双指标优化黑曲霉液态发酵条件及降解棉秆效果

【目的】以羧甲基纤维素钠酶活(Carboxymethylcellulose sodium enzyme activity,CMCase)和滤纸酶活(Filter paper enzyme activity,FPAase)作为双指标,通过响应面法对黑曲霉(Aspergillus niger)ZD产纤维素酶的液体发酵条件进行优化,研究黑曲霉对棉花秸秆的降解效果。【方法】通过单因素试验确定主要影响因素,通过Plackett-Burman和Box-Behnken设计进行因素优化和交互作用的影响,测定棉秆中纤维素含量。【结果】单因素试验确定碳源为淀粉,氮源为蛋白胨,无机盐为K₂HPO₄,培养时间168 h,转速150 r/min,温度30℃,接种量7%;利用Plackett-Burman设计筛选出影响产酶的显著因素是淀粉质量浓度、蛋白胨质量浓度、转速和接种量;最后通过Box-behnken确定产酶的最佳发酵条件,淀粉质量浓度1.21 g/100 mL,蛋白胨质量浓度0.25 g/100 mL,K₂HPO₄质量浓度0.1 g/100 mL,培养时间168 h,转速170 r/min,温度30℃,接种量7.8%,比初始发酵条件提高了35.96%。【结论】利用黑曲霉通过液体发酵降解棉秆效果显著,可以有效降解棉秆中纤维素和半纤维素,用真菌实现棉秆饲草化极具前景。     

棉秸秆自然腐解过程中细菌菌群多样性分析

【目的】 分析棉秸秆在自然腐解过程中细菌群落组成和多样性,获得与棉秸秆腐解有关的优势细菌菌属,为秸秆腐熟菌剂的制备奠定基础。【方法】 采用高通量测序技术,对棉秸秆自然腐解过程、不同时间样品中的细菌16S rDNA基因的V4区测序,利用生物信息学方法分析测序结果。【结果】 测序共得到354 067条有效序列,2 111条OTU序列,腐解初期有268个菌属,中期有300个菌属,末期有325个菌属。菌群α多样性指数分析显示,随着腐解时间的延长,7 d以后菌群多样性增加,与起始时相比差异显著(P＜0.05),而7~28 d菌群多样性差异不显著(P＞0.05)。在整个堆制过程中始终存在的优势菌属包括鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium)、橄榄球菌属(Olivibacter)、假黄单胞菌属(Pseudoxanthomonas)、德沃斯氏菌属(Devosia)、根瘤菌属(Rhizobium)。【结论】 棉秸秆自然腐解过程中,在7 d时细菌群落多样性在属水平上与腐解起始阶段差异显著(P＜0.05),随着腐解时间延长,菌落多样性趋于一致;在整个腐熟过程中始终存在五个优势属,功能预测为降解纤维素、木质素、果胶类物质以及提供氮素营养。     

黑曲霉ZD利用棉花秸秆固体发酵产纤维素酶条件优化

【目的】以棉花秸秆作为发酵基质,优化黑曲霉(Aspergillus niger)ZD固体发酵产纤维素酶的发酵条件。【方法】以固体发酵条件(棉花秸秆和玉米粉的比例、发酵时间、接种率、含水量和pH值)为优化因素,通过单因素试验和Plackett-Burman试验,确定主要影响因素;再由最陡爬坡试验确定优化中心点,最后通过 Box-Behnken中心组合设计确定主要影响因素及其交互作用对固体发酵产酶的影响,并对其进行回归分析。【结果】由单因素试验和Plackett-Burman试验确定碳氮比,接种量和含水率为主要影响因素;最陡爬坡试验确定棉花秸秆与玉米粉的比例4∶1,接种量10%和含水率60%为中心点;Box-Behnken中心组合试验确定最佳发酵条件:棉花秸秆和玉米粉的比例为4.4∶1,接种量8.12%,含水率60%,发酵时间40 d,pH为4,此条件下羧甲基纤维素钠酶活最高,为310.885 U/mL;比未优化条件下的酶活207.496 U/mL提高了49.8%。【结论】确定黑曲霉ZD利用棉花秸秆固体发酵产纤维素酶的最优条件,为利用该菌制备棉花秸秆发酵饲料,降解棉花秸秆纤维素含量,提供了理论依据和工艺参数。     

