意大利蜜蜂4、5和6日龄幼虫肠道发育过程中差异表达基因的趋势分析

为探讨意大利蜜蜂(简称意蜂)幼虫肠道发育过程中的基因表达谱和基因差异表达信息,研究基于前期已获得的高质量的意蜂幼虫肠道转录组数据,利用STEM软件对意蜂4、5和6日龄幼虫肠道的差异表达基因(DEGs)进行趋势分析,进一步通过相关生物学软件对显著上调趋势包含的DEGs进行GO与KEGG代谢通路富集分析及表达量聚类分析。趋势分析结果显示,5 920个DEGs共聚类在8个基因表达模式,其中935个DEGs聚类在1个显著上调趋势。GO富集分析结果显示,显著上调趋势包含DEGs富集于39个GO条目,富集基因数最多的为结合,其次是细胞进程和单组织进程。KEGG代谢通路富集分析结果显示,显著上调趋势包含DEGs富集于94个代谢通路,富集基因数最多的是嘌呤代谢、内质网蛋白质加工和内吞作用。表达量聚类分析结果显示,随着意蜂幼虫肠道发育时间的延长,代谢和免疫相关通路富集基因的表达水平逐渐增强。研究提供了意蜂幼虫肠道发育过程的基因表达谱和基因差异表达信息,揭示了基因表达规律,为深入研究意蜂幼虫肠道发育的分子机制打下了一定基础。     

基于Illumina测序筛选牛卵泡发育相关的上调表达基因

为研究牛卵泡发育过程中促进卵泡生长成为优势卵泡的重要调控因子及其表达模式,采集牛卵巢上的最大卵泡(8～10 mm)与第二大卵泡(5～8 mm),通过测定卵泡液中雌二醇(E_2)与孕激素(P)的水平,确定优势卵泡(DF)和从属卵泡(SF)。刮取DF和SF中的颗粒细胞,提取其总RNA并建立文库,通过Illumina平台进行测序。用SOAP V2.0软件将测序获得的序列与牛参考基因组数据库进行比对,获得mRNA序列;用DESeq 2软件对获得的mRNA进行差异表达分析,并对其中表达上调的基因进行GO分析及KEGG信号通路分析;最后通过实时荧光定量PCR对筛选出的具有代表性的上调表达基因进行验证。通过测序共获得32 346个基因,其中在DF颗粒细胞中表达显著上调的基因有194个。GO分析结果显示,这些表达上调的基因共分为3大类33组,其中参与生物学过程(Biological process)的基因占60.6%;与细胞组分(Cellular component)相关基因占21.2%,其中31个基因参与了细胞质功能;与分子功能(Molecular fuction)相关的基因占18.2%,其中18个基因参与金属离子结合。KEGG信号通路分析共发现4条通路,其中基因富集最为显著的是轴突导向通路。实时荧光定量PCR结果表明,细胞色素P450 19A1基因(CYP19A1)在DF颗粒细胞中的相对表达量极显著高于SF(P0.01),硫氧还蛋白结合蛋白(TXNIP)、脑表达X2(BEX2)和丝氨酸蛋白酶35(PRSS35)基因在DF颗粒细胞中的相对表达量显著高于SF(P0.05),与Illumina测序表达趋势一致。综上,PRSS35、CYP19A1、BEX2和TXNIP在牛卵泡的发育过程中可能会起促进作用,最终引起卵泡排卵。     

利用加权基因共表达网络分析牛口蹄疫病毒感染通路变化

从基因表达综合数据库下载GSE83514数据集,利用加权基因共表达网络分析(WGCNA)筛选与牛口蹄疫病毒感染的相关模块及枢纽基因,并对整个模块内的基因进行GO功能注释和KEGG通路分析。结果显示,通过构建WGCNA共表达网络,确定与牛口蹄疫病毒感染显著负相关的Darkred模块和显著正相关的Green模块为枢纽模块,它们的枢纽基因分别为MFSD4和RHOH。这两个模块基因共富集到20个生物学过程及14条KEGG信号通路,并且两个模块同时富集到DNA复制通路。本研究为探究牛口蹄疫病毒感染通路变化提供了生物信息学依据,筛选的枢纽基因MFSD4和RHOH有望成为抑制牛口蹄疫病毒感染的治疗靶标。     

