缺失技术及研究现状

基因功能缺失是目前研究基因功能最重要、最有效的手段之一。目前应用比较广泛的基因功能缺失技术主要有反义RNA技术、RNA干扰技术、ZFN技术、TALEN技术、CRISPR-Cas系统等。这些技术通过抑制或者沉默特定基因的表达,研究生物体相关表型变化,推测该基因的相关功能。在实际研究中,基因功能缺失往往和基因过量表达一起,为基因的功能研究提供最直接的证据,在生物、医学、农业等领域得到广泛应用。本研究系统介绍了几种常用的基因功能缺失技术的发展历程、技术原理及应用等,并展望未来的研究和应用。     

分子技术在弓形虫早期检出中的研究进展

目前用于诊断弓形虫病的技术主要有病原学方法、免疫学方法和分子生物学方法。文章主要简述了分子生物学方法在弓形虫感染早期检出中的研究进展。其中PCR技术已逐步从纯粹的分子生物学技术向临床应用发展,由于其方法简便,敏感性、特异性高,在临床检测上发挥越来越大的作用;分子杂交技术由于所需标本量少,甚至几个拷贝病原微生物DNA即可扩增到常规可检测水平,具有较高特异性和敏感性,在弓形虫的基因诊断中仍占有重要地位;基因芯片技术在弓形虫的检出方面会有良好的前景。     

RNA干涉技术及其在哺乳动物中的应用进展

RNA干涉(RNA interference,RNAi)作为一种有效的用于转录后基因沉默,从而抑制特定基因表达的技术,近年来在哺乳动物细胞中的研究已取得了长足发展,且在基因功能以及疾病治疗的研究中有着广阔的应用前景。研究表明,哺乳动物细胞中的RNAi作用方式与植物有所不同,笔者对哺乳动物RNAi技术的发展、作用机制及其在基因功能、基因治疗、转基因动物研究、药物开发等方面的应用做了综述。     

RNA干扰技术及其在烟草中的应用研究进展

基因工程技术近年来在作物研究领域发展迅速,RNA干扰(RNAi)作为一项重要的基因沉默技术,具有高效性且特异性强的显著特点,现已广泛应用于后基因组时代,对研究作物基因功能,抗性和品质改良等有着重要作用。中国烟草研究已进入基因组时代,随着烟草基因组测序的开展,RNAi作为一门反向遗传学技术在烟草中的应用越来越多。本文介绍了RNAi技术的作用机制和特点,重点介绍了RNAi在烟草基因功能研究、抗病研究、抗虫研究及烟草品质改良研究中的应用,并对RNAi技术在烟草中的应用前景进行了展望。     

Host cell invasion by apicomplexan parasites: insights from the co-structure of AMA1 with a RON2 peptide

Apicomplexan parasites such as Toxoplasma gondii and Plasmodium species actively invade host cells through a moving junction (MJ) complex assembled at the parasite-host cell interface. MJ assembly is initiated by injection of parasite rhoptry neck proteins (RONs) into the host cell, where RON2 spans the membrane and functions as a receptor for apical membrane antigen 1 (AMA1) on the parasite. We have determined the structure of TgAMA1 complexed with a RON2 peptide at 1.95 angstrom resolution. A stepwise assembly mechanism results in an extensive buried surface area, enabling the MJ complex to resist the mechanical forces encountered during host cell invasion. Besides providing insights into host cell invasion by apicomplexan parasites, the structure offers a basis for designing therapeutics targeting these global pathogens.     

Role of Toxoplasma gondii myosin A in powering parasite gliding and host cell invasion

Obligate intracellular apicomplexan parasites rely on gliding motion powered by their actomyosin system to disperse throughout tissues and to penetrate host cells. Toxoplasma gondii myosin A has been implicated in this process, but direct proof has been lacking. We designed a genetic screen to generate a tetracycline-inducible transactivator system in T. gondii. The MyoA gene was disrupted in the presence of a second regulatable copy of MyoA. Conditional removal of this myosin caused severe impairment in host cell invasion and parasite spreading in cultured cells, and unambiguously established the pathogenic function of this motor in an animal model.     

