鸡下丘脑高丰度miR-101的组织表达谱与功能预测分析

【目的】 全面了解鸡下丘脑高丰度miR-101的组织表达情况和潜在生物学功能,为揭示下丘脑调控鸡机体能量平衡的分子机制奠定基础。【方法】 采用茎-环定量RT-PCR方法检测miR-101在固始鸡4个发育阶段、13种组织中的表达,利用Pictar算法预测miR-101的靶基因并对预测靶基因分别进行Gene Ontology分析、通路分析和分层富集。【结果】 miR-101的表达具有明显的时序特征和组织特异性,胚胎期各组织中的表达水平明显高于出壳后,脑部各组织中的表达水平明显高于其它被检测的组织,并在14胚龄下丘脑以及17胚龄小肠和腿肌中高丰度富集;miR-101的预测靶基因在生物学调节、代谢过程、发育过程和细胞过程等基本生物学过程中显著富集;针对神经系统发育的生物信息学分析显示,miR-101调控功能主要涉及脑发育、神经元分化、神经发生调节、神经胶质细胞分化和星形胶质细胞分化等生物学过程。【结论】 miR-101为脑部组织高丰度表达miRNA,在脑发育相关的许多生物学过程中可能发挥重要的调节作用。     

亚洲玉米螟miR-1a-5p表达与Cry1Ab蛋白敏感性的关系

【目的】探索亚洲玉米螟miR-1a-5p表达与Cry1Ab蛋白敏感性的关系,为揭示miRNA在昆虫Bt抗性产生过程中的作用提供依据。【方法】通过荧光定量PCR,研究亚洲玉米螟Cry1Ab抗性品系(ACB-AbR)和Bt敏感品系(ACB-BtS)表皮及中肠组织中miR-1a-5p的表达差异。以Sf9细胞为研究对象,通过转染miR-1a-5p促进剂(Mimics)或抑制剂(Inhibitor)改变细胞中miR-1a-5p的表达量,测定不同处理细胞对Cry1Ab蛋白的敏感性,探讨miR-1a-5p表达量改变后Sf9细胞对Cry1Ab蛋白的敏感性变化。通过荧光素酶报告试验,研究miR-1a-5p对潜在靶标基因Unigene12370_All的调控作用。【结果】ACB-AbR表皮组织中miR-1a-5p的表达量显著高于ACB-BtS表皮组织,ACB-AbR中肠组织中miR-1a-5p的表达量显著低于ACB-BtS中肠组织;ACB-AbR和ACB-BtS幼虫表皮组织中miR-1a-5p的表达量均显著高于其中肠组织。Sf9细胞miR-1a-5p表达量升高导致Sf9细胞对Cry1Ab蛋白的敏感性增强,反之亦然。荧光素酶报告试验结果提示,miR-1a-5p与靶标基因Unigene12370_All可以结合。【结论】亚洲玉米螟miR-1a-5p表达量的变化与其对Cry1Ab蛋白敏感性的改变有关。     

鸡miR-133a靶向调控BIRC5基因的表达

【目的】研究miR-133a在鸡不同组织中的表达情况,对baculoviral IAP repeat containing 5（BIRC5）进行靶基因的试验验证,探讨鸡miR-133a对BIRC5的靶向调控作用。【方法】采用生物信息学方法对miR-133a靶基因进行预测,并用双荧光素酶报告系统及点突变试验对BIRC5进行靶基因验证,同时运用实时荧光定量PCR检测miR-133a在鸡不同组织中的表达量。【结果】在鸡3′UTR数据库的11 891个基因中预测到287个miR-133a的靶基因;miR-133a在鸡的组织表达谱中显示其在肌肉中的表达量较高,尤其是在骨骼肌中表达量最高;报告基因试验显示BIRC5是miR-133a的靶基因,点突变试验证实了miR-133a在BIRC5上结合的靶位点。【结论】miR-133a是与鸡骨骼肌发育高度相关的miRNA,且鸡BIRC5基因是miR-133a的靶基因。     

