落叶松-杨栅锈菌MKK基因的克隆与生物信息学分析

利用同源克隆技术,从落叶松-杨栅锈菌(Melampsora larici-populina Kleb.)菌株Wh03中克隆得到酿酒酵母MKK1和MKK2的同源基因,命名为Mlp MKK1/2-WH。测序结果显示,Mlp MKK1/2-WH基因的开放阅读框长度为1 218 bp,编码405个氨基酸。Mlp MKK1/2-WH蛋白具有保守的PKc_Pek1_like和Pkinase结构域。系统进化树分析表明,Mlp MKK1/2-WH与柄锈菌属3种锈菌中的同源蛋白亲缘关系最近。     

落叶松-杨栅锈菌MlpNHA1-like基因的克隆及序列分析

落叶松-杨栅锈菌引起的杨树叶锈病是杨树的一种重要病害。通过系统发育分析和序列相似性比对确定落叶松-杨栅锈菌标准菌株基因ID 45128为酿酒酵母NHA1直系同源基因以及基因ID 116278为NHA1相关基因,分别命名为MlpNHA1和MlpNHA1-like。以夏孢子cDNA为模板,运用RT-PCR技术,同源克隆获得中国菌株MlpNHA1-like基因的ORF片段,即MlpNHA1-like (wh03),长度为1 545 bp,编码514个氨基酸。结果表明,生物信息学预测分析显示MlpNHA1-like (wh03)蛋白具有与酿酒酵母NHA1蛋白相同的保守结构域c_cpa1,且同样具有系列疏水跨膜结构,亚细胞定位预测结果表明目的蛋白分布在质膜区域。通过克隆落叶松-杨栅锈菌中国菌株MlpNHA1-like基因并开展序列分析,为解析该锈菌MlpHOG1蛋白介导通路在病原菌侵染致病及响应外界胁迫中的作用提供帮助。     

草地早熟禾及其矮化突变材料锈病病原菌鉴定及抗病机制初探

锈病是草坪草的重要病害，且病原菌种类多，鉴定困难。本研究以草地早熟禾野生型和矮化突变材料中的感病株系为对象，通过观察锈菌的形态特征，并结合ITS和β-tubulin基因序列分析，其中ITS序列的同源比对分析和β-tubulin基因的分子进化分析结果表明，该菌种与小麦禾柄锈菌的同源关系接近，所以初步认定该菌株属于禾柄锈菌，这是国内对禾柄锈菌引起草地早熟禾锈病的首次报道。同时，我们对病原菌诱导后草地早熟禾PR1L、NPR1L基因的表达变化和PRs蛋白表达进行了研究，发现PR1L、NPR1L基因在病菌诱导12 h时的表达量达到了峰值，且在矮化突变植株(A16)中的相对表达量分别达到了8.8-fold、4.5-fold，均大于在对照植株(WT)中的表达量。另外植物的PRs蛋白在禾柄锈菌侵染植物第8天后的表达量明显高于未侵染的植株。初步对草地早熟禾锈病的防御机制进行了探讨，为今后开展草地早熟禾锈病的预防及抗病育种研究奠定基础。      

小麦3种锈菌PCWDEs家族基因鉴定及表达分析

为挖掘小麦锈菌侵染过程中发挥关键作用的植物细胞壁降解酶（Plant cell wall-degrading enzymes,PCWDEs）基因,通过生物信息学方法对小麦3种锈菌（叶锈菌、条锈菌和秆锈菌）基因组中的碳水化合物活性酶（Carbohydrate-active enzymes, CAZymes）进行预测分析,在此基础上对其中的PCWDEs基因家族进行全基因组范围的筛选鉴定,并利用qRT-PCR方法对叶锈菌PCWDEs家族成员在侵染过程中的转录水平进行了检测分析。结果表明：1）小麦叶锈菌、条锈菌和秆锈菌基因组分别编码355、322和345个CAZymes家族成员基因以及160、153和158个PCWDEs基因;小麦3种锈菌共含75个保守CAZymes基因亚家族和94个PCWDEs直系同源基因簇。2)16个叶锈菌特异性PCWDEs基因在亲和（Pt15-‘中国春’）/非亲和（Pt15-‘云麦34’）互作过程中均受到不同程度的诱导表达,但非亲和互作中在侵染更早期就已受到诱导上调表达。3）叶锈菌特异性PCWDEs基因簇中有4个PCWDEs被鉴定为类扩展蛋白,其在侵染过程中受到诱导表达,说...     