棉秆腐熟过程中相关指标及可培养微生物数量的变化

【目的】 研究不同添加物配方对棉秸秆腐熟过程中相关指标和微生物数量的变化。【方法】 以棉秸秆为原料,设置不同的添加物配方,进行棉秸秆堆肥腐熟发酵。对其发酵相关指标(温度、pH、电导率、速效氮、磷、钾浓度)及主要微生物变化进行测定分析。【结果】 3种处理的温度、pH、电导率、速效氮磷钾的变化趋势基本相同,但相对含量不同,不同处理下的微生物数量也均不同。【结论】 处理3(基础配方+磷酸二氢钾2%)堆肥发酵效果最优,pH值为8.59~8.89,EC值为4 ms/cm左右,更适宜堆肥发酵。     

棉秆纤维素降解复合菌系的筛选及其分解特性研究

[目的]从自然环境中筛选降解棉秆的纤维素分解复合菌系,以降解棉秆中的纤维素.[方法]采用PCS培养基,从牛粪、土壤、羊的瘤胃液和发酵粪中筛选纤维素分解复合菌系,通过连续继代培养,获得相对稳定的复合菌系,再获得粗酶液,测定三种酶活(CMC、FPA、纤维二糖酶)和酶解效果.[结果]牛粪的降解纤维素复合系,酶活分别为CMC 11.95 U/mL、FPA 8.29 U/mL、纤维二糖酶11.03 U/mL,产酶动态变化在4～5d酶活性比较高,确定发酵周期为5d,pH值先上升后下降,在发酵的4～5d,pH值相对较高,以后开始下降,维持稳定,呈现弱碱性.[结论]来自牛粪的纤维素降解菌降解能力最强,降解棉花秸秆效果较好,棉秆失重率为18;,糖化率为19.39;.     

棉花VIGS病毒载体的构建及其在抗病基因功能鉴定的应用

【目的】利用农杆菌介导的VIGS基因沉默技术,研究陆地棉抗病相关基因在棉花抗黄萎病中的功能。【方法】利用分子生物学技术构建VIGS病毒载体,建立VIGS病毒诱导沉默体系;利用此体系将棉花中的一个钙依赖蛋白(CDPK)基因,通过农杆菌介导在陆地棉中沉默,根据此基因沉默植株在病原菌环境下的发病情况研究该基因在棉花抗病中的功能。【结果】利用包含有GhCPK抗病基因片段的VIGS病毒载体的农杆菌侵染棉花子叶,病毒载体上的目的基因片段由RNA聚合酶识别并合成双链RNA(double stranded RNA,dsRNA),dsRNA由Dicer酶识别并于其它RNA形成RNA诱导的沉默复合体(RNA induced silencing complex, RISC),RISC对内源GhCPK mRNA进行识别和切割作用,内源GhCPK mRNA降解而发生基因沉默。GhCPK基因沉默导致棉苗对黄萎病敏感性增加,证明GhCPK基因参与调控棉花抗病功能。【结论】病毒诱导的基因沉默技术(VIGS)能够快速有效的研究GhCPKs基因在棉花抗病中的功能。     

腐熟堆肥中维素降解菌筛选鉴定及酶学特性研究

为筛选高效纤维素降解菌,促进堆肥过程中秸秆等纤维素物质快速腐解,在以牛粪和秸秆为材料的腐熟堆肥中分离菌株,以刚果红培养基和滤纸条降解试验初筛菌株,筛选出透明圈与菌落直径比值较大、滤纸条分解能力较强的菌株,作液体发酵培养,测定其酶活力,得到羧甲基纤维素(CMC)酶活和滤纸(FPA)酶活均较高2株菌(1号和7号),并将其在以羧甲基纤维素钠为唯一碳源产酶培养基中作产酶特性研究。结果表明,pH 6.5,培养时间48 h条件下,1号和7号菌株CMC酶活分别为26.82和31.28 U·m L-1,FPA酶活分别为20.32和20.82 U·m L-1。通过形态学、生理生化特征、16S rDNA核酸序列分析及26S rDNA的D1/D2区域测序鉴定,确定1号菌属于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),7号菌属于隐球酵母菌(Cryptococcus flavescens)。     