bcl—2基因在成年和胚胎鸡免疫器官中的表达及其与细胞凋亡？…

用一步法从１７日龄来克亨ＳＰＦ鸡胚和９０日龄成年鸡的法氏囊、脾脏和胸腺组织中提取总ＲＮＡ（ＴＲＮＡ）,用鸡Ｂ－细胞淋巴瘤／白细胞病－２基因（ｂｃｌ－２）ｃＤＮＡ探针进行Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ杂交。发现ｂｃｌ－２在成年和胚胎鸡的不同免疫器官中表达量不同,成年鸡ｂｃｌ－２的表达量多少依次为胸腺、脾脏、法氏囊,而胚胎鸡则是胸腺、法氏囊、脾脏。同时用流式细胞法测定这些器官的细胞凋亡情况,胚胎鸡法氏囊、     

bcl-2基因在成年和胚胎鸡免疫器官中的表达及其与细胞凋亡的关系

用一步法从17 日龄来克亨SPF鸡胚和90 日龄成年鸡的法氏囊、脾脏和胸腺组织中提取总RNA(TRNA),用鸡B-细胞淋巴瘤/白血病-2基因 (bcl-2) cDNA探针进行Northern blot杂交。发现bcl-2 在成年和胚胎鸡的不同免疫器官中表达量不同, 成年鸡bcl-2 的表达量多少依次为胸腺、脾脏、法氏囊, 而胚胎鸡则是胸腺、法氏囊、脾脏。同时用流式细胞法测定这些器官的细胞凋亡情况, 胚胎鸡法氏囊、脾脏和胸腺的细胞凋亡率分别是0.40% , 0.68% 和0.38% ; 成年鸡则是6.98% , 1.17% 和0.61% 。结果表明, 鸡bcl-2 基因通过阻抑细胞凋亡直接调控正常免疫器官的发育, 在淋巴细胞发育过程中bcl-2是免疫细胞亚型选择的重要调节物。     

microRNA-34c在不同发育时期雄性小鼠脑组织中的表达分析

【目的】研究microRNA-34c(简称miR-34c)在出生后不同发育时期小鼠嗅球、大脑皮质、小脑皮质及海马中的表达情况,并分析其与小鼠行为活动之间的相关性。【方法】以出生后0,3,7,14,21,28,60和90d的雄性昆明小白鼠为试验动物,以5SrRNA为内参基因,运用荧光实时定量PCR技术,检测miR-34c在小鼠出生后8个不同发育时期嗅球、大脑皮质、小脑皮质和海马中的相对表达量以及在成年鼠脑组织中4个不同部位的相对表达量。【结果】随着小鼠的发育,miR-34c在嗅球、大脑皮质、小脑皮质及海马中的相对表达量均呈现不同程度的递增趋势。在成年鼠中,miR-34c在嗅球、大脑皮质、小脑皮质、海马中的相对表达量差异显著,其中海马中最高,小脑皮质次之,嗅球最低。【结论】miR-34c在出生后不同发育时期小鼠嗅球、大脑皮质、小脑皮质及海马中的表达趋势,与小鼠各种行为活动的出现具有一定的相关性。     

光照对贵州黄鸡ONECUT1基因在不同产蛋期各组织中表达的影响

【目的】分析光照对蛋鸡不同组织和不同产蛋时期ONECUT1基因的差异表达，探讨该基因对鸡产蛋性能的影响，为深入开展光照对鸡繁殖性能分子机理的研究奠定基础。【方法】选取贵州黄鸡体重相近的10周龄母鸡216只，在半舍饲养殖条件下(舍饲+运动场)随机分为自然光照组和早晚各增光1 h组，140日龄、200日龄、480日龄屠宰各4只，采集垂体、下丘脑、视网膜、输卵管和卵巢等组织，利用qRT-PCR技术检测ONECUT1基因的差异表达。【结果】ONECUT1基因在肌肉组织中表达量最高，输卵管、卵巢次之，肝脏最低。在垂体、下丘脑和卵巢组织中，ONECUT 1基因在产蛋高峰期(200日龄)的表达量显著高于开产日期(140日龄)和产蛋后期(480日龄)。垂体组织中200日龄的增光组显著高于自然光照组，输卵管中140日龄的自然光照组显著低于增光组。【结论】ONECUT1基因的表达具有时空特性，并受光照调节，与鸡产蛋性能有关。     