人参皂苷生物合成相关基因PgRg2BBE克隆及生物信息学分析

克隆与人参皂苷Rg₂合成相关的重要酶基因PgRg₂BBE全长cDNA序列，并利用在线软件对该基因编码的蛋白质进行理化性质、结构域、亚细胞定位和系统进化等分析。结果表明：PgRg₂BBE基因cDNA序列长为1 638 bp，编码545个氨基酸。PgRg₂BBE蛋白分子量为60 967.10 u，等电点为8.88，不稳定性指数为34.04，预测该蛋白为一种稳定的亲水性跨膜蛋白，主要由α-螺旋和无规则卷曲组成。PgRg₂BBE蛋白含有FAD＿binding＿4和BBE功能结构域，定位于叶绿体中，含有24个氨基酸序列信号肽。系统发育树分析发现，其与智利茄的亲缘关系最近，氨基酸序列多重比对发现，RgRg₂BBE中含有4个保守基序，进一步与拟南芥AtBBE家族蛋白进行同源序列比对，发现它们同时具有4个保守基序(RKYGL、MGED、FWAIRGG、FPEI)。     

甘薯IbbZIP22基因克隆与表达分析

本研究以济薯25为材料，克隆得到IbbZIP22基因。该基因编码区全长1 368 bp,编码455个氨基酸。序列和结构分析发现该基因编码的蛋白上有bZIP＿plant＿RF2保守结构域，推测其属于RF2类bZIP转录因子；对IbbZIP22蛋白进行亚细胞定位预测，推测该蛋白位于细胞核中；系统发育分析表明，IbbZIP22蛋白与三裂叶薯中的ItRF2a-like蛋白亲缘关系最近。采用实时定量PCR技术对济薯25和徐紫薯8号不同部位的IbbZIP22基因表达模式进行分析，发现IbbZIP22基因均在两个品种块根中表达量最高，且济薯25块根中的表达量显著高于徐紫薯8号，推测该基因参与淀粉调控。利用同源克隆技术，从济薯25基因组DNA中克隆IbbZIP22基因的启动子序列，该序列中除包含CAAT-box、TATA-box等核心启动子元件外，还存在多个参与光响应、抗逆和激素应答等元件。本研究结果为探究甘薯抗逆和淀粉调控机制提供了理论依据。     

小麦条锈菌转录因子PsSte12的克隆及生物学分析

【目的】克隆小麦条锈菌PsSte12基因,明确其序列特征、转录活性及其在小麦条锈菌侵染过程中的相对表达量。【方法】采用RT-PCR方法,从小麦条锈菌中获得PsSte12基因,利用生物信息学分析其序列特征,实时定量PCR技术检测其在小麦条锈菌不同侵染阶段的表达特征;借助酵母单杂交系统解析该基因的转录活性。【结果】克隆到1个小麦条锈菌基因PsSte12,该基因序列含有1个全长2 553bp的开放阅读框;基因组DNA序列含有4个内含子,分别位于开放阅读框第281,429,1 512,1 584位,长度分别为73,79,66和68bp。该基因编码蛋白含850个氨基酸,75个正电荷残基和90个负电荷残基。PsSte12与小麦秆锈菌、杨树锈菌、小麦赤霉菌及构巢曲霉菌中同源序列的相似性分别为87.9%,61.53%,24.3%和25.2%;PsSte12在小麦条锈菌侵染后24和36h大量表达,相对表达量分别为对照的61倍和123倍;PsSte12具有转录活性,其N端为转录激活区。【结论】成功克隆了小麦条锈菌STE类型转录因子PsSte12,证实其具有转录活性,在小麦条锈菌侵染早期诱导表达,推测其参与了小麦条锈菌的侵染过程。     

水稻矮秆基因对GA_3敏感性的酶学基础

以高秆水稻品种百叶籼（对照）、含不同矮秆基因的水稻品种广场矮、新桂矮、双矮为材料，研究其对ＧＡ＿３不同敏感性的酶学基础。结果表明，携有ｓｄ－１ｓｄ－１矮秆基因的水稻幼苗对ＧＡ＿３的敏感性强于携有ｓｄ－ｇｓｄ－ｇ矮秆基因的品种；供试品种对２０ｍｇ／ｋｇＧＡ＿３的反应，表现在体内过氧化物酶活性下降，且下降幅度与各品种对ＧＡ＿３不同敏感性基本一致。同工酶谱分析结果表明，酶活性下降与Ａ＿９，Ａ＿（１１）谱带有关，Ａ＿５谱带与不同矮秆基因对ＧＡ＿３的敏感性有关；体内吲哚乙酸氧化酶活性下降，下降幅度与不同矮秆基因材料对ＧＡ＿３敏感性一致。     