棉花GhPAO3基因的CRISPR/Cas9表达载体的构建

【目的】研究棉花GhPAO3基因的功能,通过CRISPR/Cas9技术构建棉花GhPAO3基因的基因编辑载体。【方法】筛选合适的两个PAM位点设计引物,在引物中添加接头,重叠延伸PCR,将两个靶标片段连接在一起。通过限制性核酸内切酶BsaⅠ对pRGEB32-7载体进行单酶切,使用一步法连接重叠延伸产物与线性化的pRGEB32-7载体。【结果】使用电击转化法将构建好的棉花GhPAO3基因的基因编辑载体转入农杆菌LBA4404感受态,通过卡那霉素筛选阳性单克隆菌株。【结论】条带大小与预期一致,棉花GhPAO3基因的基因编辑载体构建成功。     

外源氮肥、磷钾肥对棉秸秆堆腐的影响

【目的】研究外源氮肥、磷钾肥对棉花秸秆腐解过程的影响,为棉秸秆肥料化、基质化利用提供理论依据。【方法】采用网袋堆制熟腐法,设置棉秸秆自然堆腐、棉秸秆添加氮肥(尿素)堆腐、棉秸秆添加磷钾肥(磷酸二氢钾)堆腐共3个处理,分别在堆腐的前期(0~7 d)、中期(7~14 d)、后期(14~21 d)、末期(21~28 d)取样,测定棉秸秆质量及纤维素、半纤维素、木质素含量,分析棉秸秆累积失重率和阶段失重率,以及3种纤维成分的累积降解率和阶段降解率。【结果】添加氮肥可提高棉秸秆累积失重率,比自然堆腐提高6.7%;添加磷钾肥后,棉花秸秆失重率比自然堆腐降低了6.3%。添加氮肥后棉秸秆的降解速率在堆腐初期与自然堆腐相比有明显下降,之后降解速率加快。自然堆腐和添加磷钾肥处理的降解速率在堆腐初期最快,中期有显著下降,之后缓慢上升。添加氮肥和磷钾肥均能提高纤维素、半纤维素和木质素的降解率。在堆腐末期,和自然堆腐相比,添加氮肥或磷钾对纤维素的累积降解率分别提高178.29%和47.82%;添加氮肥和磷钾肥对半纤维素的累积降解率基本相同,提高幅度在40.6%左右;添加氮肥和磷钾对木质素的降解率分别提高9.13%和59.6%。纤维素降解最快阶段,添加氮肥是出现在堆腐末期,磷钾肥是出现在堆腐后期,CK是出现在前期和中期。半纤维素降解最快阶段,3种处理都是在堆腐前期。木质素降解最快阶段则都出现在堆腐前期和中期。【结论】添加氮肥和磷钾肥均能促进棉秸秆堆腐的降解程度,氮肥降解程度要高于磷钾肥,氮肥对棉秸秆的降解趋势与CK和磷钾肥有不同之处。氮肥对纤维素降解的促进程度要高于磷钾肥;氮肥和磷钾肥对半纤维素降解的促进程度基本相同;磷钾肥对木质素降解的促进程度要高于氮肥,降解变化过程也不相同。     

纤维素降解菌系的筛选及降解稻草条件研究

以已分离的11株纤维素降解菌为材料,采用滤纸崩解法和透明圈法,初步筛选出4株纤维素降解能力较强的菌株.将这4株单菌进行两两组合.研究混合菌系在9d内的CMC酶活和FPA酶活与单菌发酵之间的异同.结果表明,混合菌发酵CMC酶活和FPA酶活均优于单一菌株;同时筛选出一组具有高降解能力的混合菌体系;并对该混合菌系降解稻草的最...     

