抗速灭威噬菌体单链抗体库的构建、筛选及鉴定

以速灭威抗原免疫的小鼠为实验对象,取其脾细胞,RT-PCR扩增抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因,重叠延伸PCR拼接单链抗体(ScFv)基因,克隆入噬菌粒表达载体pCANTAB5E并转化大肠杆菌TG1,成功构建了库容约7.6×105的抗速灭威噬菌体ScFv库。对该文库进行了5轮"吸附-洗脱-扩增"的富集筛选,获得了6个特异性较强的抗速灭威噬菌体ScFv阳性克隆。其研究结果为速灭威特异性抗体的大量制备奠定了一定的基础。     

新疆双峰驼纳米抗体噬菌体展示文库多样性的生物信息学分析

[目的]骆驼免疫系统中只存在重链抗体,其可变区VHH片段是最小的天然抗体片段.通过对双峰驼VHH基因进行序列分析,了解双峰驼VHH基因特征,分析VHH文库多样性组成.[方法]采用新疆双峰驼VHH特异引物扩增全部抗体基因片段,连接到M13噬菌粒载体上,与pⅢ蛋白融合表达在噬菌体表面,构建噬菌体展示文库.基因测序和菌落PCR方法,分析文库大小和阳性克隆插入率.NCBI-IgGBLAST工具对抗体序列进行IMGT编号命名,WebLogo工具分析抗体保守序列分布频率,MEGA6软件对VHH序列进行同源性比对和系统进化树构建.[结果]利用免疫的新疆双峰驼淋巴细胞,构建了库容量为1.4 ×109的VHH抗体噬菌体展示文库.对91个随机挑选的文库TG1单菌落进行PCR.结果表明该文库VHH阳性插入率为97;,DNA测序表明文库多样性为97.8;.对91个克隆DNA测序结果进一步分析表明,这些基因中除2个为常规VH抗体外,其余均为重链VHH抗体.根据抗体序列中的特征氨基酸分布,将91个抗体序列划分为7个亚群.[结论]构建的新疆双峰驼VHH文库多样性较好,生物信息学分析揭示出文库中多样性克隆的分布和特征,有助于新疆双峰驼纳米抗体噬菌体展示文库的进一步构建.     

胰腺癌人源噬菌体单链抗体库的构建及初步筛选

提取胰腺癌患者的外周淋巴细胞总RNA,以RT-PCR技术分别扩增出人源抗体H链和L链的可变区基因,采用SOE-PCR法将VH和VL片段随机拼接成scFv片段,然后将scFv片段克隆至pCANTAB5E载体,并电转化至感受态TG1菌,经辅助噬菌体M13K07拯救,获得胰腺癌人源噬菌体单链抗体库。结果表明,从外周血淋巴细胞中获取可变区基因,利用噬菌体抗体库技术制备人源抗胰腺癌单链抗体的策略是可行的。     

抗恩诺沙星噬菌体单链抗体库的构建及鉴定

本研究以兽药恩诺沙星为对象,构建噬菌体抗体库,为低成本、快速制备目的抗体提供新的途径。以恩诺沙星-鸡卵清蛋白(ENR-OVA)为免疫原对Balb/c小鼠进行免疫,取其脾细胞提取总RNA,并分别扩增全套抗体轻、重链基因,通过重叠延伸PCR技术,以编码柔性多肽(Gly3Ser)4的基因为接头,将轻重链基因组装为完整的scFv基因,将之克隆入pCANTAB5E载体,转化大肠杆菌XL1-Blue,以辅助噬菌体M13KO7对其进行超感染,构建噬菌体抗体库并进行富集、筛选和鉴定;构建了库容量约为2.2×106的抗恩诺沙星噬菌体单链抗体库,并筛选出26株阳性克隆,为表达单链抗体、建立免疫检测方法奠定基础。     

