基于线粒体DNA全序列11个蛋白编码基因拼接序列的鳞翅目昆虫系统发育研究

目前已测定线粒体DNA全序列的鳞翅目昆虫有12种。由于高变异性和强核苷酸组成偏好性,去除了两个蛋白基因和两个物种,最终以10个鳞翅目物种的11个蛋白编码基因拼接序列对鳞翅目分子系统发育关系进行了研究。与前人的结果一致,基于11个蛋白编码基因拼接序列数据所构的最大似然树支持鳞翅目,鳞翅目内各总科和各科均为单系群。与MINET[1]基于形态学数据的结果相同,各总科的系统发育关系为{卷蛾总科+[螟蛾总科+(尺蛾总科+蚕蛾总科)]}。蚕蛾总科内各科系统发育关系类似于REGIER等[2]的结论。     

闽鸠蝙蛾（鳞翅目：蝙蝠蛾科）线粒体基因组全序列测定和分析

本研究旨在从线粒体基因组水平探讨闽鸠蝙蛾（Endoclita minanus Yang）在蝙蝠蛾科（Hepialidae）内的分类地位。通过Illumina MiSeq平台测序技术测定闽鸠蝙蛾线粒体基因组全序列，分析其结构特点和碱基组成；使用最大似然法构建蝙蝠蛾科9种昆虫线粒体基因组的系统发育树，分析其在蝙蝠蛾科内的系统发育关系。结果显示：闽鸠蝙蛾线粒体基因组全长15 248 bp，包含13个蛋白质编码基因、22个转运RNA基因、2个核糖体RNA基因和一段典型的鳞翅目昆虫线粒体基因组基因排列的A+T富含区，且A+T含量为81.18%。闽鸠蝙蛾的线粒体基因组排列顺序为trnI-trnQ-trnM，与其他蝙蝠蛾科昆虫顺序相同，而与鳞翅目其他昆虫的线粒体基因组排列顺序（trnM-trnI-trnQ）不同。基于线粒体基因组分析，得到蝙蝠蛾科9种昆虫的系统发育关系为无钩蝠蛾属（Ahamus）+{棒蝠蛾属（Napialus）+[蝙蝠蛾属（Endoclita）+钩蝠蛾属（Thitarodes）]}。闽鸠蝙蛾线粒体基因组存在基因重排现象，系统发育分析支持闽鸠蝙蛾和桉蝙蛾聚为一支。本研究为掌握蝙蝠蛾科昆...     

茶六斑褐锦斑蛾Sorita pulchella线粒体基因组特征与系统发育分析

【目的】了解茶六斑褐锦斑蛾(Sorita pulchella)线粒体基因组特征，探究其分类地位，并分析蛾类高级分类阶元的系统发育关系。【方法】野外采集西藏自治区林芝市易贡茶场发生的茶六斑褐锦斑蛾。采用高通量测序的方法获得线粒体基因组序列并分析其基因组结构特征；用最大似然法和贝叶斯法构建系统发育树，探讨鳞翅目斑蛾科昆虫系统发育关系。【结果】茶六斑褐锦斑蛾(GenBank登录号：MZ157403)线粒体基因组序列的总长度为15 216 bp,编码37个基因，即13个蛋白质编码的基因、22个tRNA基因、2个rRNA基因(rrnL和rrnS)和1个A+T富含区。其基因组成与其它已知的鳞翅目昆虫一致。蛋白质编码基因的A+T的含量为77.7%,长度为10 830 bp。tRNA中的A+T的含量则为80.9%。22个tRNA的二级结构仅trnS1缺少二氢尿嘧啶环，其它tRNA的二级结构都为典型的三叶草型。20个种进行了系统发育分析，包括两个外群。贝叶斯系统发育树显示斑蛾科内的系统发生关系为：(Zeuzera multistrigata+Endoxyla cinereus)+(((Apoda lim...     

