毒死蜱和百菌清对斑马鱼早期发育阶段的联合毒性效应

为评价毒死蜱和百菌清的单剂毒性和联合毒性,以斑马鱼为受试生物,采用静态法和实时荧光定量PCR方法,研究毒死蜱和百菌清单剂,以及二元组合时对斑马鱼胚胎的急性毒性和对斑马鱼幼鱼性腺轴相关基因的影响。结果显示,毒死蜱和百菌清对斑马鱼胚胎分别表现为中等和高等毒性,96 h-LC₅₀(半致死浓度)分别为2.139 mg·L^-1和0.353 mg·L^-1。毒死蜱和百菌清联合作用类型为协同作用,联合暴露时,对斑马鱼胚胎的96 h-LC₅₀分别为0.38 mg·L^-1和 0.063 mg·L^-1。中浓度(26.7 μg·L^-1)和高浓度(106.7 μg·L^-1)的毒死蜱可以诱导斑马鱼幼鱼体内芳香化酶基因(CYP19α)、卵黄蛋白原基因(VTG1、VTG2)和雌激素受体基因(ERα、ERβ1、ERβ2)不同程度的上调表达;低浓度(1.1 μg·L^-1)百菌清诱导斑马鱼体内VTG1、VTG2、ERβ1和ERβ2基因的上调表达;低浓度(6.7 μg·L^-1毒死蜱+1.1 μg·L^-1百菌清)二元组合会引起斑马鱼体内VTG1、ERβ1、ERβ2和ERα基因下调。说明毒死蜱和百菌清对斑马鱼幼鱼具有雌激素内分泌干扰效应,但毒死蜱和百菌清二元组合对斑马鱼幼鱼的雌激素内分泌干扰效应降低。在评估农药对水生生物的危害时,应充分考虑复合污染时的联合效应。     

中国小麦花叶病毒(CWMV)侵染条件下小麦内参基因的选择

实时定量PCR(qRT-PCR)是分析功能基因表达水平的常用方法之一,qRT-PCR数据统计分析离不开合适内参基因的选择。为了选择中国小麦花叶病毒(Chinese wheat mosaic virus, CWMV)侵染条件下的小麦内参基因,本实验通过PCR扩增效率和扩增特异性分析,从10个持家基因中选择8个候选基因,然后以接种CWMV的小麦样品为材料,利用qRT-PCR技术进一步检测上述8个基因在CWMV侵染条件下小麦样品中的时空表达特性。基于这些数据,通过geNorm、NormFinder程序分析,结果表明,2个小麦基因(即26S和CDC)在CWMV侵染前后以及不同组织中表达最为稳定,26S和CDC组合可选作CWMV与小麦互作过程中功能基因表达分析的内参基因。     

小麦TaeEF1β基因的克隆、同源性及表达分析

真核翻译延伸因子(eukaryotic translation elongation factor,e EFs)是一种重要的多功能调控蛋白,eEF1β是eEF1的组成部分,在蛋白质生物合成过程中发挥着重要的作用。本文通过RT-PCR扩增克隆小麦(Triticum aestivum L.)的e EF1β基因,并命名为TaeEF1β。氨基酸同源性分析发现,TaeEF1β具有高度保守性,且其保守结构域位于137～226 aa处。q RT-PCR结果表明,中国小麦花叶病毒(Chinese wheat mosaic virus,CWMV)侵染小麦植株后,可以诱导TaeEF1β基因转录水平的上调表达。另外,本文也进一步分析了TaeEF1β基因在小麦根、茎、叶的表达水平和CWMV侵染不同时间点的表达情况。     

紫花苜蓿MsOXO基因的克隆及表达分析

草酸氧化酶(OXO)在包括核盘菌在内的多种病原体的防御和植物改良中有重大作用。以紫花苜蓿为材料,克隆得到紫花苜蓿草酸氧化酶基因MsOXO。利用烟草瞬时表达进行亚细胞定位,结果显示,MsOXO定位在细胞壁上。qRT-PCR结果显示,MsOXO在紫花苜蓿的根、茎、叶中均有表达,但在根茎中表达量较低,这可能是根颈和茎基部更易被病菌侵染的原因。外源草酸50 μmol·L^-1处理根或100 μmol·L^-1处理茎及外源水杨酸100 μmol·L^-1处理根均可以诱导MsOXO基因的上调表达。     