牛巴贝斯虫DXS基因的克隆和真核表达

【目的】顶质体是存在于包括疟原虫和巴贝斯虫在内的顶复门寄生虫的一种细胞器,在病原体中,它主要承载类异戊二烯前体和脂肪酸合成途径,异戊二烯五碳结构是有机体合成多种化合物的结构基础,对有机体生命活动至关重要,例如,在哺乳动物中成为胆固醇和类固醇激素的基本结构,在植物中参与合成类胡萝卜素。且存在于顶质体的类异戊二烯前体合成途径对于病原体的生命活动至关重要且不存在于人类和哺乳动物机体,这使其成为近年来人们研究抗原虫药物的焦点。有学者发现利用特异性阻断类异戊二烯代谢途径的药物可治疗疟疾。1-脱氧-5-磷酸 D-木酮糖合成酶（DXS）为该途径中的第一个限速酶。因此,针对牛巴贝斯虫的1-脱氧-5-磷酸 D-木酮糖合成酶dxs基因进行克隆和序列分析,并对其进行真核表达和活性检测,以期获得具有活性的1-脱氧-5-磷酸 D-木酮糖合成酶,为进行针对该酶的特异性抑制剂的筛选奠定基础。【方法】首先采用反转录PCR技术从牛巴贝斯虫陕县株总RNA中扩增出DXS基因的全长cDNA,并对其进行克隆测序,对测序结果进行序列分析,将阳性克隆亚克隆至带荧光标签的真核表达载体,利用脂质体转染法将重组真核表达质粒转染至Hela细胞,利用倒置荧光显微镜观察转染细胞的表达情况,消化收集转染细胞,通过超声破碎后采用Western blot技术对DXS蛋白的表达情况进行检测,结合G418压力筛选以及有限稀释的方法对转染阳性细胞进行筛选,获得阳性单克隆细胞。在体外建立DXS酶反应体系,并利用液相质谱联用技术对表达产物的体外活性进行检测。【结果】扩增得到的DXS基因全长共2 061 bp,共编码686个氨基酸,与GenBank上T2Bo株相应基因相似性达到98.0%。利用生物信息学方法对该蛋白质的二级结构进行分析发现,该酶具有3个结构域,分别是焦磷酸硫胺素结合区域;焦磷酸硫胺素嘧啶环结合区域;转酮醇酶C端区域,该酶属于常见的TPP依赖蛋白酶家族。通过倒置荧光显微镜观察,转染重组质粒后的Hela细胞呈现绿色荧光,Western blotting结果显示融合绿色荧光蛋白的DXS酶大小约为102 kD,表明构建的真核表达重组质粒在Hela细胞中进行了正确的表达。通过结合G418加压和有限稀释法筛选得到稳定转染重组质粒PEGFG-DXS的阳性单克隆细胞。利用质谱技术检测到在细胞粗提物与反应混合物反应后的产物中有分子量与DOXP相同的产物存在,在阳离子模式下m/z=237,表明表达产物具有催化活性。【结论】成功的表达了具有活性的牛巴贝斯虫DXS酶,并对融合蛋白的活性进行了定性分析,为今后开展针对DXS酶的特异性化合物体外高通量筛选研究提供了材料。对研究针对DXS为靶标的抗原虫药物具有重要意义,为深入研究该酶的酶学性质和特异性抑制剂筛选奠定了基础。     

新城疫病毒F基因真核表达载体的构建及瞬时表达

应用PCR扩增出新城疫病毒F基因,将其克隆入pGEM-T载体,测序。然后将NDVF基因与高效的真核表达载体pcDNA4/HisMax相连,构建NDVF基因重组真核表达质粒pc4F,采用Superfect转染试剂将pc4F瞬时转染COS-7细胞,应用细胞免疫组化法检测其在细胞中的表达情况。结果表明,F基因能够在COS-7细胞中成功表达。     