鸡胸腺重和脾脏重性状的全基因组关联

【目的】全基因组关联分析（genome-wide association study,GWAS）是复杂性状和疾病相关基因定位的新策略。【方法】试验利用鸡60K SNP芯片对来自50个公鸡家系的728只北京油鸡进行SNP分型检测,采用全基因组关联分析方法对影响100日龄胸腺重和脾脏重的基因进行定位研究。【结果】结果发现24个达5%全基因组水平显著的位点,与100日龄胸腺重和脾脏重显著相关,并在这些位点附近发现Janus kinase 1（JAK1）、 zinc finger DHHC-type containing 8（ZDHHC8）、vav 3 guanine nucleotide exchange factor（VAV3）、SATB homeobox 1（SATB1）等候选基因;84个与这两个性状潜在关联同时达到5%染色体水平显著的位点。【结论】利用GWAS分析策略筛选和鉴定的重要突变位点及候选基因,将为揭示鸡免疫器官发育的分子调控机制和抗病育种分子标记辅助选择提供必要的分子基础。     

大豆天冬氨酸蛋白酶基因启动子的克隆及其表达活性分析

【目的】克隆大豆天冬氨酸蛋白酶基因(soyAP1)启动子,并对其表达方式及活性进行分析。【方法】利用TAIL-PCR方法从大豆基因组DNA中克隆soyAP1基因启动子片段。利用启动子在线预测工具分析soyAP1基因启动子片段的启动子元件,并用克隆得到的SAP片段替换pCAMBIA1301中的CaMV35S启动子,构建表达载体pCAM-SAP。通过农杆菌介导法,使其在大豆各组织中进行瞬时表达,用GUS组织化学染色法分析SAP在各组织中的表达活性。【结果】克隆获得了大豆soyAP1基因的启动子片段,长1 650bp,并将之命名为SAP,其转录起始位点可能是553bp处的A;PLACE分析表明,SAP序列中含有多种典型的种子特异性表达元件;GUS组织化学染色显示,SAP驱动的GUS基因在大豆根、茎、叶中基本不表达,但在种子中有较高的表达活性,且表达强度与CaMV35S启动子相近。【结论】大豆SAP启动子可能具有种子特异表达特性。     

鸡miR-17-92基因簇上游A/T富集区启动子活性鉴定与分析

文章采用基因定点突变和报告基因技术作A/T富集区启动子鉴定和转录调控分析,研究鸡miR-17-92基因簇上游A/T富集区是否具有启动子活性。PromPredict预测分析提示miR-17-92基因簇上游-388～-444 bp处可能是启动子区域。转录因子结合位点分析发现,A/T富集区存在3个E2F1潜在结合位点,分别位于miR-17-92基因簇上游-1 273 bp(结合位点1)、-1 186 bp(结合位点2)和-753 bp(结合位点3)处。报告基因活性分析发现,鸡miR-17-92基因簇上游A/T富集区具有启动子活性,其中miR-17-92基因簇上游-440/-1区域启动子活性最强。共转染分析显示,转录因子E2F1极显著抑制该A/T富集区启动子活性(P<0.01);进一步定点突变分析表明E2F1通过E2F1结合位点1和2抑制A/T富集区启动子活性。报告基因分析发现,与对A/T富集区启动子作用不同,E2F1促进miR-17-92基因簇宿主基因(MIR17HG)启动子活性。文章首次发现鸡miR-17-92基因簇上游存在一个新的转录调控区,对揭示鸡miR-17-92基因簇转录调控具有重要意义。     

