阿维链霉菌BAC文库的构建及分析

为进一步阐明阿维菌素的生物合成路径和调控途径,提高阿维菌素的产量,采用BamHⅠ限制性内切酶酶解阿维链霉菌基因组DNA的方法,构建了阿维链霉菌的细菌人工染色体(BAC)文库。该文库共包含2 304个克隆,平均插入片段为101kb,空载率约9%,覆盖了该菌基因组的25.9倍。该文库的成功构建可以为其他微生物尤其是基因组具有磷硫酰化修饰的微生物的文库构建提供参考。     

枯草芽孢杆菌B9601-Y2基因组文库的构建

枯草芽孢杆菌B9601-Y2是一个具有防治植物病害和促进植物生长的专利菌株。本文采用Sau3A Ⅰ部分酶切的DNA、粘粒载体pLARF-5和Packagene λ DNA包装系统，构建了该菌株基因组文库。文库总量为11000个克隆，插入片段平均长度为14．77kh，按99．99％的概率计算，文库覆盖了基因组4．2次。这为该菌株防治病害和促进植物生长机理研究奠定了物质基础。     

枯草芽孢杆菌 B9601-Y2基因组文库的构建*

 枯草芽孢杆菌B9601-Y₂是一个具有防治植物病害和促进植物生长的专利菌株。本文采用Sau3A I部分酶切的DNA、粘粒载体pLARF-5和Packagene λ DNA包装系统,构建了该菌株基因组文库。文库总量为11 000个克隆,插入片段平均长度为14.77 kb,按99.99%的概率计算,文库覆盖了基因组4.2次。这为该菌株防治病害和促进植物生长机理研究奠定了物质基础。     

稻瘟病菌细菌人工染色体（BAC）基因组文库的构建

 稻瘟病菌是一种重要的植物病原菌,同时又是研究植物和病原物之间相互关系的一个重要试验系统。实验通过采用95-23-4a稻瘟病菌株经提取纯化得到该稻瘟病菌的细胞核基因组总DNA,用限制性内切酶部分酶解后,与经末端去磷酸化处理过的pCUGIBAC1质粒载体按一定摩尔比例相互连接,通过转化E.coli DH10B感受态细胞进而通过蓝白斑筛选挑取白色克隆从而构建了95-23-4a稻瘟病菌株的细菌人工染色体（BAC）基因组文库。通过进行酶切检测及Southern杂交分析后确定所构建的BAC文库平均插入片段29.1 kb,该文库覆盖7.4倍基因组,此基因组文库的构建为该菌致病相关基因的克隆奠定了基础。     

野生稻细胞核DNA提取的研究

药用野生稻是中国最具利用价值的野生稻资源之一,具有许多优良的性状和有利基因,是改良栽培稻培育新品种的宝贵基因库,而其CC基因组的优良基因有望以大片段形式通过BIBAC等载体转化到栽培稻中.BIBAC文库不仅能作为大片段基因组文库的载体,而且能通过根癌农杆菌介导将克隆片段导入植物基因组直接进行转化,可用于筛选分离基因等研究.如何获得基因组DNA大片段非常关键,本研究采取 琼脂糖包埋基因组的方法获得大片段DNA,并对其中的一些步骤进行了优化,为构建药用野生稻BIBAC文库打下了很好的基础,值得在其它植物类似研究中参考.     

田菁（Sesbania rostrata）cosmid基因组文库的建立和豆血红蛋白基因序列的克隆

利用mini-Ti质粒和λ噬菌体cos位点构建的植物cosmid载体,建立了茎瘤田菁cosmid基因组文库,并分子克隆了茎瘤田菁豆血红蛋白基因片段。改进了原有的方法,得到了植物大分子DNA片段和高效价的λ噬菌体体外包装物,为植物cosmid基因组文库的建立提供了关键的条件。菌落原位杂交筛选1.0×10#+5菌落,获得4个含有茎瘤田菁豆血红蛋白基因序列的阳性克隆。质粒DNA点杂交和Southern blot杂交进一步证明了田菁豆血红蛋白基因序列的克隆。     

泥鳅抑制性消减DNA文库的构建及质量分析

为筛选、克隆泥鳅性别特异基因奠定基础,以黄河中下游雌性和雄性成体泥鳅为材料,采用抑制性消减杂交技术(SSH)构建基因组DNA文库,并结合蓝白斑筛选和PCR方法鉴定文库质量.结果表明:雌雄泥鳅基因组DNA的正反向抑制消减文库构建成功,其中,正向文库包含240个克隆,反向文库包含216个克隆,阳性克隆率为95.61％,插入片段范围为0.2～1.0 kb.     