猎蝽科昆虫线粒体基因组的比较研究

线粒体基因组是系统发育常用的分子标记,本研究旨在对猎蝽科昆虫的线粒体基因组进行比较研究,着重分析基因重排、碱基组成、密码子使用偏好性等特征,并构建基于13个蛋白编码基因的系统发育关系。在GenBank数据库下载猎蝽科11亚科30属代表物种的线粒体基因组序列,通过Geneious 8.0.4抽提各编码基因的序列。利用MEGA 7.0统计碱基组成、氨基酸和核苷酸序列信息位点、起始密码子、终止密码子、相对密码子使用频率（RSCU）等序列基本信息。另外,利用DnaSP 6.0计算蛋白编码基因的非同义替换率（K_a）和同义替换率（K_s）,并通过K_a/K_s值比较基因的核苷酸进化速率。通过jModelTest选择进化模型,在MrBayes 3.2.2软件中构建基于贝叶斯法（BI）的系统发育树。结果表明：猎蝽科线粒体基因组均呈共线性结构,没有发现大面积的基因重排现象,只有部分序列中rrnS和trnT基因编码方向与原始序列编码方向相反,trnR和cytb基因出现多拷贝的现象。猎蝽科线粒体最常使用ATN起始密码子和TAA...     

牦牛DAZL基因编码区的克隆和序列特征与进化分析

根据黄牛DAZL基因序列设计引物,通过PCR扩增和克隆测序获得牦牛睾丸组织DAZL基因编码区序列,利用生物信息学软件分析牦牛DAZL基因编码区序列结构以及与其他物种的系统发育关系.结果表明:牦牛DAZL基因cDNA序列长度为1782 bp,编码区全长885 bp,编码295个氨基酸,与黄牛的氨基酸序列同源性为98.31%;牦牛DAZL蛋白含有DAZ基因家族所具有的典型的RNA结合域和DAZ重复基序.系统发育分析显示:牦牛与黄牛首先聚为一类,然后与哺乳纲的其他物种相聚,而与鱼纲、爬行纲动物的亲缘关系最远.     

白边大叶蝉线粒体基因组测序与分析

采用引物步移法测得白边大叶蝉Kolla paulula(Walker)线粒体基因组90%左右的序列,并分析了该叶蝉的线粒体基因组特征。基于23个物种(半翅目)的蛋白编码基因序列,以最大似然法和贝叶斯法构建了头喙亚目系统发育树。已测得序列长度为13 579 bp(AT:73.33%),其中包含了13个蛋白编码基因、21个t RNA基因和1个r RNA基因。除了ND5基因使用GTT作为起始密码子外,其他所有蛋白编码基因均使用ATN作为起始密码子;除了CO II使用不完整的T作为终止密码子,其他所有蛋白编码基因均使用TAA或TAG作为终止密码子。21个t RNA基因中,除了t RNASer(AGN)缺失1个稳定的茎环结构外,其他所有t RNA基因均能形成典型的三叶草二级结构。系统发育分析结果表明,进化树明显可以被分为沫蝉总科+(角蝉总科+蜡蝉总科);白边大叶蝉属于角蝉总科的叶蝉科,白边大叶蝉线粒体基因组特征与其他叶蝉科昆虫相同。     

褐兜蝽线粒体全基因组序列及系统发育分析

褐兜蝽(Coridius brunneus)是一种常见农林害虫,主要为害洋丝瓜和南瓜等葫芦科植物,常与药用昆虫九香虫混合发生.通过高通量测序技术,组装、拼接获得褐兜蝽线粒体基因组全序列,对其进行分析并基于13个蛋白质编码基因(PCGs)构建系统发育树.结果表明：褐兜蝽线粒体基因组的序列全长为15 792 bp(GenBank登录号：MW899158),包含13个PCGs、22个tRNAs、2个rRNAs和1个D-loop区,核苷酸组成及基因排布序列与异翅亚目昆虫一致;线粒体全序列A+T含量为75.16%,G+C含量为24.84%;预测了22个tRNAs的二级结构,除trnV缺失DHU臂外,其余均为典型的三叶草结构;系统发育分析表明兜蝽科与荔蝽科互为姐妹群关系,且兜蝽科下5个物种的系统发育关系为[(褐兜蝽C.brunneus+九香虫C.chinensis)+(短角瓜蝽Megymenum brevicorne+细角瓜蝽M.gracilicorne)]+小皱蝽Cyclopelta parva.可见,褐兜蝽与九香虫亲缘关系最近,与传统形态分类结果一致.     