亚洲璃眼蜱不同发育阶段及其组织中microRNA-10表达分析

【目的】MicroRNA(miRNA)是一类长度为20-22个核苷酸（nt）且高度保守的非编码小RNA。迄今为止,在病毒、动物、植物中都有发现,如在Mareks病毒、果蝇、斑马鱼、人类以及拟南芥等多种生物中都有存在。其通过与靶基因特异性的碱基互补配对使靶基因降解或者受到抑制,在转录后水平调控靶基因的表达水平。miRNAs参与多种生物的细胞增殖、分化、代谢与死亡等多种生物学过程。为了解microRNA-10在亚洲璃眼蜱中的潜在生物学功能,试验获得亚洲璃眼蜱miR-10的前体、成熟体序列;分析亚洲璃眼蜱不同发育阶段及组织miR-10的表达水平,及亚洲璃眼蜱miR-10的生物学意义;为进一步研究miR-10与亚洲璃眼蜱生长发育间的关系奠定基础。【方法】用Trizol Reagent分别提取不同发育阶段及组织的总RNA,用SYBR ®Prime Script TMmiRNA RT-PCR Kit( TaKaRa Code: RR716) 制备cDNA。参考miRBase数据库中isc-miR-10（登录号：MI0012262）序列,设计特异性引物,通过PCR的方法从亚洲璃眼蜱中扩增获得miR-10前体序列,通过MEGA4软件将此前体序列与已知物种的miR-10前体序列进行比对分析;利用qPCR技术分析亚洲璃眼蜱不同发育阶段及组织miR-10的表达情况;推测miR-10在亚洲璃眼蜱中的生物学功能。【结果】获得亚洲璃眼蜱miR-10的前体序列CUACAUCUACCCUGUAGAUCCGAAUUUGUUUGCCACUAGACUACAAAUUCGGUUCUAGAGAGGCUUUGUGUGG,大小为73bp;亚洲璃眼蜱的miR-10前体序列与肩突硬蜱的相似性最高,是95.9%,且与其他节肢动物相似性在88.9%-91.7%之间;miR-10在不同物种间高度保守。miR-10的成熟体序列为UACCCUGUAGAUCCGAAUUUGU,种子序列为ACCCUGU。在亚洲璃眼蜱的不同发育阶段中,饥饿若蜱的miR-10的表达水平最高,是卵的48.3倍;饥饿成蜱是卵的7.78倍;饥饿幼蜱是卵的2.78倍。在饥饿雌性成蜱吸血过程中,吸血3d的成蜱是饥饿成蜱的约4.28倍,吸血5d的成蜱是饥饿成蜱的约0.31倍,饱血自然脱落的成蜱是饥饿成蜱的约0.087倍。吸血初期miR-10的表达量上调,随着吸血时间的延长其表达量逐渐下调;在唾液腺、气管、卵巢、表皮、中肠中miR-10的表达情况有明显不同,其中唾液腺的表达量最高,是表皮的13.2倍;卵巢的表达量是表皮的2.98倍,气管的表达量是表皮的6.46倍。【结论】从亚洲璃眼蜱中克隆miR-10序列,序列分析显示此序列在节肢动物中相对保守。miR-10在亚洲璃眼蜱不同发育阶段及不同组织的表达明显不同,表明其表达具有选择性;依据miR-10表达的差异性及已报道miR涉及的生物学功能,推测miR-10在亚洲璃眼蜱的细胞增殖、发育及吸血方面有潜在的重要作用。本研究为寄生虫miRNAs功能的研究提供一定的依据,并有可能为防控寄生虫疾病开辟新的途径。     

HMGCS1基因对猪肌肉生长发育的影响及 miRNA-18a/b对HMGCS1基因的调控

【目的】研究HMGCS1基因对猪骨骼肌生长发育的影响及其靶标的验证。【方法】采用real-time PCR对通城猪不同组织以及背最长肌不同发育时间点的HMGCS1基因的表达变化进行检测。【结果】①HMGCS1基因在成年猪肺组织中的表达量最高;②在背最长肌发育中,该基因分别在胚胎期33 和65 d高表达,出生后20、30、40和60 d低表达;③双荧光素酶试验显示,转染miR-18a/b minics组荧光素酶活性低于对照组。【结论】HMGCS1参与了猪骨骼肌生长发育过程,并受miR-18a/b的调控,是猪的产肉性状的潜在候选基因。     

牛Sry启动子调控序列的鉴定

【目的】Sry是大多数哺乳动物雄性性别发育的决定基因,但人们仍未找到其表达的调控规律,本试验对牛Sry5′端调控序列作了初步的研究,为深入研究牛Sry的表达调控奠定了基础。【方法】克隆牛Sry5′端侧翼1056bp长的DNA序列,利用生物信息学方法对这一区域内潜在的转录起始位点进行了预测,并构建了10个不同长度的缺失牛Sry5′部分侧翼序列的报告基因载体;进一步分离了胎牛生殖嵴,进行生殖嵴细胞的原代培养,并对胎牛生殖嵴细胞进行了性别和特征鉴定;最后利用荧光素酶双报告基因分析系统,在生殖嵴细胞内检测了牛Sry核心启动子区域的位置。【结果】体外培养的生殖嵴细胞可以表达雄性生殖嵴细胞的特征基因Sry、Sox9、Sf-1和Dax1,牛Sry5′端-93、-419和-722处存在3个潜在的转录起始位点(TSS),-599—-565区域35bp内存在控制Sry基础转录活性的顺式调控元件,其中存在多个潜在的转录因子结合位点。【结论】牛Sry5′端UTR区-599—-565bp区域35bp存在部分调控序列。     

