中华绒螯蟹过氧化物还原酶基因克隆及其在鳗弧菌感染下的表达分析

【目的】克隆中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）过氧化物还原酶基因（EsPrx）的开放阅读框（ORF）,并分析EsPrx基因的组织表达特征及细菌感染下的表达情况,为中华绒螯蟹的先天免疫和抗病机制研究提供参考依据。【方法】通过RT-PCR结合转录组序列比对克隆出EsPrx基因,利用DNAStar、ClustalW、ExPASy、TMHMM Server v.2.0、SignalP 5.0及NetPhos 3.1 Server等在线软件进行生物信息学分析,并以实时荧光定量PCR检测EsPrx基因的组织表达特征及鳗弧菌（Vibrio anguillarum）感染下的表达情况。【结果】EsPrx基因ORF为597 bp,共编码198个氨基酸残基,含有Prx特有的2个结构域（FYPLDFTFVCPTEI和GEVCPA）。EsPrx蛋白分子式为C₉₉₄H₁₅₄₄N₂₅₈O₂₉₃S₈,分子量为22.05 kD,理论等电点（pI）为5.67,无跨膜域和信号肽,属于非分泌性蛋白。EsPrx氨基酸序列与扁额青蟹（Eurypanopeus depressus）、拟穴青蟹（Scylla paramamosain）和三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）的Prx氨基酸序列高度同源,对应的相似性分别89%、89%和88%;基于Prx氨基酸序列相似性构建的系统发育进化树也显示,EsPrx氨基酸序列先与拟穴青蟹、扁额青蟹及南美白对虾（Penaeus vannamei）的Prx氨基酸序列聚在一起,再与其他动物的2-Cys Prx氨基酸序列聚类,证实EsPrx基因属于未分化的Prx基因,即Prx1/2基因。EsPrx基因在中华绒螯蟹各组织中广泛表达,以肝胰腺的相对表达量最高,极显著高于在其他组织中的相对表达量（P<0.01）;EsPrx基因表达在鳗弧菌感染不同时间段存在明显差异,感染6~24 h其相对表达量显著升高（P<0.05）,而后迅速降至正常水平。【结论】EsPrx基因为甲壳动物未分化的Prx1/2基因,在中华绒螯蟹肝胰腺中高表达,并参与鳗弧菌感染的抗氧化应激反应,即在抗逆过程中发挥重要作用。     

2个柽柳Prx基因的克隆及表达分析

过氧化还原蛋白（Prxs）是植物体内重要的抗氧化酶。为深入研究Prx基因在柽柳非生物胁迫中的作用,从柽柳cDNA文库中获得了2条Prx的单一序列ThPrx1与ThPrx2,其中ThPrx1为部分序列,ThPrx2为全长序列。生物信息学分析表明,2条ThPrx与植物Prx同源基因的氨基酸序列具有较高的同源性,并且ThPrx1和ThPrx2分别属于Prx的PrxⅡ和2-Cys Prxs亚家族。通过实时定量PCR对这2个ThPrx基因在不同非生物胁迫（NaCl、PEG、CdCl2、低温及ABA）处理的柽柳根和叶中的表达模式分析显示, 2个ThPrx基因在胁迫下的表达模式不同:NaCl、PEG和ABA均能够诱导ThPrx1基因在根中的表达,而CdCl2和低温胁迫则抑制了该基因在根和叶中的表达;ThPrx2基因在低温处理的柽柳中的表达量下降,其他胁迫处理不同程度上影响了ThPrx2基因的表达。结果表明,ThPrx1与ThPrx2是2个新的Prx基因,推测其可能参与植物的逆境胁迫过程。      

过氧化物酶V基因沉默HepG2肝癌细胞系的构建及鉴定

过氧化物酶V(Peroxiredoxin V,Prx V)是过氧化物酶家族(Peroxiredoxins)中的一员,具有清除细胞内活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)从而抑制由于氧化应激导致的细胞凋亡的作用。该研究通过慢病毒载体构建Prx V基因沉默的HepG2肝癌稳定细胞系。采用荧光照相及蛋白免疫印迹法对其结果进行鉴定,为研究Prx V的功能提供良好的基础。结果表明:成功构建Prx V基因沉默的HepG2肝癌细胞系。     