乌金猪基因组文库的构建

 为探究与我国优良地方猪种乌金猪特性相关的基因机制,拟构建其基因组文库。取乌金猪肝脏组织,提取大小50kb以上的基因组DNA,利用限制性内切酶Bcl I对基因组DNA进行随机酶切和低熔点琼脂糖电泳方法回收10~23kb的DNA片段。以EMBL3作为载体,经BamH I酶切和去磷酸化处理后,与上述纯化的目的DNA片段连接,在体外包装成重组噬菌体,重组噬菌体转染宿主菌KW251,构建成乌金猪基因组文库。文库的效价为24×109pfu/mL。乌金猪基因组文库的成功构建,为进行其相关功能基因和基因组区域的识别,基因组DNA和调控元件的克隆与功能分析等后续研究奠定了良好的基础。     

温泉土壤宏基因组文库构建及普鲁兰酶筛选

[目的]构建温泉土壤宏基因组文库并进行普鲁兰酶活性筛选,以期获得高活力、耐高温的新型普鲁兰酶基因.[方法]采用间接法提取温泉土壤样品中宏基因组DNA,经Sephadex G200（含2％ PVPP）凝胶柱和电洗脱两步纯化后,扩增16S rRNA序列,通过序列比对和系统发育进化树分析温泉土壤微生物的多样性;然后以pCC1FOS为载体构建温泉土壤宏基因组文库,并对所获得的宏基因组文库进行活性筛选.[结果]利用宏基因组技术提取温泉土壤样品中微生物的基因组DNA,构建了一个约含1 146个克隆的温泉土壤16S rRNA文库,经遗传进化分析,发现温泉土壤样品中的大部分微生物未被研究过,主要来源于厚壁菌门（Firmicutes）,其次为恐球菌—栖热菌门（Deinococcus-Thermus）和变形杆菌门（Proteobacteria）.用提取获得的宏基因组DNA成功构建了温泉土壤微生物宏基因组Fosmid文库,文库约含2.7万个克隆,平均插入片段长度为40.0 kb,文库外源DNA总容量为1.2×10^9bp;通过活性筛选共获得9个可表达普鲁兰酶活性的克隆.[结论]宏基因组文库技术是获取极端环境微生物新酶的有效手段,可为进一步挖掘普鲁兰酶的应用潜力及研究其耐热机理奠定基础.     

稻田土壤细菌宏基因组文库构建

为了从土壤宏基因组文库中筛选获得具有微生物农药活性的化合物及其基因簇,本研究构建了稻田土壤细菌宏基因组文库.采用直接裂解法提取土样DNA并对其纯化,之后RFLP-PCR分析土样DNA中细菌16S rDNA 基因的多样性,最后以提纯的土壤DNA为外源片段,以Fosmid载体构建了土壤宏基因组文库.提取纯化后的DNA片段大于23kb,RFLP-PCR分析土样DNA具有丰富的遗传多样性,构建获得的土样宏基因组文库约含10 000个克隆子,文库容量为3.56×10(8)bp.本研究掌握了构建土壤宏基因组文库的方法,构建的宏基因组文库可为后续的文库筛选以及获得绿色环保的微生物农药奠定了基础.     

盐湖土壤微生物总DNA提取方法的比较

为了构建运城盐湖土壤微生物宏基因组文库,文章对盐湖土壤微生物总DNA的提取方法进行了比较和探索,通过改良6种植物DNA的提取方法,分别提取了盐湖土壤微生物总DNA,并采用紫外分光光度法、凝胶电泳、内切酶分析和PCR扩增法检测了各个方法所提取的DNA样品的质量。结果表明：改良后的方法3是较适合提取运城盐湖土壤微生物总DNA的方法。采用该方法所得DNA的OD260/280值为1.883,DNA浓度和得率分别为18.1 ng·μL-1和72.4 ng·g-1;DNA片段长度约为23 kb,琼脂糖凝胶电泳条带清晰,无降解;DNA能被EcoRⅠ完全酶切,并可用于PCR扩增分析。     

Sequencing and analysis of Neanderthal genomic DNA

Our knowledge of Neanderthals is based on a limited number of remains and artifacts from which we must make inferences about their biology, behavior, and relationship to ourselves. Here, we describe the characterization of these extinct hominids from a new perspective, based on the development of a Neanderthal metagenomic library and its high-throughput sequencing and analysis. Several lines of evidence indicate that the 65,250 base pairs of hominid sequence so far identified in the library are of Neanderthal origin, the strongest being the ascertainment of sequence identities between Neanderthal and chimpanzee at sites where the human genomic sequence is different. These results enabled us to calculate the human-Neanderthal divergence time based on multiple randomly distributed autosomal loci. Our analyses suggest that on average the Neanderthal genomic sequence we obtained and the reference human genome sequence share a most recent common ancestor approximately 706,000 years ago, and that the human and Neanderthal ancestral populations split approximately 370,000 years ago, before the emergence of anatomically modern humans. Our finding that the Neanderthal and human genomes are at least 99.5% identical led us to develop and successfully implement a targeted method for recovering specific ancient DNA sequences from metagenomic libraries. This initial analysis of the Neanderthal genome advances our understanding of the evolutionary relationship of Homo sapiens and Homo neanderthalensis and signifies the dawn of Neanderthal genomics.     

