利用酿酒酵母表达抗菌肽Lvcrunstin-B

根据凡纳滨对虾抗菌肽Lvcrustin-B的核酸序列,采用PAS(PCR-based Accurate Synthesis)的方法合成Lvcrustin-B基因,通过双酶切及T4连接酶技术将Lvcrustin-B插入表达载体p YE-GAPα,获得重组酵母表达载体p YEGAPα-Lvcrustin-B。p YE-GAPα-Lvcrustin-B经限制性内切酶AVr II线性化后,通过电穿孔法转化至毕赤酵母细胞GS115,并使用Zeocin进行抗性筛选,从而获得高拷贝转化子,筛选出的酵母菌转化子经扩大培养后使用YPD培养基进行诱导表达。PCR检测结果表明Lvcrustin-B基因被稳定整合至毕赤酵母染色体。SDS-PAGE电泳及WB实验显示,目的重组蛋白Lvcrustin-B可在毕赤酵母中表达,分子量大小为19.4 k D,且表达方式为可分泌性表达,重组菌最佳培养温度为30℃。     

利用酿酒酵母表达抗菌肽Lvcrunstin-B

根据凡纳滨对虾抗菌肽Lvcrustin-B的核酸序列,采用PAS(PCR-based Accurate Synthesis)的方法合成Lvcrustin-B基因,通过双酶切及T4连接酶技术将Lvcrustin-B插入表达载体p YE-GAPα,获得重组酵母表达载体p YEGAPα-Lvcrustin-B。p YE-GAPα-Lvcrustin-B经限制性内切酶AVr II线性化后,通过电穿孔法转化至毕赤酵母细胞GS115,并使用Zeocin进行抗性筛选,从而获得高拷贝转化子,筛选出的酵母菌转化子经扩大培养后使用YPD培养基进行诱导表达。PCR检测结果表明Lvcrustin-B基因被稳定整合至毕赤酵母染色体。SDS-PAGE电泳及WB实验显示,目的重组蛋白Lvcrustin-B可在毕赤酵母中表达,分子量大小为19.4 k D,且表达方式为可分泌性表达,重组菌最佳培养温度为30℃。     

phyA基因在毕赤酵母中的表达以及表达产物的检测

对获得的植酸酶基因PhyA进行TA克隆,获质粒pTA-phyA,酶切后,使其在连接体系中连接到酵母表达载体pPIC9K-InS片段上,随后将重组质粒转化给大肠杆菌,验证其成功后,再将重组质粒转化给毕赤酵母,诱导其表达,通过测定植酸酶活性,得出其表达量。     

大菱鲆抗菌肽基因酵母表达载体的构建及表达

将大菱鲆（Scophthalmus maxinus）hepcidin基因成熟肽序列经过部分改造后采用PCR方法克隆到毕赤酵母胞内表达载体pGAPZB中,构建了重组胞内表达载体pGAPZB—tbhep6his。用BlnI线性化重组质粒后,电击转化毕赤酵母SMD1168。经过Zeocin筛选和PCR扩增转化子基因组筛选,得到了数株基因工程酵母菌。通过SDS—PAGE和Western blot鉴定,发现目的蛋白与预期蛋白的分子量相吻合,并能与特异抗体antihis特异性结合,表明大菱鲆抗菌肽hepcidin基因在酵母菌中进行了表达。大菱鲆抗菌肽酵母表达载体的构建和表达为进一步研究该抗菌肽的功能并开发新型鱼类饵料奠定了理论基础。     

青麻epsps基因在酵母中表达

将青麻epsps基因构建到酵母胞内表达载体pPIC3.5K中,利用电转化法将构建好的表达载体转入巴斯德毕赤酵母中,PCR技术筛选出阳性转化子,证明外源epsps基因已经整合到巴斯德毕赤酵母的基因组上,经诱导表达后SDS-PAGE分析获知外源基因在酵母中获得了表达。并且通过草甘膦压力筛选出耐性较好的重组酵母菌株,证明所获得的epsps基因具有生物学功能。     

外源基因在原核生物和真核生物中的表达(英文)

[目的]研究外源基因在原核生物和真核生物中的表达。[方法]将带有目的基因的表达载体pTYB2-WF转化大肠杆菌ER2566,用IPTG诱导植酸酶基因表达。用SDS-PAGE验证植酸酶融合蛋白表达情况,并进一步对融合蛋白进行纯化。用毕赤酵母表达系统表达植酸酶基因phyA;构建酵母整合载体pPIC9K-phyA,转化毕赤酵母GS115,构建工程菌GS115-pPIC9K-phyA。[结果]在甲醇的诱导下表达植酸酶,经酶活力的测定,其植酸酶活力达7.3μ/ml,构建了毕赤酵母工程菌GS115-pPIC9K-phyA。[结论]甲醇酵母表达机制在分子生物学以及工业应用领域发挥作用。     