马齿苋-益生菌联用对热毒证小鼠腹泻的预防效果

为探讨中药马齿苋与益生菌联合应用对动物腹泻的预防作用,以马齿苋、益生菌为试验对象,将144只雄性昆明种小鼠随机分为9组,包括不同剂量马齿苋(1.0、2.5、5.0 g·kg^-1feed)组、不同剂量马齿苋(1.0、2.5、5.0 g·kg^-1 feed)+益生菌组(2×10⁶ cfu·g^-1BW·d^-1)、益生菌组(2×10⁶ cfu·g^-1BW·d^-1)、模型组和空白组。模型组和空白组小鼠喂饲普通饲料,空白组不造模;其他各组小鼠或喂饲含药饲料或/和灌胃益生菌10 d后,采用灌服干姜水提液结合腹腔注射产肠毒素大肠埃希菌(ETEC)的方法构建小鼠腹泻模型。攻菌后密切观察小鼠腹泻发生情况;试验结束时,采集小鼠血液进行生化检查,采集肠道组织进行组织病理学检查及TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、TGF-β1、IFN-γ等炎症因子表达检测。结果表明:(1)模型组小鼠在攻菌后24 h的腹泻率高达87.5%,高剂量马齿苋+益生菌组小鼠的腹泻率仅为12.5%;(2)模型组肠道组织中TNF-α、IL-1β、IL-10、IL-6、TGF-β1、IFN-γ mRNA表达量较空白组均显著升高(P<0.05),而高剂量马齿苋+益生菌组上述炎症因子的表达量较模型组均显著降低(P<0.05);(3)模型组小鼠小肠绒毛断裂、部分坏死脱落,肠腺变形明显,而高剂量马齿苋+益生菌组小鼠肠绒毛基本完整、肠道组织结构趋于正常;(4)模型组小鼠血清中Cl^-含量较空白组显著升高(P<0.05)、Ca²⁺含量则显著降低(P<0.05),而高剂量马齿苋+益生菌组小鼠血清中Cl^-较模型组显著降低(P<0.05)、Ca²⁺含量则显著升高(P<0.05);可见,高剂量马齿苋与益生菌联用能有效预防造模小鼠腹泻的发生,其机制是,通过下调肠道相关炎症因子的表达减轻肠道炎症反应,调节血液Cl^-、Ca²⁺含量恢复其电解质平衡。     

牛抵抗素对牛肺泡巨噬细胞TLR4/MyD88非依赖信号通路基因表达的影响

旨在探究牛抵抗素通过TLR4/MyD88非依赖信号通路诱发牛肺泡巨噬细胞的相关炎症反应机理。使用100 ng·mL^-1终浓度牛抵抗素诱导牛肺泡巨噬细胞,分别在0、1.5、3.0、6.0、12.0、24.0 h时采用qRT-PCR检测TLR4/MyD88非依赖信号通路相关基因(TLR4、TRAM、NF-κB)mRNA水平表达量,通过ELISA法检测下游IL-6、1L-1β、TNF-α等促炎细胞因子表达水平。结果显示,100 ng·mL^-1牛抵抗素处理牛肺泡巨噬细胞后,TLR4、TRAM、NF-κB基因表达量于6.0 h时极显著上调(P<0.01),诱导12.0 h时,相关基因表达量达到最高;IL-6、1L-1β、TNF-α等促炎细胞因子于1.5 h表达量极显著上调(P<0.01),且均存在时间依赖效应。抵抗素诱导牛肺泡巨噬细胞后,可激活TLR4/MyD88非依赖信号通路,通过信号传递,释放大量促炎细胞因子,引起肺部炎症。     

11S通过NF-κB信号通路引起猪小肠上皮细胞损伤

通过体外培养猪小肠上皮细胞(IPEC-J2),研究大豆球蛋白(11S)对猪小肠上皮细胞的影响。将IPEC-J2细胞分为6组[A(对照组)、B、C、D、E和F],各组中分别添加0、1、5、10、5、5 mg·mL^-1的11S,并且在E组和F组分别添加1 μmol·L^-1吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(PDTC)和1 μmol·mL^-1 Nω-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)。分别于8、16、24 h,用CCK-8法检测细胞存活率,用ELISA法检测细胞一氧化氮(NO)、二胺氧化酶(DAO)、5-羟色胺(5-HT)、白细胞介素6(IL-6)和白细胞介素10(IL-10)含量,用western blot法检测细胞p-NF-κB p65、iNOS、COX-2的蛋白表达量,用qPCR法检测细胞NF-κB p65、IKKβ、iNOS、IKKα、COX-2 mRNA的相对表达量。结果表明:11S可以降低猪小肠上皮细胞存活率,添加PDTC和L-NAME可以提高小肠上皮细胞存活率;11S可促进NO、DAO、5-HT和IL-6的分泌,降低IL-10的分泌,增加p-NF-κB p65、iNOS、COX-2的蛋白表达量及NF-κB p65、IKKβ、iNOS、IKKα、COX-2 mRNA的相对表达量,添加PDTC和L-NAME可抑制11S的作用。综上,11S可引起猪小肠上皮细胞损伤,随着11S浓度的增大,损伤程度增加,PDTC和L-NAME可以降低11S对细胞的损伤。     