Genomic sequencing of Pleistocene cave bears

Despite the greater information content of genomic DNA, ancient DNA studies have largely been limited to the amplification of mitochondrial sequences. Here we describe metagenomic libraries constructed with unamplified DNA extracted from skeletal remains of two 40,000-year-old extinct cave bears. Analysis of approximately 1 megabase of sequence from each library showed that despite significant microbial contamination, 5.8 and 1.1% of clones contained cave bear inserts, yielding 26,861 base pairs of cave bear genome sequence. Comparison of cave bear and modern bear sequences revealed the evolutionary relationship of these lineages. The metagenomic approach used here establishes the feasibility of ancient DNA genome sequencing programs.     

绿木霉ZBS6黏粒基因组文库的构建及质量鉴定

为开展绿木霉ZBS6(Trichoderma viride ZBS6)拮抗基因筛选及克隆工作,建立了高质量基因组DNA的提取方法,并采用SuperCos1载体构建了绿木霉ZBS6黏粒基因组文库。试验中共获得3.9×104个黏粒克隆,平均插入片段大小约为33kb,文库滴度约为4.2×108 cfu/mL。理论上,从该文库中筛选到任一DNA序列的精确概率可高达99.9%。     

菖蒲芋螺不同大小基因组DNA片段的分离制备

使用常规酚/氯仿抽提法(CTAB法)、离心柱法和磁珠吸附法,分别从菖蒲芋螺毒腺、肌肉及肝胰脏中提取基因组DNA,利用普通琼脂糖凝胶电泳与脉冲场电泳(PFGE)对基因组DNA片段进行分离,并检测提取DNA的大小和分布范围,同时,对脉冲场电泳条件进行了优化。结果表明,3种方法均可提取基因组DNA,其中CTAB法和离心柱法提取的毒腺DNA纯度高,产率大,可用于后续实验,而磁珠法产率适中且纯度不高,但离心柱法的DNA片段较小,大多在9 kb以下,而CTAB法提取的DNA片段较大,获得的20 kb以上的大片段量较多,更适合于大片段基因组文库的构建。3种芋螺组织中,肝胰脏产率最高但片段弥散有降解,毒腺DNA片段较大且集中,产率也较高,而肌肉的DNA片段产率最低且片段较小。因此,用CTAB法提取菖蒲芋螺毒腺的DNA更适合构建大片段基因组DNA文库。筛选高质量的菖蒲芋螺的DNA,利用优化的脉冲场电泳条件进行分离回收,获得了不同大小片段的DNA,为后续菖蒲芋螺不同载体系统的基因组文库构建奠定了基础。     

一种广泛适用于植物基因组DNA提取的方法

[目的]研究植物基因组DNA提取方法,为从植物组织中快速提取基因组DNA提供指导。[方法]在已发表的植物基因组DNA提取方法基础上,对SDS提取法的操作步骤、试剂用量及作用时间进行了优化。[结果]初步建立了一种广泛适用于各类植物及植物多种组织器官的基因组DNA提取方法。所提取的基因组DNA质量较好,满足下一步操作的要求。[结论]该研究结果为植物基因组DNA的快速提取提供了指导方法。     

一种适宜于文库构建的土壤微生物总DNA提取方法

采用改良的方法提取2种土壤微生物总DNA,并采用透析法对提取的DNA进行纯化,与MO BIO公司PowerSoil DNA isolation Kit试剂盒法进行比较,结果表明,改良的土壤微生物总DNA提取方法提取到的DNA明显高于试剂盒提取的DNA,且A260/A280及A260/A230与试剂盒提取的相差不大,片段也较大,是一种经济方便的土壤微生物总DNA提取方法,比较适合用于构建高质量的宏基因组文库.     

新疆泥火山土壤宏基因组DNA的提取方法研究

[目的]寻找一种有效的泥火山土壤宏基因组DNA的提取方法。[方法]分别采用CTAB法、SDS加酶法、实验室改进法、试剂盒法提取泥火山土壤宏基因组,比较4种方法的提取效果。[结果]试剂盒法的提取效率最高、纯度最好;实验室改进法次之;SDS加酶法提取量最多。实验室改进法获得的DNA稀释10倍可直接用于PCR扩增。[结论]从经济和DNA质量的角度考虑,实验室改进法可作为新疆泥火山土壤宏基因组DNA提取最有效的方法。