T-DNA插入产生的水稻小粒突变体遗传分析

[目的]研究水稻粒形突变体的遗传特性及其在水稻遗传改良中的作用。[方法]筛选水稻T-DNA插入纯合体,鉴定表型变异,通过表型突变的遗传分析及其与T-DNA插入共分离的检测,研究水稻表型突变的遗传特性。[结果]观察到1个粒形突变体T56。主要表现为粒长变短、粒宽变窄及千粒重降低;对该突变体进行遗传分析,分离群体出现野生型和突变体2种类型,其分离比符合3∶1,表明该突变体表型受1对隐性基因控制。突变体及其后代分离群体的Basta抗性检测和PCR分子检测结果表明,该突变体由T-DNA插入所引起,突变性状与T-DNA共分离。[结论]该材料可用于插入座位的基因克隆和水稻遗传改良的种质资源。     

水稻穂顶部颖花退化T-DNA插入突变体的分子鉴定及表型特征分析

水稻穗部是重要的农艺性状之一,穂顶部颖花退化会导致水稻产量大幅下降。本研究对水稻穗退化T-DNA突变体进行分子鉴定和表型分析,旨在进一步探明水稻穗发育的调控机制。我们从水稻突变体库POSTECH RISD(Rice T-DNA Insertion Sequence Database)中筛选到了3个T-DNA插入突变体,paa1、paa2和paa3。这些突变体中T-DNA分别插入到水稻穂顶部颖花退化候选基因LOC_Os04g56160的第1个内含子、第8个外显子和3′端非翻译区。分别在T-DNA插入位点两侧水稻基因组和T-DNA片段上共设计3条引物,利用PCR方法鉴定出paa1、paa2和paa3突变纯合体与杂合体。3个突变杂合体自交后代(T_3)植株表型与基因型共分离分析结果显示,paa1及paa2植株的穗顶部颖花退化表型与基因型相吻合,而paa3植株的颖花发育正常。paa2与PAA-Hwa(LOC_Os04g56160基因点突变体,表型为穗顶部颖花退化)杂交,F_1代植株表现为穂顶部颖花退化。农艺性状调查结果表明,paa1及paa2与对照品种相比在株高、穗长、单株有效分蘖数等所有农艺性状上存在显著差异,然而paa3仅在部分农艺性状上表现差异。以上结果表明paa1和paa2为穗顶部颖花退化T-DNA插入突变体,LOC_Os04g56160为水稻穗顶部颖花退化调控基因,该结果为水稻穗发育研究奠定了理论基础。     

T-DNA插入产生的水稻白化苗突变的遗传分析

在筛选和鉴定水稻T-DNA(含Basta抗性基因Bar)插入纯合体的过程中,观察到1个白化苗的突变体.对该突变体进行遗传分析表明,分离群体出现绿苗和白化苗2种类型,其分离比率为3:1,符合1对基因的显性遗传.Basta 抗性检测、PCR分子检测及Southern杂交证实,该突变体是由单一T-DNA插入所引起的,白化苗性状与T-DNA共分离.该突变材料可用于插入座位的基因克隆.     

批量筛选水稻T-DNA插入突变体库获得生殖发育相关突变体

针对花器官形态和种子发育突变表型对大型水稻T-DNA插入突变体库进行筛选,获得了大量突变体信息及材料,在9 760个突变体家系中筛选得到177个花器官形态和数量异常的突变家系,突变频率为1.81%;对9 760个家系中的3 432个家系筛选得到179个种子发育缺陷的突变家系,突变频率为5.22%。对所获得的270个突变家系进行了T-DNA插入的阳性检测,阳性率为64.8%。利用公共数据库RMD(Rice MutantDatabase,RMD)给定的侧翼序列,鉴定了其中1个结实率较低的突变体家系,表明其突变表型和T-DNA插入共分离,为深入研究该基因的功能提供了重要的遗传材料。     

