蒲公英皂苷体外抗炎作用及对NF-κB信号通路的调控

探讨蒲公英皂苷在脂多糖(LPS)诱导RAW264.7细胞中的抗炎能力,并阐明其活性的基本分子机制。利用LPS刺激RAW264.7细胞建立体外炎症模型,采用噻唑蓝(MTT)比色法检测蒲公英皂苷对RAW264.7细胞的增殖毒性,Griess reagent法检测一氧化氮(nitric oxide,NO)的分泌,反转录聚合酶链式反应检测炎症细胞因子白细胞介素(IL)-6和肿瘤坏死因子(TNF)-αmRNA以及INOS mRNA的表达水平,酶联免疫吸附测定法测定IL-6和TNF-α的分泌量,Western blot检测IκB-α蛋白的磷酸化水平,用以研究蒲公英皂苷对NF-κB信号转导通路的抑制作用。结果表明:蒲公英皂苷能够抑制NO的分泌,显著抑制IL-6、TNF-α和INOS mRNA的表达并且抑制了IL-6和TNF-α的分泌。蒲公英皂苷显著上调了IκB-α的蛋白表达,并显著下调了p-IκB-α的蛋白表达且与蒲公英皂苷浓度成正比。蒲公英皂苷通过抑制NF-κB信号转导途径而发挥抗炎作用,蒲公英皂苷有显著的体外抗炎效果且抗炎效果与蒲公英皂苷的浓度呈剂量依赖性。     

虾青素对脂多糖通过TLR4/MyD88/NF-κB信号通路诱导的IPEC-J2细胞炎症的影响

【目的】研究虾青素(AST)对脂多糖(LPS)通过TLR4/My D88/NF-κB信号通路诱导的IPEC-J2细胞炎症的影响。【方法】采用MTT法确定虾青素和LPS对IPEC-J2细胞和转染IPEC-J2细胞的最佳处理浓度和处理时间,在处理后采用实时荧光定量PCR检测IPEC-J2细胞和转染IPEC-J2细胞炎症因子NF-κB、TNF-α、IL-6和IL~(-1)β的m RNA相对表达量,采用ELISA检测上述炎症因子的分泌量。【结果】当处理3 h,虾青素浓度达到150μmol·L~(-1)时,IPEC-J2细胞和转染IPEC-J2细胞活力达到峰值;当处理6 h,LPS质量浓度达到100 ng·m L~(-1)时,IPEC-J2细胞和转染IPEC-J2细胞活力达到峰值。与对照组相比,LPS组IPEC-J2细胞NF-κB、TNF-α、IL-6、IL~(-1)β的m RNA相对表达量和分泌量显著升高(P0.05);与LPS组相比,AST+LPS组NF-κB、TNF-α、IL-6、IL~(-1)β在IPEC-J2细胞中的m RNA相对表达量和分泌量显著降低(P0.05),而在转染IPEC-J2细胞中的炎症因子m RNA相对表达量和分泌量均无显著变化(P0.05)。【结论】虾青素可以抑制细胞炎症反应,且对细胞的保护作用与TLR4/My D88/NF-κB信号通路相关。     

泛素基因沉默对TLR4/NF-κB信号通路中关键分子表达的影响

为了探讨泛素(ubiquitin,简称Ub)对TLR4/NF-κB信号通路中关键分子表达的影响,通过脂质体将短发夹RNA(shRNA)质粒转染猪小肠上皮细胞,使其泛素基因沉默,于转染后6、12、24、48 h收集细胞及其上清。应用荧光定量PCR检测细胞内TLR4/NF-κB信号通路中关键分子TLR4、NF-κB、MyD88、IκB-α的mRNA表达水平,应用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测NF-κB、IκB-α及炎性因子TNF-α、IL-1含量的变化。结果显示,shRNA质粒有效地抑制了泛素基因的表达,转染shRNA质粒后,TLR4/NF-κB信号通路中TLR4、NF-κB、MyD88和IκB-α的mRNA表达量及NF-κB、IκB-α、TNF-α和IL-1含量均普遍呈下降的趋势,说明泛素在炎性因子的释放中起着至关重要的作用,泛素基因的沉默能够抑制该通路的活化。     