天然鼠源噬菌体抗体库的构建及抗羊抑制素基因工程单抗的筛选

 【目的】构建单链抗体（ScFv）噬菌体表面展示文库,从中筛选抗羊抑制素单抗并进行表达,建立制备羊抑制素单抗的新方法。【方法】用未经免疫的多种小鼠脾细胞作为基因来源,采用噬菌体抗体库技术,构建天然噬菌体表面抗体文库。用羊抑制素对其进行3轮吸附-洗脱-富集,筛选抗羊抑制素单抗,用ELISA检测其抗原结合活性。【结果】构建了天然鼠源噬菌体抗体库,为筛选和制备各种单链抗体提供了一个平台。用羊抑制素对其进行筛选,制备抗羊抑制素单抗,经ELISA检测,55/96克隆具有与羊抑制素结合活性,阳性率为57%。【结论】制备的羊抑制素可溶性ScFv及其表面展示噬菌体抗体有很好的抗原结合活性,为羊抑制素单抗的制备提供了一种新的方法。     

口蹄疫病毒Asia Ⅰ/HeB株不同宿主适应毒及其多克隆抗体的鉴定

口蹄疫病毒接种乳鼠、豚鼠及BHK-21细胞,获得相应的适应毒。以各组织液中的口蹄疫病毒RNA为模板,反转录并扩增VP1基因,PCR产物琼脂糖凝胶电泳,回收目的片段,测序。测序结果与核酸数据库中口蹄疫病毒VP1基因比对,并将各适应毒扩增的VP1基因序列相互比对。结果表明:此毒为口蹄疫病毒,各适应毒间序列同源性达98%。并用口蹄疫病毒抗原进行SDS-PAGE,分别与大肠杆菌表达的口蹄疫病毒HeB株P1蛋白制备的多克隆兔抗及健康对照血清进行Western blot,对多克隆兔抗进行鉴定,并用间接ELISA测定此多克隆兔抗的效价。确定此多抗能中和FMDV结构蛋白,抗体效价>1∶800。     

Identification of Different Hosts-adapted FMDV Asia Ⅰ/HeB Strain and Its Polvclonal Antibodv

口蹄疫病毒接种乳鼠、豚鼠及BHK-21细胞,获得相应的适应毒.以各组织液中的口蹄疫病毒RNA为模板,反转录并扩增VP1基因,PCR产物琼脂糖凝胶电泳,回收目的片段,测序.测序结果与核酸数据库中口蹄疫病毒VP1基因比对,并将各适应毒扩增的VP1基因序列相互比对.结果表明:此毒为口蹄疫病毒,各适应毒间序列同源性达98％.并用口蹄疫病毒抗原进行SDSPAGE,分别与大肠杆菌表达的口蹄疫病毒HeB株P1蛋白制备的多克隆兔抗及健康对照血清进行Western blot,对多克隆兔抗进行鉴定,并用间接ELISA测定此多克隆兔抗的效价.确定此多抗能中和FMDV结构蛋白,抗体效价＞1∶800.     

抗人整合ανβ3单抗E10鼠/人嵌合Fab噬菌体抗体的构建和表达

为构建抗人整合素ανβ3单抗E10鼠/人嵌合Fab噬菌体抗体表达载体,并在噬菌体表面表达,采用PCR方法从整合素ανβ3单抗E10ScFv载体中,扩增重链可变区VH和轻链可变区VL基因。将VH基因与人重链恒定区CH1基因连接,VL基因与人CK基因连接,分别构建了鼠/人嵌合重链FD基因和轻链基因,将其克隆入pComb3,构建了鼠/人嵌合Fab噬菌体抗体表达载体,用辅助噬菌体VCSM13超感染,间接ELISA及竞争抑制ELISA检测鼠/人嵌合Fab噬菌体抗体活性。结果成功构建了鼠/人嵌合Fab噬菌体抗体表达载体,并在噬菌体表面展示了可结合人整合素ανβ3抗原的鼠/人嵌合Fab抗体。     