一株无柄灵芝菌(G.resinaceum)LZ02高产漆酶液体培养基的响应面法优化

【目的】采用响应面法优化液体发酵培养基的碳、氮源,提高大型真菌无柄灵芝菌(G.resinaceum)LZ02的漆酶产量。【方法】 在MF基础产酶培养基和单因素试验的基础上,以干酪素(A)、麦麸(B)、葡萄糖(C)、酒石酸铵(D)的添加量为4个影响因素,以漆酶酶活为响应值(Y),采用Design-Expert8软件的中心组合设计方法设计响应面试验,研究干酪素、麦麸、葡萄糖、酒石酸铵各自变量及其交互作用对漆酶产量的影响,并建立以漆酶产量为响应值的二次多项式回归数学模型,得到高产漆酶的最佳液体发酵培养基的碳氮源配比。【结果】无柄灵芝菌(G.resinaceum)LZ02产酶培养基4个因素的最佳组合为干酪素含量2.5%、麦麸含量1.5%、葡萄糖含量1.0%和酒石酸铵含量0.6%时,相应响应面二次模型预测漆酶活性最大值为16505U/L,通过3次平行摇瓶发酵试验得到的菌漆酶活性为15 800 U/L,与理论预测值无明显差异。【结论】响应面分析法提供的模型较真实地拟合了实际情况,证明了模型的可靠性。     

菌酶共降解棉秸秆的工艺研究

[目的]研究菌酶共降解棉秸秆工艺,为菌酶混合棉秸秆固体发酵的研究提供相应的工艺参数和理论依据.[方法]根据羧甲基纤维素酶活和滤纸酶活确定最佳混菌组,采用正交试验,研究不同混菌组、酶制剂、含水量对NDF含量、ADF含量、纤维素含量、纤维素降解率的影响,并且通过感官评价、pH值及干物质含量确定发酵棉秆品质.[结果]发酵最优条件为A1B2C2,即混菌组为Lp+∶TH14∶295∶BS-2=1∶1∶1∶1,酶活为15 000 U/g,加水量为50;.最优发酵条件下,NDF含量降低4.61;,ADF含量降低8.01;,纤维素含量降低10.74;,纤维素降解率达25.62;,pH值为4.21,干物质含量为54.2;,棉秆品质为优等.[结论]菌酶混合发酵棉秸秆提高棉秆品质的最佳条件.     

红枣黑斑病拮抗细菌JK1产芽孢培养基的优化

【目的】 采用响应面法对红枣黑斑病的拮抗细菌JK1培养基进行优化,提高其发酵产物中芽孢的浓度。为该菌应用提供数据。【方法】单因素实验确定培养基碳氮源物质,Plackett-Burman试验分析发酵培养基中对JK1发酵影响最重要的主要因素;运用最陡爬坡法对主要因素进行试验,获得主要因素的最适范围。通过响应面分析得到主要因素的最优水平。【结果】优化后的培养基组成为:麦芽浸粉 25.00 g/L、葡萄糖 0.57 g/L、大豆蛋白胨 12.5 g/L、NaCl 2.7 g/L、K₂HPO₄ 0.25 g/L 、MgSO₄ 0.625 g/L。【结论】在最优发酵培养基培养下,多粘类芽孢杆菌的芽孢数提高了3.4倍,达到4.92×10⁹CFU/mL。     

藏猪源高产纤维素酶菌株的筛选及鉴定

【目的】从西藏藏猪粪便中分离可高效降解纤维素的菌株,并对其进行分类和鉴定。【方法】用羧甲基纤维素(CMC)水解圈法对藏猪粪便中的产纤维素酶菌株进行初筛,再用滤纸降解试验、秸秆纤维降解试验和胞外酶活力测定等进行复筛,筛选可高效降解纤维素的细菌。通过观测所获菌株的菌落形态和生理生化特征以及16S rRNA基因序列分析,对菌株进行分类鉴定。【结果】筛选到1株具有较强纤维素降解能力的菌株,经鉴定其是解淀粉芽孢杆菌的一个亚种或变种,将其命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)TL106。该菌株的内切葡聚糖酶和β-葡聚糖苷酶活力分别高达86.34和65.54U/mL。【结论】获得了可高效降解纤维素的菌株TL106,具有较好的应用前景。     