抑制水稻WRKY10基因表达的分析

在水稻T-DNA插入突变体库中发现一个生长缓慢的突变体Osdg,其T-DNA插入位点侧翼序列编码一个WRKY类转录因子(OsWRKY10)。为了明确插入位点的基因是否为引起突变表型的基因,构建了抑制OsWRKY10基因表达的dsRNA干涉载体并转化水稻(Oryza sativa L.subsp.japonica,中花11),获得转基因植株(WInW)。T1代转基因植株的表型观测结果表明,部分WInW干涉植株出现生育期延长、株高下降、分蘖数减少、穗长缩短等表型,与突变体Osdg的突变表型相似,这说明,抑制OsWRKY10基因的表达可能延缓水稻的生长发育,该基因与引起Osdg突变表型的基因具有相似功能。     

拟南芥类锌指基因AT3G02790/AT5G16470纯合双突变的筛选及其表型分析

以拟南芥T-DNA插入突变体AT3G02790和AT5G16470为亲本,通过人工杂交技术获得杂合体后,结合基因分离定律和PCR技术筛选出拟南芥纯合双突变株,并对拟南芥纯合突变体的表型进行了初步分析,结果显示:突变体与野生型植株表型无明显差异,推测该基因为功能未知的新基因。     

一个显性矮秆水稻突变体的获得及其遗传分析

 【目的】分析该研究组已发现的一个显性矮秆水稻突变体的遗传组成及背景。【方法】利用农杆菌介导法转化粳稻品种武香粳9号,产生T-DNA插入群体。在筛选和鉴定水稻T-DNA插入突变体的过程中,发现一个矮秆突变体。利用PCR扩增、Southern杂交等分子生物学方法对该突变体后代进行鉴定及遗传分析。【结果】突变体自交后代群体中出现矮秆和正常株高两种类型,分离比为3﹕1,符合一对显性单基因的遗传,并且矮秆性状的表现与T-DNA插入共分离。利用籼稻品种龙特甫与其纯合矮秆植株进行杂交,杂交F2代的矮秆株与正常株的比例同样呈3:1分离,符合一对显性单基因的遗传规律。利用SSR等分子标记,将该基因定位在水稻的第4染色体上。【结论】该矮秆性状由一对显性基因控制,由T-DNA插入引起,位于水稻第4染色体上,可作为进一步分离该基因的遗传材料。     

拟南芥T-DNA插入株系SALK 037453叶发育突变位点的鉴定和分析

对来自Salk库的拟南芥T-DNA插入突变体SALK_037453的表型分析发现,该突变体株系因莲座叶叶柄较短而呈现聚集表型。遗传分析和PCR检测显示,SALK_037453突变体的表型与网站提供的T-DNA插入位点所在基因不连锁,应是由另外的未知插入位点的T-DNA引起的。为了寻找该位点,鉴定导致莲座叶聚集表型的基因,本研究利用TAIL-PCR的方法,鉴定出与突变表型连锁的T-DNA插入位点,位于基因At4G39400(AtBRI1)和At4G39403(AtPLS)之间。进一步利用qRT-PCR的方法检测,发现该位点由于T-DNA的插入,同时影响了AtBRI1和AtPLS的转录水平的表达。该研究为探索叶发育的过程提供了新的候选基因,并为进一步阐明AtBRI1和AtPLS的生物学功能提供了新材料。     

T-DNA (Ds) 插入产生的水稻卷叶突变的遗传分析

在筛选和鉴定水稻T-DNA（Ds）插入纯合体的过程中，观察到1个叶片卷曲的突变体．对该突变体进行遗传分析表明，分离群体出现叶片卷曲和叶片正常2种植株类型，其分离比率为3：1，符合1对基因的显性遗传．Basta抗性检测及PCR分子检测证实，该突变体是由单一T-DNA（Ds）插入所引起的，突变性状与T-DNA（Ds）共分离．该突变材料可用于插入座位的基因克隆．     

T—DNA诱发的小麦强分蘖突变体研究初报

利用农杆菌介导的小麦活体转化技术转化多个小麦品种,得到一定数量的小麦转化体植株。在小麦品种鲁麦21的遗传转化体T0代植株中发现一强分蘖突变体,通过PCR技术和Southern杂交技术证明该突变体含有T-DNA序列;该突变体表现为单基因隐性突变,在突变体T3代中均能通过PCR扩增到T-DNA内的序列,表明该突变体为T-DNA插入诱发的突变体。通过对该突变体初步分析表明突变基因与温度应答有关,随温度的降低,突变体分蘖速度加快。     