复方中草药制剂抑菌作用及其对湖羊部分细胞因子mRNA表达的影响

【目的】检测复方中草药制剂对引起湖羊乳房炎的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和粪肠球菌的抑杀作用,并探究该制剂对湖羊外周血中部分细胞因子mRNA相对表达量的影响.【方法】采用牛津杯法和试管二倍稀释法进行复方中草药制剂的体外抑菌试验,荧光定量检测用药前和用药后第1、3、7、14天及21天湖羊外周血中IL-2、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IFN-γ和TNF-α等7种细胞因子mRNA相对表达量.【结果】体外抑菌试验结果显示,该复方中草药制剂对大肠杆菌、粪肠球菌和金黄色葡萄球菌最小抑菌浓度(MIC)分别达到125、125、62.5 mg/mL;最小杀菌浓度(MBC)分别为250、125、125 mg/mL.荧光定量试验结果显示,使用该制剂处理湖羊后能显著提高湖羊外周血中IL-2、IL-8、IL-10、IL-12和IFN-γ的mRNA表达水平(P0.05),显著降低IL-6和TNF-αmRNA表达水平(P0.05).【结论】该复方中草药制剂对3种乳房炎病原菌具有很好的抑杀作用,并能上调湖羊外周血中IL-2、IL-8、IL-10、IL-12和IFN-γ的mRNA相对表达量,下调IL-6和TNF-α的mRNA相对表达量.     

茶枝柑叶总黄酮纯化工艺研究

【目的】优化聚酰胺树脂纯化茶枝柑叶总黄酮的工艺,为茶枝柑叶的开发利用提供参考。【方法】以总黄酮吸附量及解吸率为指标,通过静态吸附与解吸试验,确定适合分离纯化茶枝柑叶总黄酮的聚酰胺树脂粒径。通过动态吸附与解吸试验,采用单因素试验与响应面法优化,研究聚酰胺树脂分离纯化茶枝柑叶总黄酮的工艺参数,并对最优工艺条件进行验证。【结果】200～300目(48～75μm)聚酰胺树脂较适用于纯化茶枝柑叶总黄酮。茶枝柑叶总黄酮最优纯化工艺为:上样液质量浓度(生药量)15 mg/mL,pH值为5,流速为1.75 BV/h,上样量为聚酰胺树脂质量的6倍(湿质量),用1.3 BV的75%(体积分数)乙醇洗脱。在该工艺条件下,所得纯化物中总黄酮得率为64.17%。【结论】200～300目(48～75μm)聚酰胺树脂适用于茶枝柑叶总黄酮的分离纯化,且所得总黄酮纯度较高。     

苦笋总黄酮提取工艺优化及其体外抗炎抗氧化活性研究

【目的】探索苦笋总黄酮最佳提取工艺条件及其体外抗氧化抗炎活性。【方法】以苦笋为原料,采用超声辅助提取法,通过单因素实验及Box-Behnken响应曲面法筛选出最佳提取工艺,并评估苦笋总黄酮提取物的体外抗氧化抗炎活性。【结果】苦笋总黄酮最佳提取工艺为：料液比1∶30 g/mL,提取温度51℃,提取时间23 min,乙醇浓度87%,提取溶液pH值为6,超声功率200 W。在此条件下苦笋总黄酮提取率为10.61%;苦笋总黄酮浓度为0.5 mg/mL时,FRAP值达到3.04 mmol/L,对DPPH自由基、羟基自由基和ABTS自由基的清除率分别为88.73%、60.22%和72.38%,其IC50值分别为0.07 mg/mL、0.39 mg/mL和0.23 mg/mL;苦笋总黄酮浓度为1.20 mg/mL时,NO产生抑制率可达到93.94%。【结论】苦笋总黄酮提取工艺切实可行,并且苦笋总黄酮提取物具有一定的抗氧化抗炎活性。     