抗人整合素ανβ3单抗E10鼠/人嵌合Fab噬菌体抗体的构建和表达

为构建抗人整合素ανβ3单抗E10鼠/人嵌合Fab噬菌体抗体表达载体,并在噬菌体表面表达,采用PCR方法从整合素ανβ3单抗E10ScFv载体中,扩增重链可变区VH和轻链可变区VL基因.将VH基因与人重链恒定区CH1基因连接,VL基因与人CK基因连接,分别构建了鼠/人嵌合重链FD基因和轻链基因,将其克隆入pComb3,构建了鼠/人嵌合Fab噬菌体抗体表达载体,用辅助噬菌体VCSM13超感染,间接ELISA及竞争抑制ELISA检测鼠/人嵌合Fab噬菌体抗体活性.结果成功构建了鼠/人嵌合Fab噬菌体抗体表达载体,并在噬菌体表面展示了可结合人整合素ανβ3抗原的鼠/人嵌合Fab抗体.     

单域抗体T7噬菌体展示文库构建与鉴定

优化噬菌体展示文库构建策略,获得高品质羊驼源天然纳米抗体T7噬菌体展示文库,并对文库质量进行鉴定。分离羊驼外周血淋巴细胞,提取总RNA,RT-PCR扩增羊驼重链抗体可变区(VHH)基因,插入T7 select 415-1b噬菌体载体构建文库,计算文库的库容量,测定文库传代稳定性。测序分析VHH基因的多样性和纳米抗体氨基酸序列特征。Western-blot检测纳米抗体在噬菌体表面的表达情况,电镜观察文库中重组噬菌体颗粒形态。结果表明,构建羊驼源纳米抗体T7噬菌体展示文库,有效库容达到2.73×10⁹ PFU;纳米抗体与羊驼源抗体同源性高,氨基酸序列显示纳米抗体特征区域,并其在噬菌体表面高拷贝表达;重组噬菌体颗粒结构完整,但随着传代出现插入基因的丢失。     

黄海希瓦氏菌多克隆抗体部分特性的分析

采用免疫学方法,以仿刺参Apostichopus japonicus＂化皮病＂病原菌——黄海希瓦氏菌Shewanella marisflavi AP629福尔马林灭活疫苗作为免疫原,对新西兰大白兔进行免疫,制备了高效价的多克隆抗体。通过间接酶联免疫、间接免疫荧光和免疫印迹等技术对多克隆抗体的部分特性进行了分析。结果表明：获得的多克隆抗体的效价为1∶32768;多抗与黄海希瓦氏菌标准菌株存在很强的阳性反应,与弧菌和气单胞菌、链球菌和大肠杆菌交叉反应很弱或不存在交叉反应;多抗不仅与菌体本身反应,与菌株表面的分泌物也发生特异性结合。免疫印迹结果显示,多克隆抗体与黄海希瓦氏菌AP629结合的抗原决定簇主要蛋白带有6条,相对分子质量分别为131 000、128 000、113 000、62 000、38 000和33 000,其中38 000和33 000蛋白条带的抗原性最强;与胞外产物结合的抗原决定簇清楚的蛋白条带主要有3条,相对分子质量分别为62 000、38 000和33 000,其中62 000蛋白条带的信号最强。     

一种新的抗多环芳烃多克隆抗体的制备（英文）

为实现环境中多环芳烃(PAHs)污染物的快速检测,制备了抗多环芳烃多克隆抗体,用于多环芳烃免疫学检测试剂盒的研制。采用活性酯法将半抗原芘丁酸(1-PBA)分别于牛血清白蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA)进行偶联,获得PBA-BSA和PBA-OVA偶联物,以PBA-BSA偶联物免疫新西兰大白兔,获得针对多环芳烃的抗血清。以PBA-OVA偶联物为包被原,间接ELISA法检测抗血清,效价为102 400,经纯化后得到多克隆抗体。采用间接竞争ELISA法绘制了针对芘的标准曲线,得到该方法的IC50值为0.06 mg/L,检出限为0.01 mg/L。与16种多环芳烃的交叉反应实验结果表明该抗体对高环PAHs的亲和力较高。反应体系中添加低于40%的甲醇对ELISA结果无影响。该抗体的制备及特性鉴定对后续多环芳烃酶联免疫试剂盒的开发奠定了技术基础。     