不结球白菜过氧化还原蛋白基因Brc2-Cys Prx的克隆和表达分析

[目的]双半胱氨酸型硫氧还蛋白过氧化物酶Brc2-Cys Prx是过氧化还原蛋白Peroxiredoxins(Prxs)的亚家族。Prxs是植物抗氧化酶防御系统的成员,对清除植物体内活性氧具有重要作用。本文旨在克隆和研究Brc2-Cys Prx基因在不结球白菜处于不同胁迫条件下的表达模式。[方法]以不结球白菜霜霉病抗病自交系‘苏州青’和霜霉病感病自交系‘矮脚黄’为试验材料,利用RACE技术克隆得到不结球白菜Brc2-Cys Prx基因。利用生物信息学方法对该基因进行信息学分析。采用qRT-PCR技术对不结球白菜叶片Brc2-Cys Prx基因在霜霉病菌侵染及NaCl、CdCl_2、PEG6000和ABA等非生物胁迫处理条件下的表达模式进行研究。[结果]Brc2-Cys Prx基因的c DNA全长为999 bp,其中开放阅读框长度为810 bp,共编码270个氨基酸。该蛋白不存在信号肽序列,预测相对分子质量为28.15×10~3,理论等电点为5.87。不结球白菜Brc2-Cys Prx蛋白的二级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲构成。该蛋白含有1个PRX_Typ2cys结构域,属于硫氧还蛋白超家族。系统进化分析表明:不结球白菜Brc2-Cys Prx蛋白与同属植物的进化关系相近,其中与大白菜和甘蓝型油菜进化关系最近。霜霉病菌侵染条件下,Brc2-Cys Prx基因表达呈逐渐上调趋势,在‘矮脚黄’中的表达与‘苏州青’相比上调迟钝,且该基因在‘矮脚黄’中的表达量一直低于‘苏州青’。0.2 mol·L~(-1)NaCl和200 g·L~(-1)PEG6000处理抑制Brc2-Cys Prx基因的表达;150μmol·L~(-1)CdCl_2处理促进Brc2-Cys Prx基因的表达,在24 h达到最大值;100μmol·L~(-1)ABA处理后,Brc2-Cys Prx基因表达上调,而12 h后,表达受抑制。[结论]霜霉病菌侵染条件下,Brc2-Cys Prx在抗性系‘苏州青’和感病系‘矮脚黄’中的表达存在差异,并且在抗病系中的表达量较高,推测Brc2-Cys Prx基因的高转录水平是抗病品种较之感病品种对霜霉病菌侵染具有更高抗性的原因之一。在非生物胁迫条件下,Brc2-Cys Prx基因具有不同的应答模式,推测可能是涉及到不同的物质或信号途径的原因。     

克氏原螯虾酚氧化酶原mRNA组织分布特性研究

酚氧化酶原系统是甲壳动物体内与免疫相关的重要功能系统之一,对于甲壳动物的防御反应具有重要作用。本研究针对克氏原螯虾酚氧化酶原基因保守序列设计引物,利用实时荧光定量PCR法对克氏原螯虾酚氧化酶原mRNA的组织分布进行了初步研究。结果表明,克氏原螯虾酚氧化酶原基因在血淋巴、肝胰腺、卵巢和精巢中转录水平较高;在肌肉、表皮和鳃中有较弱表达;而在肠和胃中几乎无表达。此种组织表达特性可能与酚氧化酶原基因在机体生命活动过程中的功能有关。     