大孔吸附树脂分离纯化甘草废渣中总黄酮的工艺研究

[目的]开发大孔吸附树脂分离纯化甘草废渣中总黄酮的工艺。[方法]以静态吸附试验比较D101B、AB-8、DM-130这3种大孔吸附树脂对甘草废渣中总黄酮的吸附量和解吸率,筛选最优树脂。采用单因素试验筛选动态吸附过程中样液浓度、上样速度、上样体积、20%乙醇洗脱体积、洗脱剂浓度、洗脱剂体积。[结果]AB-8大孔树脂用于分离纯化甘草废渣中总黄酮效果最佳,样液浓度为2.345～3.126 mg/mL,上样速度为1.0～1.5 mL/min,上样体积为64 mL,20%乙醇洗脱体积为5 BV,80%乙醇洗脱体积为4 BV。经过该纯化工艺总黄酮浓度从15.63%提升至65.68%。[结论]该方法适用于甘草废渣中总黄酮的初步分离纯化。     

蒙药漏芦花总黄酮提取和纯化工艺研究

[目的]优化漏芦花总黄酮提取工艺和纯化工艺,为漏芦花抗炎药效部位的开发奠定基础。[方法]以总黄酮为指标,采用UV测定方法,在检测波长413 nm下,测定总黄酮含量,确定纯化漏芦花总黄酮纯化大孔树脂型号;并采用正交试验分别考察乙醇浓度、回流次数、回流时间和乙醇用量对漏芦花总黄酮提取工艺的影响及乙醇体积分数、上样液质量浓度、p H和上样液流速对总黄酮纯化工艺的影响。[结果]确定漏芦花总黄酮提取工艺的最优方案为采用75%乙醇溶液,回流2次,每次回流时间45 min,乙醇用量12倍,影响因素的顺序从大到小依次为乙醇浓度、回流时间、乙醇用量、回流次数。纯化工艺试验中,最优纯化工艺条件为上样液浓度0.05 g/m L,上样液p H为5,上样液流速为3 m L/min,径高比为1∶9,最佳上样量为药材量与树脂用量比2∶1,乙醇体积分数50%,洗脱液用量5 BV;纯化后干膏里漏芦花抗炎有效部位总黄酮含量为42.3%。[结论]AB-8型大孔树脂可有效富集、纯化漏芦花总黄酮,优选的提取和纯化工艺稳定可行。     

人参属6种药材的抗炎作用及其对NF-κB信号通路的影响

【目的】比较6种不同人参属药材提取物的体内外抗炎活性差异，并探讨其抗炎活性机制。【方法】采用CCK-8法检测RAW264.7细胞活力，Griess法检测NO释放，ELISA法检测细胞分泌炎症因子情况，Western blot法检测NF-κB信号通路中关键蛋白表达情况。采用二甲苯所致小鼠耳肿胀模型，检测耳肿胀度及HE染色的病理切片情况。【结果】在给药浓度为0.02、0.20 mg/mL时，6种人参属药材提取物对RAW264.7细胞活力无显著抑制作用(P>0.05)。6种人参属药材提取物在0.2 mg/mL浓度下均显著抑制LPS诱导的RAW264.7细胞上清液中NO含量的升高(P<0.05或P<0.01或P<0.001),其中屏边三七抑制作用最强。与LPS组相比，6种人参属药材提取物均显著降低细胞分泌的TNF-α含量(P<0.01或P<0.001)。屏边三七组和竹节参组均显著逆转LPS诱导的细胞中p-NF-κB、IκBα蛋白表达量的升高；而珠子参组和竹节参组均显著抑制NF-κB蛋白表达。此外，6种人参属药材提取物对二甲苯所致小鼠耳肿胀具有剂量依赖性抑制作...     