氯霉素人工免疫原的合成与鉴定

将氯霉素(CAP)进行化学修饰引入羧基活性基团,合成具有半抗原结构特征的氯霉素半琥珀酸酯(CAP-HS);采用混合酸酐(MA)法将CAP-HS与牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶联合成人工免疫原BSA-CAP-HS和包被原OVA-CAP-HS,用红外(IR)、紫外(UV)、凝胶电泳(SDS-PAGE)进行鉴定;用BSA-CAP-HS免疫BALB/C小鼠,间接ELISA测定多抗(pAb)效价,阻断ELISA鉴定其敏感性,交叉反应试验鉴定其特异性。结果表明,CAP-HS与BSA合成成功,其分子结合比为15.6∶1,获得了高价、敏感、特异的CAP pAb,为CAP残留免疫学检测方法的建立奠定了基础。     

沙丁胺醇免疫原的合成与鉴定

将沙丁胺醇(SAL)经过琥珀酸单酯化后,采用混合酸酐法与载体蛋白偶联,用紫外扫描(UV)和变性凝胶电泳(SDS-PAGE)方法检验偶联效果,推算分子结合比;制备全抗原后免疫BALB/c小鼠,间接ELISA测定多抗血清效价,阻断ELISA鉴定其敏感性。UV和SDS-PAGE分析结果表明,成功制备了BSA-HS-SAL,SAL-HS与BSA的分子结合比为11∶1;ELISA结果表明,获得了高效价、敏感的SAL多克隆抗体,为SAL残留免疫学检测方法的建立奠定了基础。     

M13噬菌体衣壳蛋白的研究应用

M13噬菌体是一种丝状噬菌体,内有一个环状单链DNA分子,它由约2 800个PⅧ蛋白组成的圆柱形衣壳包围环状单链DNA分子,其中5个PⅦ和5个PⅪ蛋白在噬菌体的一端,另一端有5个PⅥ蛋白和5个PⅢ蛋白。这些衣壳蛋白参与着噬菌体的感染、组装等功能。文中对这5种衣壳蛋白在噬菌体展示技术的研究应用进行了综述。     

斜纹夜蛾核型多角体病毒基因ⅡORF13的克隆、表达与启动子活性分析

 【目的】研究新发现的斜纹夜蛾核型多角体病毒II株基因 ORF13的结构与功能。【方法】根据SpltMNPV II ORF13基因序列设计引物,经PCR扩增并克隆ORF13。在生物信息学分析基础上进行启动子活性分析和转录时相分析。构建ORF13片段的原核表达载体,表达并纯化融合蛋白后制备多克隆抗体。【结果】核苷酸序列分析表明,起始密码子上游-84bp处发现杆状病毒晚期启动子基序ATAAG,没有发现明显的早期启动子基序。启动子活性分析和转录时相分析证实,ORF13是一个早期和晚期都表达的基因,在病毒感染2 h就开始转录,18 h达到最高峰,24 h以后转录水平有所下降,但基本维持恒定。pET-28a-ORF13原核表达的融合蛋白经纯化后制备的多克隆抗体特异性高,效价可达1:3200以上。【结论】SpltMNPV II ORF13是一个早期和晚期都表达的病毒组成型结构蛋白基因。ORF13编码的蛋白可能是一种BV的膜蛋白,与细胞跨膜转运有关,制备的多克隆抗体可用于深入研究该蛋白的生物学特性与功能。     