一个水稻短根毛突变体的鉴定和基因定位

 【目的】鉴定和克隆水稻根毛突变体新基因,了解水稻根毛发育的分子遗传机理。【方法】通过T-DNA插入获得短根毛突变体。采用溶液培养、形态特征观察、杂交后代的表型分离统计及基于图位克隆技术的基因定位等方法,对突变体Ossrh1的表型、遗传和基因精细定位开展研究。【结果】突变体在苗期表现为根毛长度变短,只有野生型长度的36%左右,遗传分析表明该突变性状受1对隐性基因控制,利用Ossrh1和籼稻品种Kasalath杂交构建的F2群体对OsSRH1进行基因定位, 发现与第6染色体上的SSR（simple sequence repeat）标记RM3183和RM193连锁,OsSRH1距它们的遗传距离分别为0.9 cM和1.0 cM。通过在两标记间发展3个新的STS（sequence-tagged site）标记,将OsSRH1精细定位于标记T1757和T1768之间,物理距离约为115 kb。【结论】水稻短根毛突变体Ossrh1的性状由1对隐性核基因控制,该基因位于第6染色体的STS标记T1757和T1768之间115 kb范围内。     

一个水稻散生突变体tag1的遗传分析及基因定位

株型对水稻产量有着重要影响。作为影响株型的重要因素之一,分蘖角度是水稻高产育种上考虑的重要农艺性状。散生突变体tag1(tiller angle 1)在水稻品种台北309转基因后代中被发现。与野生型相比,主要突变表型为分蘖角度和叶夹角显著增大,并伴随株高、穗长、结实率和枝梗数等性状上的变化。遗传分析表明,tag1的突变性状由一对隐性基因控制。利用F2(tag1/明恢63)群体作为定位群体,突变基因被定位在第11染色体长臂In Del标记AC35795和M7之间,遗传距离分别为0.38 c M和0.95 c M。在该区间内存在一个已被克隆的控制水稻分蘖角度的基因LAZY1。测序比对分析发现,突变体的TAG1存在一个119 bp的缺失,包括第4个外显子50 bp,第4个内含子69 bp,及二者间的剪切位点。因此TAG1是LAZY1的一个新的等位基因,重新命名为LAZY1-2。lazy1和tag1在突变表型上存在一定差异,这可能是LAZY1基因序列的突变位点不同造成的。     

水稻花器官数目异常突变体afon1的表型分析与基因定位

【目的】研究水稻花器官数目异常突变体afon1(abnormal floral organ number1)的分子机理,鉴定出控制水稻花器官数目变化的基因。【方法】利用甲基磺酸乙酯(EMS)诱变籼稻品种浙农34获得一个花器官数目异常突变体作为试验材料,命名为afon1。开花期随机取突变体afon1和野生型浙农34的稻穗各5个,利用组织学和扫描电子显微镜等技术研究afon1的花器官表型、细胞学特征和花粉育性。成熟期随机取突变体afon1和野生型浙农34植株各10株,测定株高、分蘖数、穗长、每穗颖花数、每穗实粒数和千粒重等农艺性状。随机取突变体afon1和野生型饱满种子各100粒,测定发芽势和发芽率。以突变体afon1为母本,分别与野生型浙农34和粳稻品种浙农大104杂交构建2个F2群体进行遗传分析和基因定位,筛选候选基因进行DNA测序比对,构建AFON1蛋白质的空间模型并对其结构进行分析,同时对候选基因以及与花器官数目相关的基因进行实时荧光定量PCR分析。【结果】与野生型相比,突变体afon1中59.64%小穗的花器官数目发生异常,其中多数小穗仅在内稃一侧产生一个颖壳状的器官,部分小穗表现2—4轮花器官数目同时增加;株高和千粒重显著增加,而结实率显著降低。遗传分析表明,突变体afon1与野生型浙农34杂交的F1植株小穗花器官数目表现正常,F2群体中小穗花器官数目正常植株与花器官数目异常植株的分离比符合3﹕1,表明突变体afon1性状受一对隐性核基因控制,基因位于水稻第1染色体长臂端In Del标记1M5和1M18之间,物理距离为73 kb,该区间内共有6个注释基因。突变体afon1和野生型的测序比对发现,突变体afon1中的基因LOC_Os01g67430外显子中第565个碱基T突变成A,导致第189个氨基酸由色氨酸突变为精氨酸。蛋白质序列和空间结构分析表明,AFON1蛋白质序列中含有一个Lipase_3结构域,结构域内的突变导致蛋白质的空间结构发生了明显的变化。实时荧光定量PCR结果显示,LOC_Os01g67430在突变体afon1幼穗中的表达量要显著高于野生型,而在根、茎和叶中则无显著差异;穗发育早期FON1和FON2/4等调控花器官数目的基因在突变体afon1花器官中的表达量显著增加。【结论】LOC_Os01g67430为突变基因afon1,该基因通过影响花器官数目相关基因的表达而调控各轮花器官数目。     