沉默Prx Ⅱ基因促进5-FU诱导HepG2细胞凋亡研究

旨在探究PrxⅡ对5-FU诱导HepG2(人肝癌细胞系)细胞凋亡的影响,阐明沉默PrxⅡ基因提高5-FU促进HepG2发生细胞凋亡的作用。利用慢病毒介导的shRNA干扰技术建立PrxⅡ基因沉默的HepG2细胞系、MTT法检测细胞存活率、荧光显微照相测定凋亡情况、蛋白质免疫印迹检测凋亡相关蛋白表达水平。结果表明PrxⅡ基因沉默的HepG2细胞系构建成功;MTT检测发现在1mmol·L-15-FU处理下,shPrxⅡ组细胞存活率明显低于Scramble组;荧光显微照相结果表明shPrxⅡ组细胞凋亡率明显高Scramble组;蛋白质免疫印迹结果表明PrxⅡ基因沉默的HepG2细胞中凋亡标志物PARP、促凋亡蛋白Bad的表达水平明显升高,抗凋亡蛋白Bcl-xL表达水平明显下降。研究表明,沉默PrxⅡ基因能提高HepG2对5-FU促凋亡作用的敏感性,导致HepG2细胞凋亡水平上升,研究结果可为提高肝癌细胞对于5-FU的敏感性提供新的潜在靶目标。     

过氧化物还原酶Ⅱ在热损伤诱导HaCaT细胞凋亡中的保护作用

探究过氧化物还原酶Ⅱ(PeroxiredoxinⅡ,PrxⅡ)在热损伤诱导皮肤角质细胞HaCaT细胞凋亡中的调控作用。利用慢病毒转染技术构建Prx Ⅱ基因敲降细胞系,采用MTT法检测细胞存活率,荧光显微镜照相技术检测细胞凋亡情况及活性氧水平,蛋白质免疫印迹法检测蛋白质表达水平,并对比分析基因敲降细胞和正常细胞的各项指标差异。结果显示,热损伤处理的PrxⅡ基因敲降细胞的凋亡率及活性氧水平均明显高于热损伤处理的正常细胞,凋亡相关蛋白质表达水平均有显著性差异。证明PrxⅡ可利用清除活性氧的功能来调节Bcl-2的表达、caspase-3的活化从而有效缓解热损伤HaCaT细胞的凋亡。     

嗜水气单胞菌ZN1株Mah-TrxA融合蛋白的粘附功能分析

为深入探讨嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,Ah)主要粘附素在菌体侵入宿主和介导宿主产生免疫过程可能扮演的角色,对Ah菌ZN1株主要粘附素重组基因的表达产物的部分生物学功能进行分析。通过酶联免疫吸附试验、细胞与Ah菌的粘附试验及粘附抑制和阻断试验,研究分析克隆表达的Mah-TrxA(硫氧还蛋白与主要粘附素形成的融合蛋白)生物学功能。结果显示:克隆表达的Mah-TrxA融合蛋白具有良好的抗原性和免疫原性,对不同Ah菌株有交叉粘附抑制的作用,抗原竞争性抑制试验和抗体阻断试验均能显著减少不同Ah菌株对EPC的粘附作用。因此,克隆表达的Mah-TrxA确为ZN1菌株的主要粘附素;基因工程技术以融合蛋白形式表达的Mah-TrxA与野生菌株ZN1表达的主要粘附素具有类似的生物学活性。     

柽柳硫氧还蛋白过氧化物酶(ThPrx1)基因转入酵母的抗逆能力分析

从柽柳(Tamarix hispida)中克隆到了一个硫氧还蛋白过氧化物酶(Peroxiredoxin,Prx)家族基因(ThPrx1).为了研究ThPrxl的抗逆功能,将ThPrx1基因构建到酵母表达载体pYES2中,转化到酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中,获得重组酵母,并用转空pYES...     