应用重组MSG1蛋白检测猪附红细胞体抗体的ELISA检测方法的建立

 【目的】针对猪附红细胞体g1基因编码的MSG1表面粘附蛋白（rMSG1）和以此蛋白制备的多克隆抗体,建立相应的ELISA方法进行猪附红细胞体的临床检测,并进行效果评估,以获得一种猪附红细胞体感染的有效检测手段。【方法】将MSG1-pET28c_E.coli BL21菌株,在适宜的条件进行诱导表达,经菌体破碎、层析等步骤获取纯化的目的蛋白。以纯化的rMSG1制备免疫原接种小鼠,获取符合要求的多克隆抗体。以rMSG1和多克隆抗体建立ELISA检测方法,分析其敏感性、特异性、符合性和重复性。【结果】接种后获得了符合效价的抗血清;基于rMSG1的间接ELISA方法临床检测猪附红细胞体感染率为46.25%,其中阳性样本对已知小鼠抗血清有明显的阻断作用,并且与其它一些抗原无交叉反应;此ELISA方法的特异性和敏感性分别可达到97.06%和95.92%,较间接血凝试验(IHA)有更高的检出率。【结论】结果显示MSG1具有良好的抗原性,建立的ELISA方法具有较高的敏感性、特异性、符合性和可重复性,在临床检测中可以取得理想的效果。     

Random peptide libraries: a source of specific protein binding molecules

Libraries of random peptide sequences were constructed and screened to identify peptides that specifically bind to proteins. In one of these about 2 X 10(7) different 15-residue peptide sequences were expressed on the surface of the coliphage M13. Each phage encoded a single random sequence and expressed it as a fusion complex with pIII, a minor coat protein present at five molecules per phage. Phage encoding nine different streptavidin-binding peptide sequences were isolated from this library. The core consensus sequence was His-Pro-Gln and binding of these phage to streptavidin was inhibited by biotin. This type of library makes it possible to identify peptides that bind to proteins (or other macromolecules) that have no previously known affinity for peptides.     

大肠杆菌NrfA蛋白表达、纯化及多克隆抗体的制备(英文)

[目的]为克隆大肠杆菌NrfA基因,构建pET-28a(+)-NrfA表达载体,制备相应的多克隆抗体并鉴定。[方法]以以大肠杆菌基因组DNA为模板,PCR扩增得到NrfA基因编码区,构建pET-28a(+)-NrfA表达载体;经IPTG诱导表达并纯化重组蛋白;再免疫新西兰雄兔,制备多克隆抗体;用ELISA方法检测抗体的效价,WesternΒlotting检测抗体的特异性。[结果]适构建的表达载体pET-28a(+)-NrfA在大肠杆菌中诱导后可以高效表达NrfA蛋白,免疫获得的多克隆抗体用ELISA检测,其效价为1:204900,经WesternBlotting分析,抗体的特异性较好。[结论]成功克隆大肠杆菌的NrfA基因,构建了表达载体,制备的NrfA多克隆抗体具有较高的效价和良好的特异性。为研究细菌有关NrfA奠定了基础。     

大肠杆菌NrfA蛋白表达、纯化及多克隆抗体的制备

[目的]克隆大肠杆菌NrfA基因,构建pET-28a(+)-NrfA表达载体,制备相应的多克隆抗体并对其进行鉴定。[方法]以大肠杆菌基因组DNA为模板,PCR扩增得到NrfA基因编码区,构建pET-28a(+)-NrfA表达载体;经IPTG诱导表达并纯化重组蛋白;再免疫新西兰雄兔,制备多克隆抗体;用ELISA方法检测抗体的效价,Western Blotting检测抗体的特异性。[结果]构建的表达载体pET-28a(+)-NrfA在大肠杆菌中诱导后可高效表达NrfA蛋白;免疫获得的多克隆抗体用ELISA检测,其效价为1∶204 900;经Western Blotting分析,抗体的特异性较好。[结论]成功克隆大肠杆菌的NrfA基因,并构建了其表达载体,制备的NrfA多克隆抗体具有较高的效价和良好的特异性,为研究细菌有关NrfA奠定了基础。