T-DNA插入产生的水稻小粒突变体的遗传分析(英文)

[Objective] The aim of this study is to understand the genetic characteristics of a grain shape mutant and its possible role in genetic improvement of grain yield in rice. [Method] On the basis of the collection of T-DNA tag lines, the progeny of homozygous plants carrying T-DNA insertion were screened for mutants with mutated phenotypes. The genetic analysis of the mutant and test for the linkage between the mutated phenotype and the T-DNA insertion were carried out to determine its genetic characteristics. [Result] In the present study, a grain shape mutant induced by T-DNA insertion in rice was identified, which showed small grain. Genetic analysis of the mutant showed that the two types of phenotype, normal and small grain in the segregating populations derived from the T-DNA heterozygotes, fit the ratio of 3∶1. Test for Basta resistance showed that all the mutants were resistant while the normal plants segregated for resistant and susceptible by the ratio of 2∶1. The results indicated that the mutant phenotype cosegregated with Bar gene. The small grain mutant caused by T-DNA insertion was confirmed by PCR amplification aiming at T-DNA. [Conclusion] The grain shape mutant is useful for isolation of the tagged gene and genetic improvement in rice.     

一个水稻早衰突变体基因的精细定位

【目的】对水稻叶片早衰突变体W330进行遗传分析及精细定位,获得控制突变表型的基因。【方法】用60Co-γ辐射诱变籼型水稻恢复系中恢8015,从突变体库获得一份叶片早衰突变体W330。对该突变体进行表型观察和主要农艺性状调查。利用多代自交稳定的突变体W330与粳稻品种02428杂交,观察F1和 F2的表型,并统计F2群体中早衰突变表型与正常野生型的分离情况,分析该突变表型的遗传行为。利用构建的F2群体进行精细定位和候选基因分析,然后对候选基因进行DNA测序、酶切分析、表达分析、酶活测定及进化分析。【结果】突变体W330从三叶期开始出现叶片衰老,直至抽穗期及黄熟期。与野生型相比,突变体W330株高变矮、分蘖减少、叶片变窄、抽穗期不变、每株有效穗数、每穗着粒数和结实率亦显著降低。W330与02418杂交的F1表现正常,F2群体中正常植株与早衰突变植株的分离比符合3﹕1,表明突变体W330的突变性状受1对隐性核基因控制。利用F2定位群体及SSR、Indel标记,最终将目标基因定位在第3染色体短臂上2个分子标记CD-5与CD-7之间,物理距离约为21.5 kb。基因预测表明该区域共有4个完整的ORFs。其中,LOC_Os03g0131200编码一个过氧化氢酶OsCATC,基因组序列分析表明,W330突变体中的该基因从ATG开始第109位,在第一个内含子的末位发生了一个C到G的颠换,造成第一个内含子没有剪切,最终导致翻译提前终止,酶切试验验证了这一突变位点。与野生型亲本中恢8015相比,W330突变体在三叶期叶片中的过氧化氢酶的活力下降了47.8%,而过氧化氢含量上升了2.7倍。由此,推定W330与OsCATC等位。系统进化分析发现,OsCATC与水稻中同源的过氧化氢酶不在同一进化分支上。实时荧光定量PCR发现,与其野生型相比,突变体W330叶片中的OsCATA和OsCATB的表达量显著上升,而OsCATC的表达量没有明显的变化。推测,这3个高度同源的基因在水稻体内可能存在互补机制。【结论】W330突变体基因是已报道的过氧化氢酶基因OsCATC的等位基因。W330突变体在第一个内含子上发生的一个点突变造成可变剪切的发生,使得水稻一个过氧化氢酶失活,导致突变体W330突变表型的出现。     