小麦赤霉病生防菌DZSG23的抗病机制

课题组前期从健康杜仲叶片中分离得到1株内生细菌枯草芽孢杆菌DZSG23,此菌可以较好地防控小麦赤霉病。为明确芽孢杆菌DZSG23在小麦中的定殖与强化抗病机制研究,利用抗生素标记法分析了DZSG23菌体在小麦组织中的定殖情况,采用荧光定量PCR技术检测不同生育期小麦穗部PR-1、AOS、ACOI等基因的表达水平变化。结果表明,DZSG23可在苗期小麦植株和小麦穗表面稳定定殖;DZSG23浇灌接种苗期小麦后的第34天,DZSG23在苗期小麦植株的根、茎和叶中的定殖量分别达到1.437×10⁶ CFU·g^-1、3.285×10³ CFU·g^-1和2.377×10³ CFU·g^-1;DZSG23喷施小麦穗表面15 d后,穗表面菌群密度仍可达7.146×10³ CFU·g^-1。此外,诱导系统抗性(ISR)信号通路研究表明,拮抗菌DZSG23可以诱导PR-1和AOS基因的上调表达,表明拮抗菌DZSG23引入小麦后可诱导小麦的水杨酸(SA)和茉莉酸(JA)信号通路,增强其抗病性。     

β-伴大豆球蛋白通过p38/JNK MAPK信号通路引起IPEC-J2细胞损伤

采用细胞体外培养技术,研究不同浓度7S(β-伴大豆球蛋白)对IPEC-J2(猪小肠上皮细胞)的影响。实验分为6组,A(对照组)、B(1 mg·mL^-1 7S)、C(5 mg·mL^-1 7S)、D(10 mg·mL^-1 7S)、E(5 mg·mL^-1 7S+1 μmol·L^-1 SP600125)、F(5 mg·mL^-1 7S+1 μmol·L^-1 SB202190),24 h后,用CCK-8法检测细胞存活率,收集细胞用ELISA法检测NO、5-HT、IL-6和IL-10含量,用Western blot法检测p-JNK、p-p38、Bcl-2蛋白表达量,用PCR法检测Bad、Bax、Bcl-2、Bcl-x_L和Caspase-3 mRNA相对表达量。检测结果表明:C组和D组的IPEC-J2细胞活性极显著降低(P<0.01),E组和F组的细胞活性显著高于C组(P<0.05),说明7S促进炎性细胞因子NO、5-HT和IL-6的分泌,降低IL-10的分泌,添加抑制剂使细胞因子NO、5-HT和IL-6分泌减少,IL-10的分泌增多;同时7S促进p-JNK、p-p38蛋白表达,降低Bcl-2蛋白表达,添加抑制剂可抑制p-JNK、p-p38蛋白表达,使Bcl-2蛋白表达增高。Bcl-2/Bax mRNA比值随7S浓度增加而降低,Bax/Bcl-x_l比值随7S浓度增加而升高,Caspase-3 mRNA相对表达量随7S浓度增加而升高。添加抑制剂后Bcl-2/Bax比值增高,Bax/Bcl-x_l比值降低,Caspase-3 mRNA降低。结果表明,7S通过p38/JNK MAPK信号通路引起仔猪肠上皮细胞损伤。     

猪流行性腹泻病毒Nsp5基因的原核表达及生物信息学分析

旨在对猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)Nsp5基因进行原核表达,利用生物信息学软件,预测其编码蛋白的结构和功能,为了解PEDV致病机理奠定基础。本研究克隆PEDV/LY/2014/04毒株的Nsp5基因,亚克隆进pET-28a(+)原核表达载体,PCR和酶切验证重组质粒的构建,重组质粒pET-28a(+)-Nsp5转入E.coli BL21(DE3)中,SDS-PAGE检测Nsp5的表达和His band Ni+纯化情况,Vector NTI Advance等软件对Nsp5蛋白氨基酸组成、抗原表位、二级和三级结构进行预测和分析。结果表明,成功克隆并构建了重组质粒pET-28a(+)-Nsp5,表达重组蛋白大小约22 ku,且主要以包涵体形式存在,His band Ni+纯化后获得高纯度重组蛋白。Nsp5蛋白是由196个氨基酸残基组成的多肽,其分子质量的理论值为21 820.07 u,理论等电点(pI)为8.734,略偏碱;二级结构骨架中α-螺旋(h)占55.61%,β-折叠(t)占7.65%,无规则卷曲(c)占20.92%,延伸链(e)占15.82%;Nsp5蛋白质的三级结构中,中间段以α-螺旋为主作为骨架,C端多个复杂二级结构构成该蛋白的酶活性中心;B细胞抗原表位的预测,表明有15个潜在的B细胞优势表位。本研究为猪流行性腹泻病毒Nsp5蛋白质的生物学功能相关研究提供数据支持。     