小麦Ta-hir2基因克隆及转Ta-hir2基因小麦的获得

通过基因枪介导法将小麦过敏性诱导反应蛋白2基因Ta-hir2转入小麦胚性愈伤组织中,经分化筛选后获得转基因小麦植株,为验证该基因的功能奠定基础.以接种非亲和叶锈菌小种05-19-43②的小麦‘TcLr15,为材料,采用同源克隆的策略克隆了小麦Ta-hir2基因;将该基因的编码区与植物表达载体pAHC-25相连,成功构建...     

大鼠MKK3蛋白的生物信息学分析

[目的]对大鼠MKK3蛋白进行生物信息学分析,预测其结构和功能,可以为进一步研究大鼠MKK3蛋白的功能提供试验基础。[方法]利用生物信息学工具对大鼠MKK3蛋白的理化性质、跨膜区域、空间结构、磷酸化位点、相互作用等进行预测。[结果]大鼠MKK3蛋白由347个氨基酸残基组成,等电点为7.05,相对分子质量39.3 k D,在哺乳动物中高度保守。二级结构主要由α-螺旋、β-折叠和无规卷曲构成,结构上含一个S_TKc结构域。MKK3能与多种MAPK、Tab1、Tab2、Traf6等蛋白发生相互作用。[结论]大鼠MKK3蛋白是一种不含信号肽和跨膜区的亲水蛋白,具有激酶活性,可参与p38MAPK信号通路在炎症和肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用。该研究为进一步研究大鼠MKK3蛋白的功能提供了试验依据。     

一种用C18柱纯化低浓度微量寡核苷酸的新方法

通过比较4种不同的回收方法和C18硅胶4种不同的用量对回收的影响,提出了回收低浓度微量寡核苷酸的最佳方案:分别用1 mL乙腈、2 mL灭菌双蒸水和1 mL 10 mmol/L乙酸铵平衡装填10 mg硅胶的C18 Sep-Pak反相层析柱;再将寡核苷酸溶液通过C18柱;然后用1 mL 25 mmol/L碳酸氢铵洗脱C18柱,并以3000 r/m in离心2 m in;最后用1 mL 30%乙腈洗脱C18柱,将收集的溶液离心冻干后即得到纯化的寡核苷酸。该方法的回收率可达53.7%±3.0%。     

沙棘品种深秋红茎尖组织培养

[目的]筛选沙棘品种深秋红茎尖组织培养基配方。[方法]选用不同培养基,以7月中旬至8月下旬采集的大田茎尖为外植体,对沙棘品种深秋红的组织培养技术进行研究。[结果]最适初代培养基为1/2MS+6-BA 0.5 mg/L,最适愈伤组织诱导培养基为1/2MS+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.5 mg/L,最适继代培养基为1/2MS+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.2 mg/L,最适腋芽诱导培养基为1/2MS+6-BA 0.5 mg/L。[结论]该研究建立了沙棘品种深秋红茎尖组织培养技术,为其产业化生产奠定基础。     

猬实下胚轴愈伤组织的生长和器官分化研究

通过对猬实下胚轴离体培养的研究 ,结果表明 :在Ms培养基上 ,BA (1～ 3)mg/l和NAA (0 1～ 1 )mg/L配合能诱导愈伤组织生长良好。在BA (1～ 3)mg/L和NAA (0 1～ 0 2 )mg/L配合下能诱导愈伤组织芽分化。0 2mg/LNAA或IBA诱导无根苗生根效果明显。通过愈伤组织芽分化途径可以获得完整植株     

蕨菜组织培养技术的研究

[目的]以蕨菜叶柄为外植体研究蕨菜的组织培养技术。[方法]在1/2 MS培养基中设置不同的6-BA和IBA浓度,研究6-BA和IBA对蕨菜叶柄组织培养的影响。[结果]1/2 MS+0.2 mg/L 6-BA+0.4 mg/L IBA为愈伤组织的最佳诱导培养基,诱导率为82%;1/2MS+0.2 mg/L IBA+0.2 mg/L 6-BA为愈伤组织的最佳增殖培养基,增殖倍数为8.07;1/2 MS+0.4 mg/L IBA为最佳生根培养基,生根率达100%,根数多、根长且健壮。[结论]结果为蕨菜植物的组培繁殖提供参考。     