马铃薯糖苷生物碱对化疗性静脉炎家兔促炎细胞因子表达的影响

【目的】研究马铃薯提取物糖苷生物碱对化疗性静脉炎兔模型白介素-1(IL-1)、白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子(TNF-α)表达的影响,探讨其减轻化疗性静脉炎的作用机理,为临床应用提供依据.【方法】将60只普通级‘日本大耳白兔’随机分为6组:空白对照组,模型组,阳性对照组,糖苷生物碱组,马铃薯汁组,马铃薯泥组.通过耳缘静脉推注长春瑞滨建立静脉炎模型,各试验组在推注长春瑞滨后在穿刺部位涂抹相应药物,免疫组化法检测IL-1、IL-6的含量,ELISA法检测各组兔血清中TNF-α的含量.【结果】IL-1、IL-6的表达:模型组含量与空白对照组比较显著增加,差异有统计学意义,与模型组比较,阳性对照组及各药物组IL-1、IL-6表达均有所减弱(P0.05,P0.01),以阳性对照组,糖苷生物碱组减弱最为明显;TNF-α含量表达:与空白对照组比较,模型组血清中TNF-α含量表达异常增高,与模型组比较,除马铃薯汁组外,阳性对照组、马铃薯泥组、糖苷生物碱组TNF-α表达均有所减弱(P0.05,P0.01).【结论】马铃薯糖苷生物碱对化疗性静脉炎家兔促炎细胞因子IL-1、IL-6、TNF-α的异常升高有显著的回调作用.     

油菜花粉多糖对荷瘤鼠脾细胞IL-2、TNF-α产生及其mRNA表达的影响

 【目的】研究油菜花粉多糖（LBPP）对荷瘤鼠脾细胞IL-2、TNF-α的诱生及其mRNA表达的影响。【方法】通过动物抑制性肿瘤法制备肿瘤模型,采用双抗体夹心ELISA法检测IL-2、TNF-α含量,逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测IL-2、TNF-α mRNA的表达。【结果】LBPP有明显抗肿瘤作用,200 mg•kg-1高剂量组抑瘤率可达51.26%,明显优于环磷酰胺46.22%;LBPP可显著促进荷瘤鼠脾细胞IL-2、TNF-α分泌（P＜0.01）,提高荷瘤鼠脾细胞IL-2、TNF-α mRNA的表达（P＜0.01）,高剂量组提高率分别达56.37%、105.24%、1364%和1289%。【结论】LBPP通过提高机体IL-2、TNF-α mRNA的表达而发挥抗肿瘤作用。     

苦参碱对奶牛子宫内膜上皮细胞抗炎作用及其机制

为探究苦参碱在抗炎方面的作用,本试验用LPS建立奶牛子宫内膜上皮细胞炎症损伤模型,通过MTT法测得LPS最佳刺激浓度为30μg/mL,作用12h;苦参碱的低中高浓度分别为5、10、20μg/mL。RT-PCR分别检测3、6、12h各组细胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8)mRNA的表达变化,结果表明,苦参碱显著(P0.05)降低TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8的表达,具有较强的抗炎作用。     

D-101大孔树脂分离纯化葛根异黄酮的工艺探讨

【目的】探索D-101大孔树脂分离纯化葛根异黄酮的最优工艺。【方法】采用紫外分光光度法测定异黄酮质量浓度,以异黄酮损失率、洗脱率、收率、纯度等为指标,评价D-101大孔树脂分离纯化葛根异黄酮工艺中,上样液用量、上样液质量浓度、吸附流速、洗脱剂蒸馏水用量、洗脱剂乙醇体积分数及其用量对吸附和解吸效果的影响,从而确定最优工艺。【结果】D-101大孔树脂对葛根异黄酮有较好的分离效果,其最优工艺条件为:葛根异黄酮饱和吸附量为3.3倍树脂体积,上样液质量浓度7.20mg/mL,吸附流速为2mL/min,洗脱剂蒸馏水和体积分数30%乙醇的用量均为4倍树脂体积。利用该工艺精制后葛根异黄酮纯度、收率分别达80.74%和63.62%。【结论】采用D-101大孔树脂分离纯化葛根异黄酮简单可行,精制效果好,适于工业化生产。     