外源茉莉酸对燕麦在不同干旱胁迫下转录组的影响

为探究外源茉莉酸(Jasmonic acid,JA)对不同干旱胁迫下燕麦转录组的影响,本研究测定轻度(0.017 mol/L PEG-6000处理)和重度干旱胁迫(0.034 mol/L PEG-6000处理)处理及再添加JA处理的‘蒙燕1号’转录组,并对表达显著差异基因(DEGs)进行GO和KEGG功能富集分析。结果表明:GO功能富集分析显示,不同干旱胁迫处理下,外源JA诱导的DEGs均主要富集在膜、催化酶、转移酶和对刺激反应等代谢途径。KEGG功能富集分析显示,在未进行干旱胁迫条件下(CK),外源JA诱导1 955个基因表达上调,4 666个下调;DEGs主要富集的通路为代谢途径和次生代谢物的合成,其中苯丙素的生物合成通路基因表达发生显著变化。轻度干旱胁迫下,外源施用JA诱导1 574个基因表达上调,933个基因下调;DEGs主要富集的通路为次生代谢的生物合成、植物激素信号转导、精氨酸和脯氨酸代谢通路,其中脱落酸和水杨酸信号转导、精氨酸和脯氨酸代谢通路中基因表达均上调;重度干旱胁迫下,外源JA诱导223个基因表达上调,456个下调;DEGs显著富集的只有鞘脂代谢通路。与未施用JA相比,不同干旱胁迫下,施用JA均可诱导细胞分裂素(CTK)代谢通路中CTK的N-糖基化基因(UGT73C5)上调和氧化酶/脱氢酶基因(CKX11)下调,以及脱落酸(ABA)信号转导相关基因(THI1.3)和未知功能基因(AT1G71250)表达发生显著变化。综上,轻度和重度干旱胁迫下,外源JA能诱导燕麦响应干旱胁迫的CTK和ABA相关基因表达发生显著变化。     

意大利蜜蜂6日龄幼虫肠道内球囊菌的差异表达基因分析

为检测蜜蜂球囊菌(Ascosphaera apis)在胁迫意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica,简称意蜂)幼虫后期的基因表达谱,利用RNA-seq技术对纯培养的球囊菌孢子及球囊菌胁迫的意蜂6日龄幼虫肠道进行深度测序。通过比较处理组和对照组得到21 361个差异表达基因(DEGs),包括15 306个上调基因和6 055个下调基因。GO富集分析结果显示,上调基因富集于39个GO条目(term),基因富集数最多的为细胞进程(2 416unigenes)、细胞(2 408 unigenes)和细胞组件(2 408 unigenes);下调基因富集于38个GO term,基因富集数最多的为代谢进程(1 227 unigenes)、细胞进程(1 185 unigenes)和细胞(1 131 unigenes)。KEGG代谢通路富集分析结果显示,上调基因富集在119个通路,其中基因富集数最多的是核糖体(221 unigenes),其次为内质网中蛋白加工(190 unigenes)和内吞作用(177 unigenes);下调基因富集在113个通路上,基因富集数最多的是核糖体(144 unigenes),其次为RNA转运(113 unigenes)和氨基酸生物合成(108 unigenes)。进一步分析发现,富集在MAPK信号通路上的64个基因上调表达,说明该通路在球囊菌胁迫后期被激活。研究结果不仅为揭示球囊菌在胁迫意蜂幼虫后期的病原-宿主互作提供了重要信息,也为阐明球囊菌致病的分子机制奠定了基础。     

miR-15b靶基因预测、信号通路分析及靶基因鉴定

【目的】对miR-15b靶基因进行预测、信号通路分析及鉴定,以期为miR-15b的功能研究奠定基础.【方法】利用Target Scan Release 7.0,PicTar和PITA数据库对miR-15b靶基因进行预测,再用DAVID数据库对预测出的靶基因集进行功能富集分析(gene ontology-analysis)及信号转导通路富集分析(KEGG pathway analysis).随后利用双荧光素酶报告试验对预测出miR-15b的靶基因丙酮酸脱氢酶激酶4(PDK4)和CD28进行验证.【结果】3个软件共同预测出miR-15b的靶基因有305个,其靶基因集合功能富集于蛋白激酶活性、GTP结合蛋白调控等分子功能,蛋白氨基酸磷酸化、细胞周期调控等生物学过程及微管相关复合体、转录因子复合体等细胞组分上.信号转导通路则显著富集于癌症相关信号通路.双荧光素酶报告实验结果显示CD28为miR-15b的靶基因,而PDK4不是miR-15b的靶基因.【结论】miR-15b在细胞增殖、凋亡和细胞周期调控等过程中发挥重要调控作用,且miR-15b通过调控CD28的表达对T细胞的受体激活发挥调控作用.     