粘虫核糖体蛋白S11基因cDNA的克隆和序列分析

【目的】克隆和鉴定粘虫核糖体蛋白S11(Ribosomal Protein S11,RPS11)基因,为昆虫核糖体蛋白功能的研究提供基础资料。【方法】运用RT-PCR和RACE技术,以粘虫cDNA为模板,对RPS11基因进行克隆,获得其全长cDNA序列,并利用生物信息学方法,对RPS11基因全长cDNA序列及推测得到的RPS11蛋白氨基酸序列进行分析,构建其系统进化树。【结果】获得的粘虫核糖体蛋白S11基因(RPS11)cDNA序列长度为521 bp,其中包括26 bp的5′非编码区、36 bp的3′非编码区和459 bp的开放阅读框,编码一个由152个氨基酸组成的蛋白,其具有核糖蛋白S17蛋白家族典型特征。推测得到的粘虫RPS11蛋白的理论分子质量为17.737 9 ku,等电点为10.63,富含6种类型的特定功能位点,与同属夜蛾科的烟芽夜蛾(Heliothis virescens)的RPS11蛋白相似性高达97%。用Neigh-bor-joining(NJ)法构建基于RPS11氨基酸序列的系统发育树,结果显示,粘虫RPS11与烟芽夜蛾(H.virescens)、草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)和家蚕(Bombyx mori)等3种鳞翅目昆虫的亲缘关系较近。【结论】成功获得了粘虫RPS11基因全长序列(GenBank登录号为GQ222274),由其编码的核糖体蛋白RPS11属于核糖蛋白S17蛋白家族。     

牦牛TLR4基因的克隆测序及序列分析

旨在了解牦牛天然免疫受体TLR4基因特点。根据GenBank已公布的牛TLR4基因序列,分3段设计引物,测序、拼接克隆序列,并对所得序列进行生物信息学分析和预测。基因序列分析表明,克隆得到牦牛TLR4基因编码区全长2 807bp,开放阅读框2 526bp,编码氨基酸841个,N端含有27个氨基酸组成的信号肽,分子质量96.009 8ku,理论等电点为6.35。蛋白预测结果表明,TLR4编码蛋白整体表现为亲水性。同源性分析表明,10条序列当中牦牛与野牦牛、普通牛、绵羊等物种具有较高的同源性,在系统发育树中距离最近。说明TLR4基因序列具有较高的保守性。     

槟榔江水牛LALBA基因克隆及序列特征分析

【目的】α-乳清蛋白由LALBA基因编码,在乳糖合成中起着重要作用。近年在普通奶牛中发现该基因与泌乳性状关系密切,但在水牛中研究较少。为了揭示水牛LALBA基因的序列特征。【方法】本研究采用RT-PCR测序法对槟榔江水牛LALBA基因的编码区序列进行了克隆和生物信息学分析。【结果】槟榔江水牛LALBA基因的编码区全长429 bp,编码蛋白含142个氨基酸。其α-LA含有1个C型溶菌酶/乳蛋白家族结构域(AA20~138)和1个信号肽序列(AA19~20),无跨膜结构,是胞外分泌的亲水蛋白;其N末端疏水,C末端亲水;有4类功能活性位点。基于LALBA基因编码区序列的系统发育分析表明,槟榔江水牛与牛亚科物种聚在一起,揭示它们LALBA基因功能的相似性。在LALBA基因编码区共检测到5个SNP位点:c.63AG、c.107AG、c.147AG、c.249CT、c.291TC。这些变异位点全部处于Hardy-Weinberg不平衡状态,只有SNP107为异义替换,导致编码氨基酸由天冬氨酸变为甘氨酸。功能分析显示SNP107对槟榔江水牛α-LA功能没有影响。【结论】水牛LALBA基因的序列与其他牛科物种长度相同,其编码产物的结构、功能与其他牛科物种相似。本研究可为进一步研究LALBA基因在水牛泌乳过程中的作用机制奠定基础。     