Mmu-miR-34c慢病毒表达载体构建及在奶山羊雄性生殖干细胞的表达

【目的】用两种方法构建miR-34c的慢病毒表达载体,并包装成慢病毒颗粒,为经济、高效的进行miR-34c超表达提供方案,为进一步研究miR-34c的作用奠定基础。【方法】 从小鼠基因组中扩增miR-34c前体,分别插入pLL3.7的CMV启动子起始的GFP之后或U6启动子后,构建成载体pLL3.7-CMV-34c及pLL3.7-U6-34c。将重组慢病毒载体和包装质粒混合物转染包装细胞293T细胞,包装产生慢病毒颗粒,测定病毒滴度。感染293T细胞与关中奶山羊雄性生殖干细胞,用293T细胞与奶山羊雄性生殖干细胞的GFP表达程度测定转染效率,用定量PCR方法测定miR-34c的表达效率。【结果】重组质粒酶切及PCR分析及转化菌液测序,证明插入序列正确,qPCR检测显示：miR-34c的表达在慢病毒载体感染的293T细胞与关中奶山羊雄性生殖干细胞均显著上调。【结论】用 pLL3.7慢病毒载体中的CMV和U6两种启动子均可经济高效地进行miR-34c超表达,且由U6启动子启动的miR-34c慢病毒表达载体可以成功高效感染关中奶山羊雄性生殖干细胞。     

鸭CD8α基因启动子的分析及其转录活性

【目的】对鸭CD8α基因启动子活性区域进行分析,为鸭CD8α基因功能和表达调控机理研究提供依据。【方法】利用前期基因组步移技术获得的鸭CD8α基因的启动子区序列,制备一系列启动子缺失突变体（-625/-1 bp,-1 110/-1 bp,-1 413/-1 bp,-2 151/-1 bp）,定向亚克隆至荧光素酶表达载体pGL3-Basic 中,构建荧光素酶报告基因重组载体,采用 Lipofectamine 2000 将重组质粒瞬时转染DT40细胞,分析CD8α基因启动子系列缺失突变体在细胞内的转录活性。【结果】鸭CD8α基因 5′侧翼区长片段具有较强的启动子活性,-1110--625启动子活性最强,且-625--1和-625--1 110 bp区域均存在正调控元件。【结论】成功构建了荧光素酶报告基因真核表达载体,确定了鸭CD8α基因调控区,为进一步研究其转录调控机制奠定了基础。     

玉米受伤诱导基因Wip1的启动子克隆及表达分析

【目的】植物蛋白酶抑制剂是抵抗动物摄食和病原侵染的重要防御蛋白。玉米Wip1(wound-induced protein)基因属于Bowman-Birk蛋白酶抑制剂(BBI)家族,了解Wip1(wound-induced protein)的启动子活性和Wip1组织表达特性、受胁迫诱导表达情况和在不同受伤时间下的表达模式,为抗虫基因在植物中应用提供新信息。【方法】以玉米叶片组织的cDNA为模板,采用克隆测序技术获得Wip1启动子序列和该基因的cDNA序列。将所得启动子与植物表达载体p1300连接,构建重组表达载体p1300-Wip1-GUS,并采用冻融法将其转入农杆菌LBA4404中。利用农杆菌介导的瞬时表达体系在玉米愈伤组织中对Wip1启动子的表达活性进行分析。利用热酚法提取玉米相应组织的总RNA,纯化后于含甲醛的变性胶中电泳分离,并将RNA转移到尼龙膜上,用[α-32P]dCTP标记探针的Northern blot技术对Wip1在玉米不同组织、不同胁迫条件、不同受伤时间下的表达模式进行分析。【结果】获得的启动子序列全长1 737 bp,cDNA全长512 bp。将含有重组质粒p1300-Wip1-GUS的农杆菌侵染玉米愈伤组织,3 d后,GUS染色显示侵染部位变蓝,说明所克隆的启动子在玉米愈伤中能启动GUS正常表达。基于Northern blot技术的植物组织表达结果显示,正常情况下,Wip1仅在胚芽鞘中有一定的表达,在受伤后的胚芽鞘、根、茎、叶、雌穗、雄穗、花丝及苞叶中均大量表达;在所设置的胁迫处理时间(2 h)内,Wip1不受缺氧、低温、脱水、PEG、ABA、NaCL和IAA胁迫诱导,仅受伤害胁迫诱导表达;Wip1在玉米叶片受伤胁迫下,玉米叶片受伤2 h时,检测到了Wip1表达,4—24 h时表达量迅速提高且处于持续增加趋势。【结论】玉米Wip1特异地受机械伤害诱导表达;Wip1启动子是一种有效的伤害诱导特异性启动子。     