基于转录组测序对紫花苜蓿细胞质雄性不育系相关代谢通路的鉴定

【目的】研究紫花苜蓿(Medicago sative L.)细胞质雄性不育(CMS)的机理,为紫花苜蓿利用不育系的育种工作提供理论基础。【方法】本研究以紫花苜蓿细胞质雄性不育系MSGN1A及其保持系MSGN1B为材料,进行转录组测序(RNA-Seq)以及基因功能注释,筛选与不育系机理相关的差异表达基因及代谢通路。【结果】Illumina测序共得到紫花苜蓿95 679条功能基因,经过差异表达分析筛选出187个显著差异表达的基因(DEGs),其中包括18个上调基因,169个下调基因。采用GO、KEGG、COG注释库分别对187个DEGs进行功能注释,其主要涉及催化活性、代谢活动、信号传导机制、合成、膜功能、碳水化合物运输和代谢、能量代谢等相关通路。【结论】筛选出与紫花苜蓿细胞质雄性不育性相关的代谢通路,初步探讨了紫花苜蓿细胞质雄性不育系的分子机理。     

猪心肌和骨骼肌miRNA转录组比较分析

【目的】研究microRNA(miRNA)在猪不同类型肌肉生长发育中的作用。【方法】以猪心肌以及2种骨骼肌(背最长肌和腰大肌)为材料,采用Illumina高通量测序技术鉴定其miRNA转录组,并进行差异表达分析和靶基因富集分析。【结果】从猪心肌、背最长肌和腰大肌组织的3个小RNA测序文库中共获得约56M的序列,通过生物信息分析共鉴定出907个非冗余miRNA,其中441个miRNA在3个文库共同表达,123个miRNA在文库间表现为显著的差异表达(P10-6)。对3个文库差异表达miRNA的相关性分析发现,背最长肌与腰大肌的相关性最高(r=0.94),证明2种骨骼肌的表达模式十分相近,而心肌与2种骨骼肌的表达模式不同。通过对各文库高表达的miRNA分析发现,表达量前十的miRNA中有6个miRNA的表达量在心肌中极显著上调。对在心肌内上调的6个miRNA进行的靶基因预测和生物学功能预测发现,这些差异miRNA主要靶向作用于钙信号通路和胰岛素信号通路。荧光定量PCR(qRT-PCR)验证结果表明高通量测序结果准确可靠。【结论】从miRNA层面揭示了猪心肌和骨骼肌的差异,这种差异在一定程度上印证了心肌和骨骼肌之间迥异的生理学特征。     

基于RNA-seq技术筛选山羊卵泡发育相关下调基因

【目的】对山羊优势卵泡(DF)和从属卵泡(SF)颗粒细胞进行高通量测序,筛选并研究与山羊卵泡发育相关的下调基因。【方法】以1岁龄贵州白山羊为供试对象,在其发情3 d后,采集第一卵泡波中的优势卵泡(DF)和从属卵泡(SF),分别分离其颗粒细胞,提取RNA并进行文库构建、Illumina测序,将获得的序列与山羊的RefSeq数据库进行比对后,用DESeq2软件对获得的RNA进行差异表达分析,并对表达下调的基因进行GO分析和KEGG信号通路分析,最后通过Real-time PCR对筛选出的表达下调基因进行验证。【结果】将测序结果与山羊的RefSeq数据库比对后,共获得了33 896个基因。经DESeq2软件对获得的mRNA进行差异表达分析,共获得695个差异表达m-RNA,其中462个表达显著下调,233个表达则显著上调;对462个表达下调基因进行GO分析,共分为2大类39组,其中参与生物学过程(BP)的基因占48.7%;与细胞组分(CC)有关的基因占51.3%。KEGG信号通路分析发现20条通路,其中参与癌症通路基因富集最为显著。从下调基因中筛选出6个可能会抑制山羊卵泡发育的基因,分别为PTX3、LDLR、RGN、NID1、PDLIM5、PRLR。Real-time PCR结果显示,RGN、NID1、PDLIM5、PRLR在SF与DF中的表达趋势与高通量测序结果一致,且RGN在SF颗粒细胞中的表达量极显著高于DF(P0.01),NID1、PDLIM5在SF颗粒细胞中的表达量显著高于DF(P0.05);PTX3、LDLR在SF与DF中表达量与高通量测序结果相反。【结论】获得的6个表达下调基因在山羊卵泡发育过程中可能会抑制卵泡的发育,最终导致卵泡闭锁。     