苦瓜α-苦瓜素基因启动子克隆与单倍型分析

为探明α-苦瓜素基因的表达调控规律,从苦瓜种质Y5中克隆了α-苦瓜素基因上游包括起始密码子在内的1 620 bp序列,选取转录起始位点上游1 500 bp序列,利用PlantCARE在线启动子预测工具进行分析。结果表明,α-苦瓜素启动子除了含有TATA-box和CAAT-box等核心元件外,还含有光响应元件、赤霉素响应元件、热胁迫响应元件、干旱应答元件、水杨酸应答元件、茉莉酸应答元件等。以28份苦瓜种质为材料,分析了α-苦瓜素启动子区域SNP和InDel分布情况,共发现24个SNP位点和1个InDel,28份苦瓜种质资源共存在4种单倍型。3个SNP位于转录因子结合位点,可能对α-苦瓜素基因的表达调控有重要作用。     

不同水温下盐酸氯苯胍在斑点叉尾鮰血浆的药代动力学研究

研究不同水温(18、28 ℃)条件下盐酸氯苯胍(robenidine hydrochloride,ROBH)在斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)血浆的药代动力学特征。以20 mg·kg^-1体质量剂量的盐酸氯苯胍单次口灌斑点叉尾鮰,采用高效液相色谱-串联质谱法测定血浆中盐酸氯苯胍的浓度,内标法定量,并采用3p97药代动力学软件计算药代动力学参数、开展模型分析。结果表明,在不同水温条件下盐酸氯苯胍在斑点叉尾鮰血浆的药时曲线均符合二室模型特征,动力学方程分别为C_{18 ℃}=4.17e^-0.01t+2.48e^-0.008t-6.65e^-0.05t和C_{28 ℃}=7.69e^-0.02t+0.13e^-0.01t+-7.82e^-0.27t。血浆中盐酸氯苯胍达峰时间T_peak 分别为42.36和10.03 h,峰浓度值C_max分别为3.51和5.76 μg·mL^-1,表观分布容积V/F(c)分别为3.79和2.78 L·kg^-1,分布相的一级速率常数α分别为0.248和0.222 h^-1,消除相的一级速率常数β分别为0.006和0.007 h^-1,吸收半衰期T_1/2(ka)分别为14.67和2.54 h,消除半衰期T_1/2(β) 分别为85.52和58.63 h,中央室向周边室转运的一级速率常数K₁₂分别为0.000 2和0.000 2 h^-1,周边室向中央室转运的一级速率常数K₂₁分别为0.009和0.01 h^-1,药-时曲线下面积分别为554.18和326.74 μg·mL^-1·h^-1。研究结果表明,盐酸氯苯胍在斑点叉尾鮰体血浆的吸收、分布和消除受水温的影响显著,高水温条件下盐酸氯苯胍的达峰时间短,峰浓度值约是低水温时的2倍,水温对血药曲线下面积的影响较大,对肾清除率影响不大。研究结果为盐酸氯苯胍在斑点叉尾鮰养殖过程中不同季节的合理使用提供一定理论依据。     

羽衣甘蓝β-胡萝卜素羟化酶基因的克隆及表达分析

以羽衣甘蓝(Brassica oleracea L. var. acephala)为试验材料,采用同源克隆和RT-PCR技术,克隆得到羽衣甘蓝β-胡萝卜素羟化酶的cDNA全长,命名为BoBCH(GenBank登录号为MH016242)。序列分析表明,该cDNA序列长906 bp,编码301个氨基酸,分子量33.8 ku,理论等电点为9.67。保守结构域分析表明,BoBCH属于FA_hydroxylase蛋白超家族。系统发育分析结果表明,羽衣甘蓝与结球甘蓝处于同一分支,其亲缘关系最近。TMHMM和Wolf-Psort进行跨膜区分析及亚细胞定位,结果表明BoBCH蛋白有4个跨膜区域,可能定位于叶绿体中发挥作用。qRT-PCR检测结果表明,BoBCH在紫叶羽衣甘蓝DH系D07的根、茎、叶中均有表达,在叶片中表达量最高,茎次之,根中表达量最低;不同发育时期的检测结果表明,BoBCH在观赏期叶片中表达最高,在幼苗期和莲座期表达水平较低。