Transient Expression of Exogenous Gene into Plant Cell Mediated by PEI Nanovector

This study was carried out to investigate the transfection effect of exogenous gene into plant protoplast cell mediated by polyethylenimine (PEI) nanovector, based on PEI gene delivery system in the field of medical science. PEI/DNA complexes were prepared by using PEI polymer to bind the plant expression plasmid, pCMI205-GFPn. The ability of PEI combining and protecting DNA was investigated by agarose gel electrophoresis retardation assay. The surface characteristics of PEI/DNA complexes were observed with transmission electron microscope. The transfection efficiency of Arabidopsis thaliana protoplasts mediated by PEI/DNA complexes at different N/P ratios was analyzed based on observation of transient expression of green fluorescent protein with confocal laser scanning microscope. PEI could bind and condense DNA, and form stable 100-200 nm PEI/DNA complexes when the proportion of PEI and DNA is in the range of 5:1-1:4.Transfection efficiency of PEI/DNA complexes increased with N/P ratios in range of N/P＜5 and reached the highest at N/P=5, and began to decrease beyond N/P＞5 as higher toxicity to cells. The transfection efficiency of PEI/DNA complexes at N/P=5 was higher than PEG. This study confirmed that PEI nanovector could effectively mediate foreign gene entering into A. thaliana protoplast cell to obtain transient expression, which may be developed as a hopeful and novel transgenic method combined with plant protoplast regeneration.     

雌二醇依赖性的细胞表达载体的研究

 根据雌激素类化合物在机体内的作用机理，以增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因为报告基因构建了4个启动子不同的表达载体(pERE-SV-EGFP, pERE-TA-EGFP, pERE-CMV-EGFP, pERE-TK-EGFP)。以这些表达载体瞬时转染MCF-7细胞，报告基因的基础表达与启动子的强度相关。以17β-雌二醇(E2 ,10-9 mol·L-1)诱导表达载体瞬时转染的MCF-7细胞，发现在表达载体pERE-TA-EGFP、pERE-TK-EGFP、pERE-SV-EGFP转染的MCF-7细胞中，E2能诱导2倍以上的报告基因的表达。这表明在这些瞬时表达系统中报告基因的表达是雌激素依赖性的，因此这些表达载体可用于稳定转染以建立稳定表达分析系统。     

Hycanthone resistance: development in Schistosoma mansoni

Following the administration of relatively high doses of the antischistosomal drug hycanthone to mice and hamsters infected with Schistosoma mansoni, a number of the worms survived. After a period of 6 to 12 months these parasites resumed production of viable eggs that gave rise to schistosomes that proved resistant to hycanthone and to two other related antischistosomal compounds. This drug resistance has remained stable for three subsequent generations of worms.     

5株堆型艾美耳球虫顶质体rpoB基因的扩增及序列分析

以5株堆型艾美耳球虫为研究对象,对其顶质体rpoB基因的部分序列进行了PCR扩增、测序及序列分析,并与GenBank上发表的柔嫩艾美耳球虫及其他顶复门寄生虫相关序列进行比较,研究顶质体的遗传变异情况。结果表明,从堆型艾美耳球虫不同来源虫株均获得了469bp的目的片段,应用DNAStar软件进行序列对比发现,5株堆型艾美耳球虫的顶质体rpoB序列完全一致,与柔嫩艾美耳球虫相应序列的相似性为92.75%,而与刚地弓形虫和疟原虫的相似性分别为67.23%和64.62%。首次报道了堆型艾美耳球虫rpoB序列,显示rpoB基因序列保守,不同来源堆型艾美耳球虫虫株的序列没有差异,为进一步研究艾美耳球虫的群体遗传学奠定了基础。