海岛棉GbHCT10基因的克隆与表达分析

【目的】研究海岛棉(Gossypium barbadense)GbHCT10基因在棉纤维发育中的作用。【方法】 以海岛棉品种新海21号纤维发育第5 d的样本作为材料,根据海岛棉GbHCT10基因序列设计一对引物,利用RT-PCR技术从中克隆GbHCT10核苷酸序列。利用生物信息学方法分析GbHCT10基因序列。【结果】 采用实时荧光定量PCR技术分析海岛棉GbHCT10基因在新海21号棉花开花后不同时期中表达量差异,该基因具有长度为1 248 bp的开放阅读框,编码415个氨基酸,预测蛋白质分子量为45.13 kD,等电点为6.01。海岛棉GbHCT10基因的表达随棉纤维发育变化而变化,在开花后第5和第10 d时表达量较高,第25 d表达量最低,总体表达量呈现波动状态。【结论】 新海21号GbHCT10基因与树棉HCT基因在同一分支,有较近亲缘关系。     

一株纤维素降解菌的鉴定及其对饲料粗纤维的降解效果

【目的】对本课题组分离的一株纤维素降解菌进行鉴定,优化其产酶条件并检测其对饲料粗纤维的降解效果,以期为该菌在饲料粗纤维降解中的应用提供理论依据。【方法】通过菌株形态特征和16SrDNA序列分析鉴定了实验室分离保存的一株纤维降解菌;研究该菌所产纤维素酶的部分酶学性质和酶谱,并优化其产纤维素酶的条件;利用体外发酵和尼龙袋法测定菌株N3所产粗酶液对3种饲料(麸皮、麦草、燕麦)粗纤维的降解率;利用RB亮蓝脱色试验检测该菌的木质素降解能力。【结果】经鉴定,该菌株为枯草芽孢杆菌,命名为Bacillus subtilis N3;N3菌株不产生漆酶,主要向胞外分泌分子质量70ku以上的纤维素酶组分;N3菌株所产纤维素酶的最适反应温度和pH分别为60℃和5.5;N3菌株以体积比1∶50接种至最适发酵培养基(碳源为麸皮、氮源为蛋白胨,初始pH为5),37℃培养24h时,所产纤维素酶活性最高,可达3.50U/mL;菌株N3所产粗酶液对麸皮的粗纤维降解率最高,对麦草秸秆的粗纤维降解率最低。【结论】分离到的纤维降解菌Bacillus subtilis N3主要分泌分子质量70ku以上、耐热的纤维素酶,对饲料粗纤维具有较强的降解能力。     

CRISPR-Cas9技术敲除甜瓜eIF4E基因表达载体的构建

【目的】构建甜瓜eIF4E基因的CRISPR-Cas9植物基因编辑系统的gRNA 表达载体。为研究eIF4E基因功能奠定基础。【方法】以新疆主栽甜瓜皇后为材料,在eIF4E基因的第一个外显子区设计gRNA引物,以载体pP1C.4为模板,扩增获得sgRNA克隆框,使用EcoR I、Xba I双酶切pP1C.4载体,利用DNA重组酶构建重组载体pP1C.4-eIF4E。【结果】经菌落PCR检测和测序,gRNA 已经成功连接到植物基因敲除载体pP1C.4。【结论】构建了植物基因敲除载体pP1C.4-eIF4E,pP1C.4-eIF4E能对eIF4E基因进行定向编辑。     