家蚕谷氨酸转运蛋白基因克隆及序列分析

谷氨酸转运蛋白(EAAT)主要存在于神经、神经原及神经胶质细胞浆膜上,对胞外谷氨酸浓度进行调节,在维持细胞正常的生理状态、避免神经元过度兴奋方面起着重要的作用.利用鳞翅目粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)和双翅目拟暗果蝇(Drosophila pseudoobscura)的谷氨酸转运蛋白序列为问询序列,在家蚕基因组数据库中进行同源检索,找到2个EAAT基因的同源基因(BmEAAT),并进行了克隆测序.两个BmEAAT基因均含8个外显子,编码蛋白均为膜蛋白,各有8个跨膜结构域.多物种的同源基因序列的系统发生分析结果表明:家蚕的两个EAAT拷贝至少在鳞翅目与双翅目分化前就已存在.基因芯片数据显示BmEAAT的两个拷贝在家蚕5龄3天的组织表达模式有明显差异,表明这两个基因的功能可能已经分化.     

小片蝽线粒体基因组及蝽科系统发育分析

为了从线粒体基因组水平探讨小片蝽Sciocoris lateralis在蝽科的分类地位,丰富蝽科线粒体基因组基本数据,为蝽科系统发育进化研究提供一定的理论依据,通过高通量测序,首次测定并分析了小片蝽完整线粒体基因组（Genbank登录号：OP531920）,提取蝽科物种的13个蛋白编码串联序列（PCGs）,使用最大似然法、贝叶斯法构建系统发育树。结果显示,小片蝽昆虫的线粒体全基因组长度为15 445 bp,包括13个蛋白编码基因（Protein-codinggenes,PCGs）、2个rRNA基因（ribosomeRNAs,rRNAs）、22个tRNA基因（transferRNAs,tRNAs）和1个控制区（Control region）。小片蝽线粒体基因组结构排序与其他蝽科物种一致,均无基因重排现象。小片蝽线粒体全序列AT含量为74.26%,GC含量为25.74%。13个蛋白编码基因中,cox1、nad1和nad6的起始密码子为TTG,其余10个蛋白编码基因的起始密码子是ATT、ATA、ATG。在所测得的tRNA基因中,trnS1和trnV缺失DHU臂,其他20个tRNA均能折叠形成...     

金纹细蛾β-actin基因克隆及表达分析

为了明确β-actin基因在金纹细蛾定量实验中作为内参基因的可靠性。根据近缘物种同源基因设计简并引物,通过RT-PCR技术克隆得到金纹细蛾β-actin基因片段,并进行序列分析;利用QRT-PCR方法检测该基因在金纹细蛾不同发育时期及成虫5种组织间的表达情况。结果表明:金纹细蛾β-actin基因片段为594bp(GenBank登录号:KF880733),编码174个氨基酸残基,具有actin蛋白家族典型特征,富含4种类型特定功能位点,其氨基酸序列与其他鳞翅目昆虫的相似性均大于96%。金纹细蛾β-actin基因在其生长发育阶段稳定表达,无显著差异,可以作为研究金纹细蛾不同发育时期的内参;在成虫头、胸、足和翅4种组织间表达量无显著差异。     