表达序列标签研究进展及其在甲壳动物中的应用概况

随着生物信息学的发展,表达序列标签(EST)在分子标记开发、新基因分离鉴定、基因表达谱分析、基因组功能注释、基因电子克隆等方面具有重要作用。简要介绍了EST分析的原理及其在基因识别、基因预测、物理图谱的构建、DNA芯片制备等方面的应用概况。综述了甲壳动物EST的研究现状,并对EST的应用前景进行了展望。     

Tropomyosin基因在克氏原螯虾(Procambarus clarkii)卵巢发育过程中的表达

原肌球蛋白Tropomyosin是虾蟹类的主要致敏物质,除此以外在其他方面功能的研究非常少。本研究克隆了克氏原螯虾Tropomyosin基因,进行了同源序列比对,并分析了Tropomyosin基因在克氏原螯虾卵巢发育过程中的转录水平表达模式。研究结果显示,Tropomyosin蛋白序列高度保守,在虾蟹类甲壳动物中,8个抗原决定簇序列几乎完全一致。本研究克隆的基因存在3个核苷酸位置(c61—t,g118—a,c359—t)的变化,但是均不处于抗原决定簇内,免疫原性不受影响。Tropomyosin基因mR NA在克氏原螯虾卵巢组织中表达量很低,但是随着卵巢的发育存在表达差异,即呈现一个先提高再降低的峰型特征。本研究暗示Tropomyosin除过敏原特性外,可能也受性腺发育的部分调控影响。     

Prx Ⅱ缺失的真皮间充质干细胞提前衰老加速皮肤老化进程研究

通过比较野生型和Prx II(Peroxiredoxin II)基因敲除型小鼠皮肤老化情况,阐明皮肤老化过程中Prx II对真皮间充质干细胞的保护作用。体内试验采用病理组织切片,蛋白免疫印迹等方法检测两种129/SvJ小鼠皮肤组织及生理功能的差异;体外试验采用SA-β-gal染色对比两种真皮间充质干细胞衰老情况。结果表明同月龄的Prx II基因敲除型小鼠与野生型小鼠相比真皮厚度层变薄,伤口愈合速度减慢,皮肤组织中P16、p21表达水平增加,PCNA表达水平降低;同代数的Prx II基因敲除型的真皮间充质干细胞与野生型相比衰老细胞数量明显增多。综合分析,Prx II基因敲除小鼠皮肤细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子表达上升,皮肤发生提前老化,与真皮间充质干细胞的细胞衰老存在相关性,为通过Prx II延缓皮肤老化,减少因皮肤老化而引发的多种疾病提供基础理论。     

Prx Ⅱ基因敲降L02细胞系的构建及其对细胞增殖的影响

构建PrxⅡ基因敲降L02细胞系并确定PrxⅡ基因对L02细胞增殖的影响。利用慢病毒介导的shRNA干扰技术、流式细胞术、荧光显微照相、蛋白质免疫印迹、MTT asssay等方法建立并检验PrxⅡ敲降L02细胞系及其对L02细胞的增殖影响。结果显示:选用5’-CCGCTTGTCTGAGGATACGTT-3’片段作为干扰PrxⅡ基因片段,利用慢病毒敲降L02细胞。同时处理嘌呤霉素筛选得到shPrxⅡ组细胞和Scramble组细胞,使用流式细胞术、荧光显微照相技术对shPrxⅡ组细胞和Scramble组细胞进行检测,结果均显示出GFP蛋白表达;此后利用蛋白质免疫印迹法检测出shPrxⅡ组细胞中PrxⅡ蛋白表达水平较Blank、Scram-ble组显著降低(P0.05),Blank组与Scramble组细胞中PrxⅡ蛋白表达水平无明显差异。在MTT结果中显示shPrxⅡ组细胞增殖速率明显高于Scramble组,且具有统计学意义。成功构建PrxⅡ敲降的L02细胞系,发现PrxⅡ敲降后显著提高L02细胞的增殖速率。     

原花青素的生物学功能及开发利用前景

原花青素属于生物类黄酮家族,具有抗氧化、预防心血管疾病和癌症等多种生物学功能.综述了原花青素的抗紫外线损伤、抗氧化和清除自由基、抗病驱虫、抗癌、调节免疫功能、降血糖血脂、抗炎、抗疲劳等生物学功能,及其保健功能和应用,并对其在饲料工业中的应用进行了阐述.     