粳稻中花11 T-DNA插入突变体的分离和鉴定

通过农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法,对中花11成熟胚愈伤组织进行T-DNA转化,构建了含1489个独立的再生转化株系的突变体库,不仅为水稻功能基因组提供了一个有效的研究平台,还创造了一些具有优良农艺性状的突变材料,为水稻育种提供新的基因资源。插入第1代单本移栽且单本收获,第2代播种1066个家系,在水稻各个生育阶段从中独立筛选得到各类外形突变体66个。经过第三代重复筛选获得包括茎、叶、花和穗变异等各类突变52份。结果表明,外观性状的突变频率为3.4%。     

水稻长护颖突变体基因的克隆与表达分析

【目的】利用EMS对水稻（Oryza sativa L.）保持系品种宜香1B进行诱变,筛选出3份长护颖突变体。通过基因定位和克隆,探明控制该性状的遗传基础以及分子机理,并在不同器官进行表达分析,了解该基因表达特点。【方法】以3份水稻长护颖突变体Oslg-1、Oslg-2和Oslg-3为材料,进行表型分析、等位性鉴定、基因定位、生物信息学分析,以及qRT-PCR定量表达分析。【结果】Oslg-1突变体小穗在幼穗发育早期与野生型无明显差异,但在成熟期其护颖的远轴表皮细胞凸起且粗糙,形成的结节轴向对齐排列,且毛状物较多,形成垂直相间的横纵沟,与外稃表皮细胞结构相似。遗传分析表明,该类突变表型受1对隐性基因控制,OsLG定位于第7染色体短臂SSR标记RM5344和RM20934之间,遗传距离分别为1.11和0.82 cM,物理距离为246.3 kb。对该区域候选基因分析和测序,发现LOC_Os07g04670基因在编码区第182位碱基（T→A）改变,导致其编码氨基酸第61位（Leu→His）的改变。等位性分析表明,Oslg-2、Oslg-3与Oslg-1属等位变异,进而对突变体Oslg-2和Oslg-3的OsLG测序,突变分别发生在第316位（T→A）和119位（T→C）碱基,导致其编码的氨基酸第106位（Trp→Arg）和第40位（Leu→Pro）突变。对该基因进行同源进化分析和序列比对,表明该基因可能调控水稻护颖伸长。对本突变材料的候选基因和另一控制护颖性状的PAP2进行实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析,结果表明,OsLG在水稻的叶片、穗、叶鞘和根中均有表达,且在穗部表达最高,而PAP2在除穗部以外的其他部位几乎不表达,表明2个控制护颖性状的基因均具有组织特异性,且PAP2的特异性更强;在长护颖突变体中,2个基因表达量均下调,表明其具有协同表达特点。【结论】3份水稻长护颖突变体OsLG与已报道的G1为同一基因,其功能结构域内氨基酸的突变导致长护颖发育;OsLG和PAP2在穗部具有协同表达的特点。     

水稻果胶甲基转移酶OsTSD2基因突变体的分析

探讨水稻果胶甲基转移酶OsTSD2基因的功能,尤其是对生长发育的影响,筛选并鉴定了OsTSD2基因突变的3个突变体tsd2a、tsd2b和tsd2c。表型观察显示:突变体水稻结实率下降、种子粒长变短、粒宽变窄、千粒重下降;突变体的颖壳颜色变暗,颖壳的破裂程度加重并出现新的背部破裂;荧光免疫标记试验研究发现,突变体种子萌发率下降可能是由于突变体种子盾片中的甲基化果胶含量低所致。结果表明,OsTSD2基因的下调导致水稻的种子在发育和萌发过程中存在明显的缺陷。