斯氏珀蝽和青革土蝽的线粒体基因组及系统发育分析

【目的】分析斯氏珀蝽和青革土蝽的线粒体基因组特征及蝽总科的系统发育关系,为更好地理解蝽总科下科级和种级水平的亲缘关系提供依据。【方法】通过测序分析了斯氏珀蝽和青革土蝽的线粒体全基因组数据,并基于此,以已经公布线粒体基因组数据的蝽总科的113个物种和本研究的2种昆虫为内群,2种红蝽总科昆虫为外群,分别利用最大似然法和贝叶斯法构建系统发育树。【结果】斯氏珀蝽和青革土蝽的线粒体基因组均包含37个基因(13个蛋白质编码基因、2个核糖体RNA基因和22个转运RNA基因)和1个非编码控制区;两种昆虫的线粒体基因组全长分别为15 346、14 632 bp(GenBank序列号：OP919327和OP930890)。两种方法构建的系统发育树一致支持蝽科、龟蝽科、盾蝽科、兜蝽科、荔蝽科、土蝽科、同蝽科、异蝽科和Megarididae均为单系群;斯氏珀蝽与珀蝽为姐妹群,青革土蝽与Macroscytus subaeneus为姐妹群。【结论】斯氏珀蝽与珀蝽亲缘关系最近,青革土蝽与Macroscytus subaeneus亲缘关系最近。     

2个新的鳞翅目OR83b类化感蛋白基因的克隆和序列分析

【目的】分离和克隆昆虫触角中一类非常保守的嗅觉受体蛋白基因全序列。【方法】采用简并引物反转录多聚酶链式反应(RT-PCR)和cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆基因,用生物信息学方法对获得的cDNA全序列及推导的氨基酸序列进行分析。【结果】从甜菜夜蛾(Spodoptera exigua Hübner)和斜纹夜蛾[Spodoptera litura(Fabricius)]雄蛾触角中扩增得到2个分别为1906bp和2483bp的OR83类化感蛋白基因的cDNA,开放阅读框(ORF)编码473个氨基酸,命名为SexiOR2和SlitOR2。通过在GenBank中进行序列的同源性比较,发现这2个鳞翅目化感蛋白新序列与已知蛾类昆虫的OR83b类化感蛋白氨基酸序列具较高的同源性。【结论】明确了所获得的2个鳞翅目蛋白新序列属于OR83b类化感蛋白。     

蛋鸡卵巢CHST11基因CDS序列分析

根据NCBI上已公布其他物种CHST11基因的mRNA序列设计蛋鸡特异性引物,应用RT-PCR方法从其卵巢卵泡中扩增出CHST11的CDS全序列。结果表明:CHST11基因编码产物为不稳定的疏水蛋白,经过BLAST比对发现,和其他物种的CHST11序列相比,同源性高。生物信息学软件分析表明,CHST11蛋白不具有信号肽,在10~40位氨基酸处存在1个跨膜螺旋结构区,其序列预测显示存在13个O糖基化位点。CHST11基因可能参与卵巢肿瘤和卵巢癌的调控,同时也可能与卵泡发育有关。     

猪Hepcidin基因的克隆与序列分析

通过RT-PCR技术从猪肝脏总RNA中扩增出Hepcidin基因的编码序列,将该序列及其推导的氨基酸序列与其它17个已知物种的相应序列进行同源性分析,并构建系统进化树。结果表明,克隆得到的Hepcidin基因cDNA序列长278 bp,编码82个氨基酸,预测的蛋白分子质量和等电点分别为8.76 ku和9.06;与已知牛的Hepcidin序列同源性最高,达81.71%,不同物种Hepcidin蛋白具有高度的保守性,Hepcidin蛋白物种进化树符合物种进化规律。本研究为今后阐明Hepeidin基因表达特性、表达产物理化性质、抗菌活性及其相关功能等奠定基础。     