植物基因功能验证技术概述

随着生物学研究在分子水平上的不断深入和推进,越来越多的基因得以发现并成功克隆,对基因功能的研究显得日益重要,这也是后基因组时代功能基因组学的重要研究内容。植物中存在的众多基因发挥着不同的作用,控制着不同的合成途径,基因各自发挥的功能对植物起着至关重要的作用。总结了有关基因功能验证技术方面的研究,并将常用于验证基因功能的方法做一归纳,以便为后续的试验研究提供生物学基础。     

我国水稻产量相关功能基因研究获重大进展

中科院上海生科院植物生理生态研究所、植物分子遗传国家重点实验室研究员林鸿宣领导的研究组,在水稻产量相关功能基因研究方面又取得突破性进展,成功克隆了控制水稻粒重的数量性状基因GW2,并深入阐明了该基因的生物学功能和作用机理,显示该基因在高产分子育种中具有应用前景。相关论文已于4月8日在线发表于国际顶级遗传学杂志《自然-遗传学》(Nature Genetics)。这是该研究组继克隆水稻耐盐功能基因SKC1之后两年内第二次问鼎该杂志。     

植物GAST家族基因功能研究进展

GAST是一类受赤霉素诱导的基因家族,编码一种小分子多肽,其N端包含信号肽,其C端包含12个保守的半胱氨酸。目前,GAST家族成员已在多个植物中鉴定并进行了相关功能研究,发现其参与细胞伸长和分裂、茎伸长、种子萌发、根发育以及抗氧化等多个生理过程。对植物中已发现GAST基因的表达模式、蛋白的分子结构和细胞定位以及基因的生物学功能进行了概述,以期更清晰地了解该类小分子多肽编码基因在植物生长发育中的作用。     

植物蔗糖合成酶的研究现状

蔗糖合成酶(SuSy)是植物蔗糖代谢的关键酶,在植物生长发育过程中起重要作用。本文综述了SuSy的生物学功能、家族基因的克隆和表达调控机理以及SuSy的转基因植株的表现,进一步对SuSy的研究做出设想。     

猪链球菌二氢硫辛酰胺脱氢酶的原核表达及其粘附相关功能初探

目的:克隆、表达猪链球菌2型菌株ZY05719的膜蛋白二氢硫辛酰胺脱氢酶基因(hm6),分析其重组蛋白的生物学活性。方法:基于GenBank中S.suis P1/7SSU1634蛋白的基因序列设计引物,克隆ZY05719株的二氢硫辛酰胺脱氢酶基因并进行序列分析;构建pET28a-hm6原核表达质粒,在大肠杆菌BL21中诱导表达,重组HM6蛋白即二氢硫辛酰胺脱氢酶用His亲和层析镍柱纯化后,通过SDS蛋白电泳鉴定分析并利用新西兰大白兔制备抗血清,研究其酶活性及其在介导猪链球菌粘附HEp-2细胞中的作用。结果:克隆了1 761bp的二氢硫辛酰胺脱氢酶基因,纯化的70kD重组融合蛋白具有良好的酶活性和免疫原性,且在介导猪链球菌粘附HEp-2细胞中具有作用。结论:成功克隆、表达了ZY05719株的二氢硫辛酰胺脱氢酶基因,初步揭示了其生物学活性,为深入研究二氢硫辛酰胺脱氢酶在猪链球菌致病机制中的作用奠定了基础。     

水稻丙酮酸脱氢酶激酶1多克隆抗体的制备

水稻丙酮酸脱氢酶激酶1(PDK1)基因位于水稻基因组的第7条染色体上,其cDNA全长为1 498 bp,编码有363个氨基酸残基的多肽链,主要在叶片中表达。为进一步研究该基因编码蛋白的生物学功能及其分子作用机制,本研究构建水稻PDK1的原核表达载体,重组质粒转化大肠杆菌诱导表达,得到分子量大概在41 ku的重组蛋白,经纯化后免疫新西兰大白兔成功制备水稻PDK1多克隆抗体。