虾青素对脂多糖诱导的RAW264.7细胞炎症反应的影响及机制

【目的】研究虾青素(AST)对脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7细胞炎症反应的影响及作用机制,为将虾青素应用于炎症治疗奠定理论基础。【方法】采用不同浓度梯度的脂多糖及虾青素对RAW264.7细胞进行不同时间段的处理,通过MTT法确定最佳处理浓度和时间,对细胞进行最佳处理后,用ELISA法、荧光定量PCR技术和Western blot法分别检测细胞炎症因子的分泌量、mRNA相对表达量和蛋白相对表达量。【结果】100μmol/L虾青素和2μg/mL脂多糖处理3 h的RAW264.7细胞活力处于峰值。与对照组相比,脂多糖组RAW264.7细胞中TNF-α、IL-6和Caspase-1的分泌量分别降低了12.83%、9.66%和20.80%(P0.05),脂多糖对于TLR4/MyD88/NF-кB通路相关蛋白表达有促进作用,其中,TLR4和NF-кB p65蛋白相对表达量分别提高了195.40%和226.95%(P0.05);与LPS组相比,AST+LPS组中虾青素对炎性因子的分泌及mRNA表达有抑制作用,TLR4、MyD88和NF-кB p65蛋白相对表达量降低了54.99%、45.70%和28.20%(P0.05)。【结论】虾青素预保护能抑制TLR4/MyD88/NF-кB通路相关蛋白的表达,进而缓解脂多糖刺激RAW264.7细胞产生的炎症反应。     

皱皮木瓜中总黄酮分离纯化工艺

以皱皮木瓜[Chaenomeles speciosa(Sweet)Nakai]为试验材料,优化总黄酮分离纯化工艺,为发掘皱皮木瓜的潜在利用价值提供依据。本研究考察了乙醇浓度、料液比和超声温度对皱皮木瓜原料粉中总黄酮含量的影响,并以静态吸附法筛选最佳吸附树脂,动态吸附法确定上样条件和洗脱条件。结果表明皱皮木瓜总黄酮提取最佳工艺为70%乙醇水溶液,1∶20料液比及50℃温度下超声辅助提取,提取时间20min,超声功率200 W。原料粉中总黄酮含量为8.64%。纯化工艺发现ADS-17大孔树脂对皱皮木瓜中总黄酮具有较好的吸附和解吸性能,其最佳上样流速2mL/min,上样浓度2.04mg/mL;进一步用4BV 10%乙醇水溶液洗脱杂质,4BV 30%乙醇水溶液、3BV 50%乙醇水溶液依次洗脱得总黄酮,洗脱流速1.5 mL/min。最终总黄酮产品纯度为94.67%。     

鸡屎藤总黄酮提取及其抗氧化性分析

【目的】对鸡屎藤总黄酮提取工艺条件进行优化,并研究其提取液的抗氧化性,为鸡屎藤的药用开发提供参考。【方法】以鸡屎藤为原料、乙醇为提取剂,采用单因素试验及正交试验,探讨溶剂浓度、提取温度、时间和料液比对鸡屎藤总黄酮提取的影响。【结果】鸡屎藤总黄酮最佳提取工艺条件为：乙醇浓度40%、提取温度70 ℃、提取时间120 min、料液比1∶20（g∶mL）,在此工艺条件下鸡屎藤总黄酮提取量为36.95 mg/g;当鸡屎藤总黄酮浓度为0.40 mg/mL时,对羟基自由基（·OH）的清除率为40%。【结论】乙醇浸提法是提取鸡屎藤总黄酮的有效方法,且提取液对·OH具有一定的清除效果。     

基于D-101大孔吸附树脂分离纯化新疆石榴皮中的总黄酮

【目的】研究采用D-101大孔吸附树脂分离纯化新疆石榴皮中的总黄酮。【方法】以单因素为研究基础,分析温度、pH、吸附穿透曲线及洗脱液浓度、料液比等因素,研究D-101大孔吸附树脂分离纯化石榴皮总黄酮的条件,并找到最佳工艺条件。【结果】D101大孔吸附树脂对石榴皮中黄酮类物质纯化的最佳工艺为:提取液pH为4、温度30℃、料液比1∶4(g/mL)、洗脱液乙醇体积为90%。该工艺富集纯化石榴皮黄酮类物质效果较好,石皮总黄酮的纯度由7.25％提高至17.32％。【结论】能有效的洗脱色素、叶绿素等非目标成分,科学合理的分离纯化石榴皮中总黄酮,且操作简单、安全、成本低廉。     