3种植物Ran基因的克隆及序列分析

［目的］研究洋葱、大蒜和油菜中Ran基因与拟南芥Ran2基因的同源性,以确定3种植物材料能否作为拟南芥的替代材料研究Ran的定位。［方法］采用RTPCR方法,以拟南芥Ran2的引物分别从洋葱、大蒜和油菜分裂细胞提取的总RNA中克隆出同源基因,进行测序、比对分析。［结果］洋葱、大蒜和油菜的Ran基因开放阅读框分别为666、663和666bp;分别编码221、220和221个氨基酸,分子量约24.3kD;与拟南芥AtRan2氨基酸序列同源性分别为99.1%、100.0%（除末端缺少1个天冬氨酸D外）和96.4%;进化树分析显示洋葱和大蒜Ran基因与拟南芥进化关系更近。［结论］为进一步研究植物Ran基因的生物学功能奠定了基础。     

菜粉蝶线粒体基因组序列测定与分析

测定了菜粉蝶(Pieris rapae)的线粒体基因组序列,分析了菜粉蝶线粒体基因组的结构特征。此外,结合GenBank已经公布的鳞翅目昆虫的线粒体基因组序列并采取最大似然法和贝叶斯法构建系统发育树,分析了粉蝶科属间的系统发育关系。菜粉蝶(P.rapae)线粒体基因组长度为15 106 bp (GenBank登录号为MW448362),包括22个tRNA基因、13个蛋白质编码基因、2个rRNA基因和一段控制区。菜粉蝶线粒体基因组具有较高的A+T含量(79.0%),其中13个蛋白质编码基因中UUA的相对密码子使用频率最高(2.91)。除trnS1之外,21个tRNA基因的二级结构皆是典型的三叶草结构。粉蝶科属间系统发育结果显示:确定小粉蝶属(Leptidea)为单系群,位于系统发育树的基部,分化较早;襟粉蝶属(Anthocharis)和鹤顶粉蝶属(Hebomoia)互为姐妹群;粉蝶属(Pieris)和飞龙粉蝶属(Talbotia)互为姐妹群,所构成的类群与云粉蝶属(Pontia)形成姐妹群;斑粉蝶属(Delias)与由绢粉蝶属(Aporia)和妹粉蝶属(Mesapia)构成的一支类群形成姐妹群,尖粉蝶属Appias单独成一支;迁粉蝶属(Catopsilia)和豆粉蝶属(Colias)聚为一支,与钩粉蝶属(Gonepteryx)形成姐妹群关系,黄粉蝶属(Eurema)单独成一支。     

核桃举肢蛾线粒体CO I和Cytb基因片段序列分析

核桃举肢蛾（Atrijuglans hetaohei）是危害核桃果实的主要害虫,严重影响核桃的产量和商品价值。在最新的形态学分类上,核桃举肢蛾属于鳞翅目、麦蛾总科、黑展足蛾属。通过同源序列比对探讨利用DNA条形码技术（DNA barcoding）对核桃举肢蛾进行分类鉴定的准确性。运用2对通用引物分别扩增核桃举肢蛾线粒体细胞色素C氧化酶亚基I（CO I）基因和细胞色素b（Cytb）基因片段,并与鳞翅目麦蛾总科、巢蛾总科、凤蝶总科、螟蛾总科等昆虫的同源片段进行碱基组成多样性和系统进化分析,扩增得到核桃举肢蛾CO I基因664 bp片段和Cytb基因479 bp片段。结果表明:核桃举肢蛾线粒体CO I基因片段中,A、T、G和C 4种核苷酸的含量分别为29.5%、39.4%、15.1%和16.1%,A+T的含量(68.9%)明显高于G+C含量（31.1%）,存在显著的AT使用倾向性。在Cytb基因片段中, A、T、G和C 4种核苷酸的含量分别为33.4%、41.5%、10.2%和14.8%,A+T的含量为74.9%,也明显高于G+C含量（26%）。两段序列都以T-A间颠换和T-C间转换为主要替换方式,且密码子第2位点保守性最强,第3位点变异率最高。基于CO I和Cytb基因片段构建的NJ系统进化树均显示核桃举肢蛾与麦蛾总科昆虫处于同一个分支之下。利用DNA条形码技术得到的核桃举肢蛾分子生物学分类结果与传统的形态学分类结果一致。