对一种多基因组装方法的改进

改建了基于Cre/LoxP重组的2个供体载体和1个兼容Gateway系统的供体载体:pYLd1GW/pYLd2GW、pYLd1GW35s/pYLd2GW35s和pYLd1GWMPK/pYLd2GWMPK。在改建载体的基础上构建了2个供体载体pYLd1GWMdSPDS1和pYLd2GWCBF1,并将2个基因构建于受体载体pYL1305,得到双价表达载体pYL1305MC。采用农杆菌介导的叶盘法转化烟草,经PCR检测和GUS组织化学染色检测发现,双价基因已成功转入烟草。对6株转基因烟草进行荧光定量PCR检测,发现在不同植株中同一基因表达量差异很大,但2个基因表达量差异趋势一致。     

柱型苹果MdCoLBD1/2基因生物信息学及SNP分析

柱型苹果(Columnar apple)是苹果株型育种的珍贵资源.利用同源基因克隆方法,以柱型苹果"威塞克旭"一年生枝上休眠期芽cDNA为模板,克隆得到了LOB DOMAIN家族(LBD)的2个同源基因,命名为MdCoLBD1/2,分别编码195和240个氨基酸.该基因有LBD家族的典型结构域,如C盒、GAS盒、亮氨酸拉链(Leu zipper)结构以及LOB Domain区域等.MdCoLBD1/2分别定位于第10条染色体Chr10:18985568..19005801和MdCoLBD2 Chr10:18985594..19005850区间.MdCoLBD1/2与白梨、葡萄、草莓、椰子、梅、核桃的氨基酸的相似性均在60%以上.聚类分析表明MdCoLBD1和白梨、梅、草莓亲缘关系较近,MdCoLBD2与葡萄、核桃亲缘关系较近,MdCoLBD1/2与亚洲棉、陆地棉的聚类关系均较远.通过测序分析了MdCoLBD1/2基因在30个不同类型材料中的碱基序列差异,得到MdCoLBD1有8个碱基差异位点,MdCoLBD2有5个碱基差异位点.     

板栗低产园改造技术研究

实生繁殖、经营管理粗放是造成板栗产量低、品质差的重要因素．通过采取良种高接换冠，结合树体修剪、抚育施肥、栗粮间作、病虫害防治等综合技术措施，对10～12年生低产栗园实施改造，产量由改造前的108.6kg／hm^2提高到1260.45kg／hm^2；2年生幼树经过嫁接改造提早2～3a结实．     

DFRKN-1碱性磷酸酶的提取纯化和主要理化性质研究

[目的]提取纯化根结线虫天敌真菌-1(Destroying fungi of root-knot nematode-1,DFRKN-1)的碱性磷酸酶,并对其主要理化性质进行研究。[方法]以DFRKN-1为提酶材料,经正丁醇提取,硫酸铵分级沉淀分离,透析获得酶的粗提取液,用SephadexG-150凝胶过滤柱层析纯化,获得纯化碱性磷酸酶,并测定纯化碱性磷酸酶的理化性质。[结果]酶纯度达到电泳纯,提纯倍数达到15.7倍,比活力达5333 U/mg;该酶的最适pH值为8.9,最适温度为43℃,米氏常数为6.82 mmol/L;K+、Ba2+、Mg2+对该碱性磷酸酶的活性均有激活作用,甲醛、草酸、酒石酸对该碱性磷酸酶均有抑制作用。[结论]试验结果可为进一步深入研究DFRKN-1提供参考。     

中药材板蓝根中20种农药的多残留快速分析方法

为研究板蓝根中20种农药多残留快速分析方法,以丙酮∶二氯甲烷(2∶1)为提取溶剂,采用超声波法提取,硅胶柱净化,石油醚∶丙酮(4∶6)淋洗,带电子捕获检测器的气相色谱仪检测农药残留。结果表明,该方法在0.01~15.0 mg.kg-1范围内线性关系良好,相关系数大于0.996 5。板蓝根中20种农药的平均添加回收率为74.1%~105.8%。该方法的最低检出限(LOD)在0.1~2.5μg.kg-1范围,定量检出限(LOQ)在0.4~8.2μg.kg-1范围,相对标准偏差小于14%。该方法快速、简便、价廉。