紫草素可抑制在RAW264.7巨噬细胞和斑马鱼幼虫中由脂多糖诱导的炎症反应

【目的】通过巨噬细胞和斑马鱼这2种模型来评价紫草素的抗炎作用。【方法】首先使用细胞计数试剂盒检测紫草素对细胞活性的影响，然后将巨噬细胞分为空白对照组、脂多糖组（（LPS 1μg/mL）、LPS(1μg/mL)+紫草素（0.3、1.5、3μg/mL））组和紫草素（3μg/mL）组。采用一氧化氮产生法和酶联免疫吸附法检测促炎因子和促炎细胞介质的含量。在斑马鱼试验中，检测紫草素对斑马鱼胚胎的毒性，并通过存活率、体型、心率和体长等结果，选择合适的紫草素浓度（0.001、0.01、0.1μg/mL）进行后续试验。在转基因斑马鱼卵黄囊中注射2 nL LPS(2 mg/mL)建立炎症模型，测定紫草素处理后卵黄囊中2种细胞（巨噬细胞和中性粒细胞）的募集情况、测定紫草素对脂多糖诱导的斑马鱼心跳的影响。【结果】在细胞研究中，与仅经LPS处理的细胞相比，紫草素的加入可以减少促炎细胞因子如肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素6(IL-6)的积累。同时，紫草素还能抑制一氧化氮的分泌量，抑制率可达50%。斑马鱼的研究表明，紫草素有效地减少了卵黄囊中两种细胞的大量聚集，最高抑制率为73.3%，也减轻了LPS引起...     

p53信号通路在MTB感染肺泡Ⅱ型上皮细胞系A549中的免疫调控作用

【目的】探讨p53通路在结核分枝杆菌(MTB)感染肺泡Ⅱ型上皮细胞(AECⅡ)中的免疫调控作用。【方法】将供试的p53基因过表达和干扰载体转染293T细胞,对其作用效果进行验证。利用脂质体分别转染p53基因过表达和干扰载体到AECⅡ细胞系A549中,建立p53基因过表达和干扰A549系模型细胞。用牛结核分枝杆菌减毒株(BCG)分别感染未经任何处理的A549细胞(感染对照组)及模型细胞,以未感染BCG的各类A549细胞为参照。以β-actin为内参基因,通过实时荧光定量PCR和Western blot来分析信号分子p53、p300、NF-κB、TLR-4、TRAF6在mRNA和蛋白水平的表达,以及炎症细胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-6和IL-8的mRNA表达情况。【结果】过表达载体plRES2-EGFP-p53 WT和干扰载体TP53-RNAi(2648)作用效果明显,成功建立了p53基因过表达和干扰的A549细胞模型。BCG感染的对照组、p53基因过表达组和干扰组的A549细胞中,p53、p300、NF-κB、TLR-4、TRAF6在mRNA和蛋白水平的表达显著或极显著高于相应的BCG未感染组,其中p300表达与p53基因表达量呈正相关,NF-κB、TLR-4、TRAF6表达与p53基因表达量呈负相关;BCG感染可引起TNF-α、IFN-γ、IL-6和IL-8的显著表达,且与p53基因表达量呈负相关。【结论】BCG感染A549细胞时,p53信号通路中的p53协同p300来抑制NF-κB、TLR-4和TRAF6的活化及负调控TNF-α、IFN-γ、IL-6和IL-8的分泌,从而抵抗MTB的侵染。     

大孔吸附树脂分离纯化千斤拔总黄酮的工艺研究

为研究大孔树脂分离纯化千斤拔总黄酮的最佳工艺,以总黄酮的含量为指标,通过静态吸附解析试验比较7种不同类型大孔吸附树脂的吸附解析特性,确定AB-8型大孔吸附树脂适用于千斤拔总黄酮的分离纯化。通过动态吸附试验确定了大孔吸附树脂分离纯化千斤拔总黄酮的最佳工艺条件。结果表明:大孔树脂分离纯化千斤拔总黄酮的最佳工艺为:上样液质量浓度相当于原生药质量浓度为0.12g·mL-1,最大上样量为12.83mg·mL-1,上样液的pH为5.0,上样流速为2.0mL·min-1,洗脱液乙醇体积分数为70%,洗脱剂用量为7BV,洗脱流速为1.5mL·min-1。在此条件下,千斤拔总黄酮的纯度由31.26%提高至65.7%,说明该工艺稳定可靠,可用来分离纯化千斤拔总黄酮。