废弃菌渣中纤维素降解细菌的筛选及其降解特性分析

【目的】研究羧甲基纤维素钠（CMC-Na）和纤维素粉对纤维素降解细菌筛选结果的影响,为废弃食用菌菌渣的综合利用提供参考依据。【方法】分别以CMC-Na和纤维素粉为唯一碳源,采用刚果红染色法从废弃菌渣中筛选出具有纤维素降解性能的细菌,利用形态学和分子生物学对其进行鉴定,通过酶活力测定和滤纸崩解试验对各菌株的纤维素降解特性进行对比分析。【结果】从CMC-Na固体培养基分离纯化获得的34株细菌中有7株具有较好的纤维素降解性能,经鉴定主要是芽孢杆菌（Bacillus sp.）、枯草芽孢杆菌（B. subtilis）和解淀粉芽孢杆菌（B. amyloliquefaciens）,而从纤维素粉固体培养基分离纯化获得的36株细菌中有7株具有较好的纤维素降解性能,经鉴定主要是高山芽孢杆菌（B. altitudinis）、甲基营养型芽胞杆菌（B. methylotrophicus）、解淀粉芽孢杆菌、解淀粉芽胞杆菌植物亚种（B. amyloliquefaciens subsp.plantarum）、沼泽芽孢杆菌（B. vallismortis）、贝莱斯芽孢杆菌（B. velezensis）和芽孢杆菌。通过酶活力测定试验和滤纸条崩解试验发现,g31菌株在7 d内能将滤纸崩解成糊状,该菌株具有最高的滤纸酶（FPase）和内切葡聚糖酶（CMCase）活力,分别为33.14和394.41 U/mL,而C23菌株具有较高的β-葡萄糖苷酶（β-Gase）活力,为118.12 U/mL,g29菌株具有较高的外切葡聚糖酶（Cex）活力,为1.22 U/mL。【结论】以纤维素粉为碳源分离筛选得到的纤维素降解细菌种类更丰富,具有更好的滤纸崩解效果和更高的酶活性能,可为纤维素降解提供优质的菌种资源。     

梨火疫病抑菌制剂的室内筛选

【目的】筛选抑制梨火疫菌(Erwinia amylovora)的药剂,为防控梨火疫病提供参考与依据。【方法】采用最低抑制浓度和抑菌圈比较的方法,对30种抑菌制剂进行筛选。【结果】内吸性抑菌制剂1.8%辛菌胺醋酸盐,有机类抑菌制剂3%噻霉酮(ME)、3%噻霉酮(WP)和30%壬菌铜,植物源类型制剂80%乙蒜素以及微生物制剂荧光假单胞杆菌3 000,是室内试验对梨火疫菌抑菌效果较好的制剂。【结论】不同药剂之间、同一种药剂不同剂型之间抑菌效果差异较大,研究筛选得到的6种抑菌制剂可为梨火疫的防治提供参考。     

耐盐纤维素降解菌的筛选、鉴定及其配比优化的研究

【目的】研究Box-Behnken(BBK)试验设计结合响应面分析法提高玉米秸秆的降解率。【方法】从玉米秸秆堆肥的盐碱土壤中分离筛选出4株高效耐盐纤维素降解菌WH2、WH4、WH7和WH9,经形态观察、生理生化反应和分子鉴定,确定4株菌分别为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、荧光假单胞菌(Pseudomonas formosensis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和松嫩假单胞菌(Pseudomonas songnenensis)。在单因素试验、BBK中心组合试验设计及响应面法分析法的基础上,以玉米秸秆降解率为响应值,利用响应面法研究各因素及其交互作用对玉米秸秆降解率的影响,优化菌种配比工艺。【结果】耐盐纤维素降解菌的最佳配比工艺:当秸秆添加量为2.0 g时,菌种WH2、WH4、WH7和WH9接种量分别为0.31、0.21、0.32和0.22 g时的玉米秸秆降解率达到最大值。【结论】在耐盐纤维素降解菌最优配比条件下,玉米秸秆降解率预测值为61.17%,验证值为60.90%,两值相差0.27%,证明了响应面法的合理性和有效性,为新疆盐碱地区玉米秸秆的微生物降解提供科学依据。