稻瘟病菌一假定几丁质酶在毕赤酵母中的表达

本研究从稻瘟病菌菌株Guy11中提取总RNA,利用RT-PCR方法扩增到一假定几丁质酶基因MGG_08054.6的cDNA序列,将其亚克隆至带有His-tag标签的酵母表达载体pPIC3.5K中,构成重组质粒pPIC3.5K-ws,电击转化至毕赤酵母菌菌株GS115,通过MD-MM平板筛选及PCR验证获得重组酵母转化子GS115-PICH-ws;阳性转化子在甲醇诱导下,成功分泌出重组蛋白.SDS-PAGE分析表明,重组蛋白分子质量为48 ku,与其理论计算值基本相符;Ni-NTA法分离纯化后的重组蛋白经DNS法测定具有几丁质酶活性.     

密码子优化的重组黄曲霉毒素解毒酶（rADTZ）在毕氏酵母中组成型分泌表达的研究

黄曲霉毒素解毒酶（ADTZ）来源于真菌Armillariellatabescens，它能够有效地分解黄曲霉毒素。为了使重组蛋白rADTZ能在毕氏酵母中高效分泌表达，根据毕氏酵母密码子的偏好性对rADTZ的5’末端的编码区域进行了优化，利用two-stepDNAsynthsis技术合成出ADTZ优化的基因序列OPT-ADTZ，并与组成型表达载体pGAPZaA连接，构建重组质粒pNOA，线性化pNOA后转化至毕氏酵母GS115中，实现了密码子优化的rADTZ组成型分泌表达。     

抗菌肽SMAP-29基因密码子优化及其在毕赤酵母中的表达

[目的]对抗菌肽SMAP-29的基因密码子进行优化,并使其在毕赤巴斯德酵母(Pichia pastoris)中表达。[方法]根据已知抗菌肽SMAP-29的氨基酸序列,参照毕赤巴斯德酵母密码子的偏好性,设计合成抗菌肽SMAP-29成熟肽基因片段,并同载体pPIC3.5K连接,电击转化至毕赤酵母受体菌GS115中,经G418筛选高拷贝转化子,并用MM、MD板和PCR法筛选Mut+表型。用甲醇诱导表达构建好的重组酵母表达基因工程菌,并裂解酵母细胞进行Tricine-SDS-PAGE分析。[结果]在诱导至第2天的细胞裂解液中检测到与预测的SMAP-29分子量相当,约为3.2 kD的表达带;表达产物对金黄色葡萄球菌和白色念珠菌有明显的抑菌作用,而对大肠杆菌抑菌效果不明显。[结论]该研究为SMAP-29在生物医学、农业等领域中的应用奠定基础。     

鸡α-干扰素在毕赤酵母中的表达及其表达条件优化

选择毕赤酵母表达系统,根据酵母密码子偏爱性合成Ch IFN-α成熟肽的基因序列,连接至载体p PIC9K中,构建重组质粒p PIC9K-α,将重组载体酶切线性后克隆至毕赤酵母GS115,筛选高拷贝转化子及其甲醇利用型,对其表达条件进行优化。结果表明:鸡α-干扰素在毕赤酵母中成功表达,在含2%酸水解酪蛋白,经0.5%甲醇在28℃诱导表达72 h后,重组蛋白表达量最多,抗病毒活性最高。     

利用SUMO融合系统高效表达可溶性重组蛋白的研究

利用pSUMO表达载体在大肠杆菌中高效可溶性表达若干种外源蛋白,如鼠源成纤维细胞生长因子(FGF)-21、人源FGF-21、人源白细胞介素(IL)-1β,并与pET-30a(+)及pTYB11表达系统作比较。将鼠源FGF-21、人源FGF-21及人源IL-1β基因分别亚克隆至pSUMO表达载体上,在大肠杆菌Rosetta(DE3)中诱导表达,并用镍离子螯合柱(Ni-NTA)纯化重组蛋白,透析后利用SUMO蛋白酶I切割融合蛋白,获得纯度较高的成熟蛋白。上述基因在pET-30a(+)及pTYB11中表达量极低,考马斯亮蓝染色几乎检测不到。在pSUMO表达体系中这些基因均以可溶形式表达,且可被SUMO蛋白酶I有效的切割,获得纯度较高的成熟蛋白。上述蛋白可在pSUMO表达系统中获得高效可溶性表达。     

TAT-Apoptin基因原核表达载体的构建及其表达鉴定

为得到TAT-Apoptin 融合蛋白,以pMD-19T-Apoptin 为模板PCR 扩增出TATApoptin 基因,构建重组载体pET-32a-TAT-Apoptin,并对TAT-Apoptin 蛋白进行表达。PCR 和测序表明,成功构建重组载体pET-32a-TAT-Apoptin,进一步对其进行蛋白表达,发现该蛋 白能与Apoptin 多抗发生特异性结合。以上结果证明,TAT-Apoptin 基因原核表达载体构建成 功,并能在Rosetta 中进行分泌性表达。