藏绵羊不同毛色皮肤组织miRNA表达谱及靶基因分析

【目的】藏绵羊又称藏系绵羊,是中国三大粗毛羊品种之一,主要分布在西藏及其毗邻的高寒牧区,如青海、甘肃、四川、云南等地。藏绵羊由于其被毛纤维粗长,毛质细腻且保暖性好,是制造藏式地毯的上好原料。而毛色作为一种重要的经济性状,同时制约羊毛的经济价值。然而,目前对于绵羊毛色的分子调控机制尚不明确,以藏绵羊为研究对象,对其不同颜色皮肤组织（黑色和白色）进行转录组测序,旨在探讨miRNA在藏绵羊不同毛色皮肤组织转录后水平中发挥的作用及其可能参与的调控通路。【方法】选取2只具有黑白花毛色的健康藏绵羊,减去体侧被毛使皮肤完全裸露并用75%酒精消毒处理,屠宰后快速切取皮肤组织并保存在组织样品保存液中防止RNA降解,提取RNA后通过miRNA测序和生物信息学分析,获得藏绵羊不同毛色（黑色和白色）皮肤组织miRNA表达谱,筛选组织差异表达miRNA并预测相关靶基因。通过靶基因分析,获得与调控藏绵羊毛色性状可能相关的信号通路。【结果】黑色和白色皮肤组织共获得85.76兆条原始读长,经过滤后得到85.08兆条clean reads;共鉴定出334个已知的miRNA和59个新的miRNA;从中获得23个差异表达miRNA,其中14个差异表达miRNA在白色皮肤组织中表达显著上调,9个表达下调。miR-2284b和miR-744仅在藏绵羊白色皮肤中表达,而miR-23b、miR-411a-5p、miR-30c、miR-423-3p和miR-324-5p则仅在藏绵羊黑色皮肤中表达,但表达量相对较低。表达量最高的miRNA为miR-10a,而倍数差异最大的为miR-23b。其中,miR-10a可参与调节多种信号通路,其作用涉及增殖、分化、凋亡、细胞粘附等各个方面,目前并无调控绵羊毛色方面的相关报道,但其功能及作用机制的研究仍在不断扩展。miR-23b则与Wnt、Notch等信号通路有关,这些信号通路中的部分基因也和黑色素的生成有密切关系。结合倍数差异和miRNA表达量分析,miR-411a-5p、miR103和miR-200b可能也和毛色调控密切相关。本研究共预测出981个靶基因可能参与毛色调控,多数基因和WNT信号通路、MAPK通路、EDNRB信号通路及黑素原生成通路（melanogenesis pathway）相关,其中黑素原生成通路显示和WNT信号通路、KIT信号通路及EDNRB信号通路相互关联。黑素原生成通路显示藏绵羊不同毛色可能最终通过MITF基因调控下游的TYR基因（酪氨酸酶基因）影响黑色素的合成。同时,筛选7个差异表达miRNA进行定量验证,结果表明,5个miRNA在黑色皮肤组织中上调表达,2个miRNA在白色组织中上调表达,定量结果与测序结果一致。【结论】获得了藏绵羊皮肤组织miRNA表达谱,并通过生物信息学分析得到可能和调控毛色性状相关的miRNA和信号通路。这些结果表明,藏绵羊毛色性状可能受到多种miRNA的调控并涉及多个信号通路,这有助于更进一步了解毛色转录后水平的调控过程,并对进一步的功能验证奠定基础。