利用iTRAQ技术和转录组筛选芍药属远缘杂交不亲和基因

【目的】远缘杂交育种是目前牡丹、芍药品种改良和育种的主要方法,而远缘杂交不亲和一直是制约其快速发展的主要因素。本研究从牡丹、芍药远缘杂交授粉后不亲和应答相关的柱头差异蛋白与转录组方面深入研究,揭示牡丹、芍药远缘杂交不亲和的分子机理,为杂交育种提供理论依据。【方法】以芍药‘粉玉奴’自交、芍药‘粉玉奴’与牡丹‘凤丹白’杂交为供试材料,在授粉后24 h采取柱头,分别进行同位素标记相对定量(iTRAQ)和转录组技术分析。对所获得的蛋白和转录组数据进行生物信息学分析,并对其中可能与远缘杂交不亲和相关的基因进行定量PCR验证。【结果】利用iTRAQ技术分析牡丹、芍药远缘杂交后柱头中蛋白质的表达差异,共鉴定到685个差异蛋白,富集到了188条通路,其中显著富集的Pathway有18条。与不亲和授粉相关代谢通路有RNA降解、钙信号途径、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase signaling pathway,MAPK)信号途径、磷脂酰肌醇信号系统。在RNA降解代谢通路中,烯醇酶(Enolase)、热休克蛋白DnaK(HSP70)及病菌抗原(GroEL)均表达下调。在钙信号途径中,钙调蛋白(CALM)表达下调,腺苷酸转运酶(adenine nucleotide translocase,ANT)表达量增加,表达上调。MAPK信号途径中,乙二醛酶Ⅰ(GloI)表达下调。磷脂酰肌醇信号系统中的钙调蛋白(CALM)表达下调。随机选取与差异蛋白相关的6个基因进行qRT-PCR验证,结果显示,6个基因的表达与蛋白质水平趋势相一致,均表达下调。通过转录组测序,共获得了52 998个有注释信息的Unigene,占所有Unigene的40.37%。基于6组样品的RPKM(Reads Per Kilobase per Million)值,共筛选到16 224个差异基因。其中上调基因13 361,下调基因2 863个。对差异基因进行Pathway显著富集分析,杂交与自交相比,不亲和差异表达的基因主要富集在氧化磷酸化代谢、ABC转运蛋白、次级代谢产物等通路。与远缘杂交不亲和相关且发生显著变化的基因有CalS-5、CalS-12(胼胝质酶)和SPL(squamosa promoter binding protein-like)表达上调,ABCF(ABC transporter family protein)表达下调。【结论】在转录组和蛋白数据共注释到6个蛋白、4个基因与植物不亲和性密切相关,这些蛋白与基因可能在远缘杂交不亲和方面发挥着重要作用。     

以LacZ为报告基因探讨促进基因表达及基因免疫应答物质的筛选

应用分子生物学技术构建了LacZ报告基因的pcDLacZ真核表达载体 ,并对多种促进基因表达的物质进行了筛选。应用筛选的促进基因表达物质对pcDST基因疫苗的免疫增强效果进行了观察。结果 :构建的LacZ报告基因的pcDLacZ真核表达载体 ,肌注后 1天就有表达 ,到第 7天达到高峰。通过对多种促进基因表达的物质进行筛选证明 ,4.5 %斯苯、1 %甘油、2 5 %蔗糖有明显促进基因的表达作用。 4.5 %斯苯、1 %甘油能促进pcDST猪瘟基因疫苗的免疫效果。表明 :4.5 %斯苯、1 %甘油可做为基因疫苗的免疫佐剂使用     

禽类PRL基因的cDNA克隆及生物信息学分析

[目的]通过对PRL基因(催乳素基因)的克隆及生物信息学分析,研究该基因编码的蛋白对禽类就巢性的作用。[方法]利用原鸡PRL基因mRNA序列(NM-205466)与蓝孔雀表达序列标签(EST)数据库进行Blast检索,以及序列拼接和逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR),获得了蓝孔雀PRL基因的部分cDNA序列,并对该序列进行了生物信息学分析。[结果]获得的cDNA序列片段长度为927bp,包括完整的开放阅读框690 bp,编码229个氨基酸。系统发育树的构建发现蓝孔雀与原鸡亲缘关系比较近,与鹑次之,与火鸡亲缘关系最远。[结论]该研究结果为研究PRL蛋白的生物学功能奠定了基础。     

基因芯片数据分析中的基因集合分析技术

基因芯片是一种高通量研究生命规律的技术,但是如何从海量的基因芯片数据中获得生物信息依旧是一个难题。基因集合分析技术可以从这些海量的生物数据中揭示出潜在的被影响的生物过程。     

OMA DS10和OAP3基因在文心兰各器官中的表达

为研究兰花MADS-box基因的表达与花器官发育之间的关系,以文心兰为材料,通过荧光定量实验对文心兰中AP1家族成员OMA DS10和AP3家族基因OAP3进行了表达分析.结果表明:OMADS10和OAP3基因在花芽生长的整个过程中都表达,且都在营养器官(叶片,茎)和花器官所有部位中表达,但表达量存在明显差异.OMADS10在合蕊柱中强烈表达,其次是花瓣.OAP3在花萼中强烈表达,其次是合蕊柱.